专利名称：一种类凝血酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种蛇毒类凝血酶及其编码序列、含有该序列的重组质粒和菌株，以及由所述序列编码的类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其应用。
背景技术：
蛇毒类凝血酶主要存在于蝮亚科(和蝰科(CroiahWae)家族，是丝氨酸蛋白酶中的肽链内切酶，属于胰蛋白酶家族。主要功能是特异性的水解纤维蛋白原，释放纤维蛋白肽A (Fibrinopeptide, FPA)和B (FPB)。类凝血酶不激活凝血因子，降解纤维蛋白原产生可溶性、侧链不交联的高聚纤维蛋白肽片段，形成的(血)凝块不稳定，在体内易被网状内皮系统或正常纤溶系统清除。鉴于蛇毒类凝血酶在降解纤维蛋白原时的独特生物活性，已作为抗血栓药物用于心血管疾病和血液栓塞性疾病及术后血栓形成的预防和治疗有·多年的历史。在临床上除用于脑梗塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病及预防术后血栓再发等治疗外，对肾病、红斑狼疮、病毒性肝炎及雷诺氏病等有一定疗效。针对蛇毒类凝血酶的研究可追溯到上世纪三十年代，迄今商品化的蛇毒类凝血酶制剂有马来西亚红口蝮蛇(Xklloselasma rhodostoma )类凝血酶Ancrod (商品名Arvin )、美洲矛头峻蛇atrox类凝血酶 Batroxobin (商品名 Reptilase )、尖吻峻蛇acwiiAs)类凝血酶Acutin (商品名Defibrase )、长白山乌苏里峻蛇W1S1Stfriefl1Si1S)类凝血酶 Gussurobin (商品名 Defibrase )以及短尾峻蛇(.GloycIius知ehcawdks)类凝血酶“抗栓酶”。这些酶来源于天然蛇毒，多个因素限制了它们的规模化制备和临床应用。蛇毒含有多种毒性蛋白水解酶，影响血液循环和神经系统，即使是痕量残留都可引发副反应，严重时可致死。高纯度的蛇毒类凝血酶耗费高额分离纯化成本。此外，国家法律明确规定对稀有物种和生态资源的保护，强制禁止捕杀珍惜蛇种。综上所述，研发类凝血酶制剂的替代方案势在必行。利用生物化学与分子生物学手段生产重组蛇毒类凝血酶避免毒性蛋白水解酶杂质残留造成的风险，同时易于产品规模化和产业化，是取代天然蛇毒类凝血酶制备的有效途径。研究发现，蛇毒类凝血酶活性中心序列存在高度保守性，利用机理研究较为透彻的大肠杆菌表达体系进行闻效表达成为当如研究的重点。另外，原核体系对外源基因表达无法建立正确的链内或链间二硫键，引起外源蛋白错误折叠，致使目的蛋白活力丧失或降低。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种蛇源的类凝血酶基因(将其命名为acutobin00-14),以及将其在大肠杆菌中克隆表达,解决上述现有技术的不足,构建能够高效表达的类凝血酶重组生产菌株，实现一种蛇毒类凝血酶的产业化生产，纯化所得目的蛋白可进一步拓宽其应用范围。
由于原核体系对外源基因表达无法建立正确的链内或链间二硫键，引起外源蛋白错误折叠，致使目的蛋白活力丧失或降低。为克服这一问题，本发明采用融合硫还原蛋白基因的pET_32a质粒载体，有效维系细胞内的二硫键以此来维系细胞氧化还原状态。同时，将质粒载体携带的His标签(多位六个组氨酸残基组成的序列)与目标蛋白融合，利用该标签特异性的与二价金属离子(如镍、锌等)发生螯合作用提高纯化效率。在His标签下游与多克隆位点间，该质粒存在一个肠激酶酶切位点，通过对融合蛋白酶切，可进行初步验证。本发明的一种蛇毒类凝血酶基因，其核苷酸序列如SEQ NO. I所示，其编码的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。所述类凝血酶基因经以下步骤获得
(1)从蛇毒腺中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因； (2)将步骤(I)所得目标基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行分析比对，最终确定类凝血酶基因。将所述的类凝血酶基因克隆到pET-32a载体中，得到类凝血酶基因重组载体。将所述重组载体导入大肠杆菌，得到含有类凝血酶基因重组载体的大肠杆菌细胞。培养所述的含有类凝血酶基因重组载体的大肠杆菌细胞，通过发酵诱导其表达，产生类凝血酶。所述的类凝血酶通过硫酸铵沉降，离子交换层析和亲和层析纯化，得到纯酶形式的类凝血酶。本发明的显著优点
本发明利用基因工程手段制备能够高效表达蛇毒类凝血酶的生产株，实现蛇毒类凝血酶产业化生产,并获得优质的蛇毒类凝血酶产品。本发明方法生产成本低,且产品生物学活性高、纯度高，适用于大规模的生产应用，本发明制备的类凝血酶在医学上有广泛的应用前
旦
-5^ O
图I为源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobin00-14基因(l_403bp)与其他来源类凝血酶(28183 :acutobin00-14、AF159057 :尖吻蝮蛇类凝血酶、D67083 :赤尾鲐类凝血酶、AF395768 :福建竹叶青类凝血酶、AF056033 :亚洲蝮蛇类凝血酶、EF690365 :白唇竹叶青类凝血酶)核苷酸序列的比较；
图2为源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobin00-14基因(404-709bp)与其他来源类凝血酶(28183 :acutobin00-14、AF159057 :尖吻蝮蛇类凝血酶、D67083 :赤尾鲐类凝血酶、AF395768 :福建竹叶青类凝血酶、AF056033 :亚洲蝮蛇类凝血酶、EF690365 :白唇竹叶青类凝血酶)核苷酸序列的比较；
图3为源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobinOO-14基因类凝血酶与其他来源类凝血酶(28183 :acutobin、AF159057 :尖吻蝮蛇类凝血酶、D67083 :赤尾鲐类凝血酶、AF395768 :福建竹叶青类凝血酶、AF056033 :亚洲蝮蛇类凝血酶、EF690365 白唇竹叶青类凝血酶)氨基酸序列的比较；图4为源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobinOO-14基因类凝血酶在质粒pET32a上的重组子结构图及质粒pET-32a图谱；
图5为源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因类凝血酶在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白的SDS-PAGE 图谱；
图6为源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因类凝血酶经过硫酸铵沉降、阴离子交换层析和镍柱亲和层析纯化后目的蛋白SDS-PAGE图谱；
图7源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因类凝血酶酶活力鉴定图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例，进一步阐述本发明，但不以任何形式限制本发明。实验材料和试剂
I.菌株和载体
大肠杆菌Rosetta2 (DE3)及表达载体pET_32a购自Novagen公司；pCP2. I Vector购自 invitrogen 公司。2.酶类及其他生化试剂
限制性内切酶、DNA Maker、蛋白质Maker均购自Fermentas (MBI),其他常规试剂为上海生工或进口。3.培养基
使用的培养基LB培养基
4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]。实施例I类凝血酶基因的克隆 (I)总RNA的分离提取
Trizol Reagent,充分振勻，室温放置5min,
使其完全裂解；加入O. 2ml的氯仿振荡15s，室温放置3min ;置于高速冷冻离心机，4°C，12，000g离心15min，使溶液分层；吸取上层含RNA的水相，转移至另一离心管中(约750μ1);加入O. 5ml的异丙醇混匀(不要过于剧烈)，室温放置IOmin ;置于高速冷冻离心机，4°C, 12, OOOg离心15min ;弃上清，加入Iml的75%乙醇，温和振荡后，置于高速冷冻离心机4°〇，8，0008离心51^11 ;弃上清，并尽量控干液体，在室温中晾干5min ;加入50μ1经DEPC处理并高压灭菌的ddH20，置于50°C恒温箱中保温lOmin，使RNA充分溶解；分光光度计测定所提RNA的A260/280值，及检测其质量。(2) cDNA第一链的合成
反转录成第一链 cDNA :参照(First-straind cDNA Synthesis KIT)产品说明，
在 20μ1 体系中，加入 Mg 总 RNA、lPl Oligo dT18 (50(^g/ml)和 Rnase-free 水，在70°C水浴温育IOmin后，立即置于冰浴冷却；继续向冷却的管中加入4μ1 5XBuffer、2PlO. IM的DTT和 μ IOmM的dNTPs，混匀后于42°C水浴保温2min ;再加入Ιμ1(200υ)反转录酶，42°C继续保温50min ;最后，置于70°C水浴保温15min，灭活反转录酶，获得第一链cDNA。实验过程中设置不加RNA的阴性对照。(3) PCR获取目的基因
根据NCBI发表的蛇毒类凝血酶基因序列设计引物P1 (SEQ NO. 3)和P2 (SEQ NO. 4)，分别含有舱 和酶切位点，用于pET-32a质粒的构建；所述引物均由上海生工合成，引物序列如下
Pl:5’ GAGCTCGTCATTGGAGGTGTTGAATGTGAC 3’
P2 :5， GCGGCCGCTCATTATGGGGGGCAG 3，
本实施例PCR程序为94°C预变性101^11;941变性308，551退火308，721延伸2min,循环扩增30次；最后72°C延伸lOmin。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回 收凝胶中的目标基因。得到产物P1-P2.
(4)cDNA亚克隆
制备好的双链cDNA P1-P2插入到载体系统pCP2. I vector上，分别将连接物转入制备好的DH5a感受态细胞，涂LB平板(含lOOPg/ml氨苄青霉素)，37°C培养箱培养过夜，挑取在抗性平板上生长的阳性克隆子接入2ml LB培养基中(含lOOPg/ml氨苄青霉素)，37°C培养过夜；收集培养液，IOOOOrpm室温离心Imin收集菌体，用质粒提取试剂盒(上海生工)提取质粒；质粒分别经限制性内切酶和feci进行酶切，酶切产物经核酸电泳检测；挑取阳性克隆 PCP2.1- P1-P2 用 Pl (SEQ NO. 3 :5’ GAGCTCGTCATTGGAGGTGTTGAATGTGAC 3，)和P2 (SEQ NO. 4 :5’ GCGGCCGCTCATTATGGGGGGCAG 3’)引物进行测序(厦门英韦创津生物科技有限公司)，测序采用Sanger测序方法。pCP2. I- P1-P2 测序结果是，产物 P1-P2 大小为 71 Ibp ( SEQ NO. I),经 NCBI 比对结果显示该序列编码尖吻蝮蛇类凝血酶,将其命名为acutobin00-14，经序列分析，其中第709-711位为终止密码子TAA ;第1-708位编码成熟尖吻蝮蛇类凝血酶，共236个氨基酸(SEQ NO. 2);在从^1中查找、获取相关基因及氨基酸序列，进行多序列比对(图1-3);将acutobinOO-14氨基酸序列与台湾产的尖吻蝮蛇类凝血酶(AF159057)比对有高达99%的同源性，与赤尾鲐丝氨酸蛋白酶原和福建竹叶青丝氨酸蛋白酶原比对达86%同源性，与亚洲蝮蛇和白唇竹叶青类凝血酶蛋白酶比对达84%同源性。
实施例2 acutobinOO-14编码基因在大肠杆菌中的表达
将实施例I-(4)中所得到的质粒pCP2. 1-P1-P2 (即pCP2. I-acutobinOO-14)经似1和5^1双酶切得到acutobinOO-14片段，与经过舱(1和5^1双酶切的pET32a质粒连接，将连接物转入制备好的感受态细胞DH5a中，经蓝白斑筛选，提质粒鉴定(方法同实施例1)，得到重组质粒pET32a-acutobin00_14 (如图4所示)。取 μ 构建好的重组质粒pET32a-acutobin00_14，加入到100μ1制备好的感受态细胞(大肠杆菌Rosetta2(DE3))中，涂LB平板(含lOOPg/ml氨苄青霉素)，37 °C培养箱培养过夜，挑取在抗性平板上生长的阳性克隆子接入2ml LB培养基中(含lOOPg/ml氨苄青霉素)，37°C 250rpm振荡培养过夜，次日按1%转接至50ml LB培养液中(含10(^g/mlAmp)培养 I. 5-2h 至 OD6qq=L 0，加入 IPTG 诱导(终浓度为 lmmol/ml )，30°C 250rpm 再振荡培养3-3. 5h。取培养液IOOOOrpm离心IOmin,收集菌体,再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心lOmin,取沉淀用1/5体积pH7. O, 20mM的PBS悬浮菌体,进行超声波破碎，得到破碎液，破碎条件为60%功率,破碎2s间隔Is,历时60min。12000rpm离心，收集上清液分析表达产物的活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明acutobinOO-14基因所编码的蛋白可在大肠杆菌中表达，且有一定的类凝血酶活性。(图5)实施例3重组蛇毒类凝血酶的纯化
将实施例2所制备的破碎液经IOOOOrpm离心30min去除菌体，取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至20%，12000rpm离心30min，取沉淀，用缓冲液(Tris-HCl，pH7. 5,20mM)重新溶解。将以上溶解后的样品，经12000rpm离心15min，取上清液用阴离子交换色谱DEAE650M (Φ 1. 6 X IOOcm)分离，先用20mM PBS缓冲液ρΗ7· 5平衡柱子，然后上样，再分别用含有O. 1Μ、0. 2Μ、0. 3Μ、0. 5Μ的NaCl洗脱，流速均为O. 5 ml/min，样品用部分收集器收集。最后对收集样品测定体外类凝血酶活力，及SDS-PAGE电泳分析。取上述的目的蛋白峰样品，用镍柱亲和层析纯化。首先用O. 1M NiSO4缓冲液冲洗柱子10个床体积以上活化镍柱，然后用20mM pH8. 0,0. 5M NaCl的PBS缓冲液平衡柱子，然后样品上样，再用平衡缓冲液冲平，流速为O. 5ml/min。待冲平后，再用相同缓冲液配置的10mM、20 mM、30 mM、50 mM咪唑梯度洗脱，样液用部分收集器收集，测定体外类凝血酶活性，及SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE结果(图6)表明，重组蛇毒类凝血酶经纯化后，已达到电泳纯，其分子量约为44. 3kDa。体外类凝血酶活性从粗酶液的O. 07U/mg提高到纯酶的I. 74U/mg，纯化倍数为24. 86倍。
实施例4重组蛇毒类凝血酶的活力检测
将实施例3中得到的纯化蛋白稀释至质量浓度为lmg/mL，取该稀释后的产物1ΟΟμΙ，加入到500μ1含浓度为9mg/mL牛纤维蛋白原的Tris-HCl (20mmol/L,pH7.O)中37°C孵育lh，观察凝结现象，并以纯水代替目标蛋白作为对照组。结果(图7)表明，经纯化后的重组类凝血酶对纤维蛋白酶具有特异性，在体外降解纤维蛋白原，形成首位相连的聚合物，使得反应体系出现浑浊、沉淀，具有明显酶学活性，最终达到纤维蛋白原体外凝结。
权利要求
1.一种类凝血酶基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的一种类凝血酶基因，其特征在于所述类凝血酶基因的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
3.根据权利要求I所述的一种类凝血酶基因，其特征在于所述的类凝血酶基因来源于尖吻蝮蛇，具有凝血酶相似性质。
4.根据权利要求I所述的一种类凝血酶基因，其特征在于所述类凝血酶基因经以下步骤获得 (1)、从蛇毒腺中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因； (2)、将步骤(I)所得目标基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行分析比对，最终确定类凝血酶基因。
5.一种类凝血酶基因重组载体，其特征在于将含有如权利要求I所述的类凝血酶基因克隆到pET-32a载体中。
6.根据权利要求5所述的一种类凝血酶基因重组载体，其特征在于所述的pET-32a载体含有硫还原蛋白融合表达体系、His标签。
7.根据权利要求6所述的一种类凝血酶基因重组载体，其特征在于所述His标签下游与多克隆位点间存在一个肠激酶酶切位点。
8.—种如权利要求5所述的类凝血酶基因重组载体的应用，其特征在于将所述重组载体导入大肠杆菌，得到含有类凝血酶基因重组载体的大肠杆菌细胞。
9.根据权利要求8所述的类凝血酶基因重组载体的应用，其特征在于培养所述的含有类凝血酶基因重组载体的大肠杆菌细胞，通过发酵诱导其表达，产生类凝血酶。
10.根据权利要求9所述的类凝血酶基因重组载体的应用，其特征在于所述的类凝血酶经过硫酸铵沉降，离子交换层析和亲和层析纯化，得到纯酶形式的类凝血酶。
11.根据权利要求10所述的类凝血酶基因重组载体的应用，其特征在于所述的纯酶形式的类凝血酶包含硫还原蛋白。
全文摘要
本发明提供一种尖吻蝮蛇来源的类凝血酶基因及其应用，其目的是提供一种能在大肠杆菌中高效表达该类凝血酶的方法。本发明所提供的类凝血酶基因的核苷酸序列如SEQNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQNO.2所示；将所述的类凝血酶基因克隆到pET-32a载体上，得到的重组载体转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)中诱导表达该类凝血酶。本发明制备出能够高效表达该类凝血酶基因的重组生产株，实现类凝血酶产业化生产。
文档编号C12N15/57GK102851303SQ20121035753
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者刘树滔, 程欲, 饶平凡, 李仁宽, 郭春腾 申请人:福州大学