专利名称：利用lamp检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及ー种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒。
背景技术：
溶藻弧菌(Kzlrio alginolyticus)是ー种嗜盐性革兰氏阴性细菌,广泛分布于河口和海洋环境中，是引起鱼、虾、贝等多种海水养殖动物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起伤ロ感染、胃肠炎和败血症等症状，严重威胁着水产养殖业发展，造成的经济损失巨大。近年来，由于溶藻弧菌引起食物中毒事件的不断出现，使人们进ー步认识到了溶藻弧菌对人类的致病性和危害，也因此将其列入食源性致病菌的范畴，成为食品卫生日常监测和检疫对象。
目前，我国针对水产养殖中溶藻弧菌等细菌性致病菌的预防缺乏有效的措施，主要依赖于抗生素的广泛使用，导致了耐药菌株的出现，同时也对人类的健康构成威胁。此外，检测手段滞后，仍以传统的分离培养、生物化学反应鉴定为主，虽然检测结果准确，但是实验操作较繁琐、费时费力，一般需要5-7d完成检测，影响检测时限。因此，发展操作简便、快速准确、灵敏度高且易推广的检测方法，对溶藻弧菌进行早诊断和早预防，提高食品卫生水平，保证食品安全具有重要意义。LAMP技术是具有巨大发展潜力的ー种高新检测技术，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、检测成本低廉等优点，已在疾病诊断、物种鉴定等领域得到广泛应用。该方法的技术特点是依赖于能够特异性识别靶基因上6个特定区域的4条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶，60-65°C恒温条件下，40-60min内即可完成检测工作，伴随目标DNA的不断扩增，产生大量的LAMP副产物-焦磷酸镁白色沉淀，使反应溶液变浑浊，并以此作为直接的结果判断依据。溶藻弧菌主要有6个毒カ相关基因，即铁调蛋白基因(fur)、鞭毛蛋白基因(flaA)、胶原酶基因(valC)、碱性丝氨酸蛋白酶基因(aspA)、外膜蛋白基因(ompK和OmpW)。根据靶基因种内高度保守、种间高度特异的选择原则，经过序列BLAST比对分析，溶藻弧菌的胶原酶基因是作为检测靶基因的理想候选者。本发明选取了溶藻弧菌胶原酶基因作为靶基因，根据其保守区设定合成了 4条LAMP反应专用引物，建立了溶藻弧菌的LAMP检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种具有快速、准确、灵敏度高、特异性强、检测成本低的一种检测溶藻弧菌的LAMP引物组及其快速诊断试剂盒。本发明利用Genbank中已发布的溶藻弧菌基因组DNA序列，结合生物信息学手段，确定以溶藻弧菌胶原酶(collagenase)基因保守区序列作为检测靶序列，设计合成了 4条特异性的LAMP引物，对溶藻弧菌进行定性检测。
本发明采用以下主要技术特征
ー种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组，由外引物对和内引物对组成，
所述的外引物对为
F3 CCAGTGGCTTACTCGTTGG,
B3 TTCGCGGCCATAAACTCAT,
所述的内引物对为 FIP CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC,
BIP GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG。本发明还具有如下特点
ー种利用LAMP检测溶藻弧菌的快速诊断试剂盒，它含有如上所述的引物组、阳性对照品、LAMP反应液和DNA Polymerase聚合酶。所述的引物中外引物对和内引物对的添加摩尔比为1:4。所述的溶藻弧菌包括对溶藻弧菌标准菌株和溶藻弧菌分离菌株进行检测；
所述的LAMP反应体系为
10 X TheraoPoL Buffer5 P L
dKTP ￠2,Smwl./L)8PL
ifSQ, (lW_ol/L)4HL
1lt)FlP(40ranol/L)I^L 引物 BIP(40itrool/L)
引物 F3(10_j1/L)IiiL
引賺 3(iCta iol/L)IPL
臆漏(10麵I几)肌 Sst DNA Polymerase (8U/
IiL)IHL
細蔺基因靈DWAfl後一__— 1M.L
无菌￡离子水23 P L
LAMP反应条件65°C水浴作用45min。采用琼脂糖凝胶电泳法或浊度观察法进行检测结果的判定。利用试剂盒法提取溶藻弧菌基因组DNA，以提取的溶藻弧菌基因组DNA作为LAMP反应阳性模板。采用单因子浓度梯度实验法逐一改变LAMP反应体系中各组分浓度，以优化LAMP反应体系，并调节反应温度和作用时间，建立了 LAMP检测方法(见图I)。本发明分别以霍乱弧菌(ATCC 14035、ATCC 16112)、拟态弧菌(ATCC 33655)、副溶血性弧菌(ATCC 27968)、创伤弧菌(ATCC 27562、ATCC 33149)、溶藻弧菌(ATCC 33839、ATCC 51160)大肠埃希菌(ATCC 25922、ATCC 8739)、肠出血性大肠埃希菌 O157: H7 (ATCC35150)、产肠毒素大肠埃希菌(ATCC 35401)、阪崎肠杆菌(ATCC 51329)、福氏志贺氏菌(ATCC 12022)、金黄色葡萄球菌(ATCC 49444)、空肠弯曲菌(ATCC 33560)、单核细胞增生李斯特菌(ATCC 19111)、绵羊李斯特菌(ATCC 19119)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC 50115)、猪霍乱沙门氏菌(ATCC 10708)、嗜水气单胞菌(ATCC 7966)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC9610)、沙门氏菌分离株、副溶血性弧菌分离株、创伤弧菌分离株、溶藻弧菌分离株、肠出血性大肠埃希菌O157: H7分离株、绿脓杆菌分离株基因组DNA进行实验，以验证该方法检测的特异性。实验结果显示，本发明方法能够特异性的对溶藻弧菌标准菌株和溶藻弧菌分离菌株进行检测，引物与其他细菌无交叉反应，证明本发明方法具有高度的检测特异性。本发明将已知菌体浓度的溶藻弧菌进行10倍梯度稀释，同时制备溶藻弧菌污染食品样本，利用试剂盒法提取每个稀释梯度的基因组DNA，以此作为模板进行LAMP扩增，以确定该方法的检测灵敏度。实验结果显示，本发明方法对纯培养的溶藻弧菌的最低检出限约为9CFU/mL (见图2)，对污染食品中溶藻弧菌的最低检出限为15CFU/mL (见图3)。利用本发明方法重复20次检测同一个阳性标准品，检测结果均相同；两次(时间 间隔30天)检测同一批次阳性标准品，检测结果均相同，可见本发明方法具有良好的重复性和稳定性。应用建立的溶藻弧菌LAMP检测方法对采集的实际样本进行了检测，共检测了 192份牡蛎样本、125份生蚝样本、43份象牙蛘样本、97份螃蟹样本、172份虾样本、85份海产鱼类样本，结果共检出13份溶藻弧菌阳性样本，经检验检疫行业标准SN/T 2564-2010法验证，符合率为100%，显示本发明方法具有良好的可靠性和实用性。本发明方法与实时荧光PCR技术相比，两者具有相同的检测灵敏度(图4)，但本发明方法不需要投入昂贵的仪器设备和配备专业的检测人员，而且该方法可操作性强、快速、结果判定直观、检测成本低廉、实验装置简单，仅需要普通水浴锅或其他可以得到稳定热源的设备即可，具有广泛推广性。作为ー种经济适用的检测方法，既要保证检测的时效性，又要保证检测的准确性。LAMP技术针对靶基因序列设计的两对内外引物，可严格地识别靶序列的6个独立区域，所以LAMP反应不会受到反应物中非靶序列DNA存在的影响，增强了检测的特异性。
图I为溶藻弧菌LAMP检测方法的建立(A :浑浊度观察.I :LAMP阴性结果；2 LAMP阳性結果.B :琼脂糖凝胶电泳检测結果.M DNA marker 2000 ；1 :LAMP阳性结果；2 LAMP阴性結果)；
图2为纯培养溶藻弧菌LAMP方法检测灵敏度结果(A :琼脂糖凝胶电泳检测结果.M DNA Marker 2000 ; I 8 依次是9. 2 X 106，9. 2 X 105，9. 2 X 104，9. 2 X 103，9. 2 X 102，9. 2X101,9. 2X 10°，9. 2X10_1CFU/mL ;B :浑浊度观察結果.I 8 依次是:9. 2X106，9. 2X105，9. 2X104，9. 2X103，9. 2X102，9. 2X101,9. 2X10°,9. 2X lO^CFU/mL)；
图3为污染食品样本中溶藻弧菌LAMP方法检测灵敏度结果(A :琼脂糖凝胶电泳检测結果.M DNA Marker 2000 ; I 5 依次是:1. 5X104，1. 5X 103, 1. 5X 102，1. 5X101,!. 5X10°CFU/mL ；B:浑浊度观察結果.I 6 依次是1. 5X104，I. 5X103，I. 5X102，I. 5X101，I. 5X 10° CFU/mL,阴性对照样本)；
图4为实时荧光PCR方法检测溶藻弧菌灵敏度对照图(初始菌体浓度为9. 2X IO7CFU/mL)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进ー步的说明
I. LAMP模板的制备
參照天根TIANamp Bacteria DNA Kit说明书进行细菌基因组DNA的提取和纯化，按比例加入相应试剂
1.1取I. 5mL待检细菌增菌液,10000r/min离心lmin,弃上清,加入200 y L缓冲液GA，彻底悬浮菌体；
1.2加入20 ii L蛋白酶K (20mg/mL)，并加入220iiL缓冲液GB，充分混匀，70°C水浴作用 IOmin ；
1.3加入220 UL无水こ醇，充分混匀15s，离心5-10秒后将所得溶液(包括絮状沉淀)转移吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；
I. 4向吸附柱CB3中加入500 u L缓冲液⑶(含无水こ醇)，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；
I. 5向吸附柱CB3中加入600 u L漂洗液Pff (含无水こ醇)，12000r/min离心30s,弃去收集管中的液体；
I.6重复步骤I. 5 (向吸附柱CB3中加入600 u L漂洗液Pff (含无水こ醇)，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体)；
I.7将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min空载离心2min，室温放置2-5min，晾干残留的漂洗液；
I.8将吸附柱CB3转入新的收集管中，在加入100 u L缓冲液TE，室温放置2_5min，12000r/min离心2min,收集洗脱液。2. LAMP阳性质控标准品的制备
分析比较Genbank中公布的溶藻弧菌基因组序列，选取溶藻弧菌胶原酶(col Iagenase)基因作为检测祀基因，设定合成了引物VA-F (上游)5' -CTGAAGATTTTGAGTGTCGCG-3'和 VA-R (下游):5' -CTCGCGTTACCCGTATACTTG-3'，以提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，采用常规PCR法扩增靶基因序列，PCR反应体系(25 u L)如下
权利要求
1.一种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组，其特征在于，所述的引物组由下列外引物对和内引物对组成 所述的外引物对为F3 CCAGTGGCTTACTCGTTGG,B3 TTCGCGGCCATAAACTCAT, 所述的内引物对为FIP CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC,·BIP GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG。
2.一种利用LAMP检测溶藻弧菌的快速诊断试剂盒，其特征在于它含有权利要求I所述的引物组、阳性对照品、LAMP反应液和ifei DNA Polymerase聚合酶。
3.根据权利要求2所述的一种利用LAMP检测溶藻弧菌的快速诊断试剂盒，其特征在于所述的引物中外引物对和内引物对的添加摩尔比为1:4。
全文摘要
本发明涉及一种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组和快速诊断试剂盒，所述的引物组为F3CCAGTGGCTTACTCGTTGG，B3TTCGCGGCCATAAACTCAT，FIPCGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC，BIPGGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG；快速诊断试剂盒，它含有如上所述的引物组、阳性对照品、LAMP反应液和BstDNAPolymerase聚合酶。本发明具有可操作性强、快速、结果判定直观、检测成本低廉、实验装置简单的优点，仅需要普通水浴锅或其他可以得到稳定热源的设备即可。
文档编号C12Q1/68GK102851385SQ20121035742
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者徐义刚, 吴岩, 李丹丹, 刘忠梅, 刘新亮, 李苏龙 申请人:黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心