一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法
【专利摘要】本发明公开了一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其包括有原料预处理、破壁萃取、脂质分溶、藻油浓缩、叶绿素干燥、小球藻生长因子提取以及水解蛋白肽制备工艺步骤；本发明通过上述工艺步骤以分级制备获得粗藻油、叶绿素粗品、小球藻生长因子及水解蛋白肽等产品，且适用于中试以上级别的小球藻加工生产，甚至公斤级小批量生产以及更大规模生产；本发明实现了小球藻各个功效成分逐级制备，所获组分可进一步加工、精炼并用于下游产品开发，以实现小球藻价值最大化；本发明所采用试剂均为无毒无害、价格低廉且主要溶剂可回收重复利用；另外，本发明对所需的设备要求低，常规的植物提取设备即可满足生产需求，提取时间短，效率高，能耗低。
【专利说明】一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，具体是指，一种利用小球藻为原料并分级制备叶绿素、藻油(脂肪酸甘油酯)、小球藻生长因子、小球藻水解蛋白肽的规模化生产工艺方法。
【背景技术】
[0002]小球藻(Chlorella)是一种单细胞绿藻，常见的养殖种类有蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)等。小球藻是一种营养全面、均衡的人类食品，易被人体直接吸收和利用其，蛋白质含量高达50%以上％，氨基酸组成优于常见蛋白类食品；小球藻中叶绿素含量可高达2-4%，是叶绿素含量最高的食物；室外光照培养的小球藻中脂肪酸含量为15%左右，多糖含量为15%左右，核酸(DNA/RNA)含量在4%左右；同时，小球藻还有富含维生素、矿物质等物质，是维持和促进人体健康所不可缺少的营养素。
[0003]小球藻中叶绿素含量可高达2_4%，是叶绿素含量最高的生物之一，比螺旋藻高2-3倍，叶绿素易被人体吸收，对机体及细胞有复活作用和促进新陈代谢的功效。在药用方面，有保肝护肝、促进伤口愈合、抑制癌变、降低胆固醇、抗过敏、抑菌除臭的作用，可以治疗肝炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、口腔溃疡、急性胰腺炎、慢性肾炎等，并能促进血红蛋白的合成。
[0004]小球藻中的脂肪酸因培养方法的不同含量变化较大，室外光合培养的小球藻中含量一般在15~20%左右，其中亚油酸和亚麻酸的含量占总脂肪酸含量的50-60%左右，与大豆油相差无几，尤其是亚麻酸可占到总脂肪酸含量的35%以上，是一种优质的食用油，也可用于炼制生物柴油。
[0005]小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor, CGF),是从小球藻热水提取物中获得的一类物质，CGF中含有氨基酸、氨基肽、水溶性蛋白、结合蛋白、糖蛋白、维生素、矿物质、类谷胱甘肽物质、RNA/DNA、免疫多糖、植物激素、自然生长因子等多种物质，具有促进细胞生长、增强免疫、清除毒素、抗辐射、创伤修复、抗炎症等多种功效，是小球藻中功效最全、效价最高、经济价值最大的成份组。
[0006]小球藻的蛋白/蛋白肽易被人体直接吸收和利用(吸收率高达84%)，适合于不同人群使用，给人类提供了一个最丰富均衡的营养源。小球藻作为小球藻蛋白质含量高达50%-70%，是一种极好的蛋白源，必需氨基酸组成优于大豆、肉类、牛奶、鱼、鸡蛋等常见蛋白类食品，更符合人类的营养需求，新近的研究发现，小球藻中某些糖蛋白和多肽组分具有增强免疫、抗氧化、抑制肿瘤等活性。
[0007]小球藻多糖含量一般在15%以上，其中胞壁多糖约占干重的7%以上，主要由半乳糖和阿拉伯糖组成，其余为水溶性多糖，。研究已经证明，其在动物体内具有免疫调节(免疫增强和免疫激活)、抗炎症、中枢神经安定等功效，尤其是在免疫方面的功效尤为突出。
[0008]现有技术中的小球藻提取工艺方法或者只局限于个别物质提取，容易造成其他大量成分的浪费；或者过程繁琐、能耗物耗大、使用试剂有毒有害、规模化制备难度高。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，该规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法能够分级提取小球藻中的有效成份并使之可用于开发有价产品，以实现小球藻多元化开发利用，大大提高小球藻附加值，进而实现商业利益最大化；另外，该规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法简单、快捷、高效且适于规模化应用的。
[0010]为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
[0011]一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，包括有以下工艺步骤，具体为:
a、原料预处理:利用鲜活小球藻藻液或者小球藻干粉制备小球藻藻泥，而后将小球藻藻泥进行冰冻处理并制备成藻冰；
b、破壁萃取:将经步骤a所获得的藻冰倒入于萃取容器中，并往萃取容器内加入有机萃取溶剂，经破壁萃取后获得含有叶绿素和藻油的有机相层I以及含有小球藻破壁细胞浆的水相层1;
C、脂质分溶:往经步骤b所获得的有机相层I中加入作为萃取分溶剂的乙醇和水，经分溶后获得含有藻油的有机相层II以及含有叶绿素的水相层II ;
d、藻油浓缩:将经步骤c所获得的有机相层II进行浓缩处理并脱去其中的乙酸乙酯，即获得粗藻油产物；
e、叶绿素干燥:将经步骤c所获得的水相层II进行干燥处理，即获得小球藻叶绿素粗
品;
f、小球藻生长因子提取:往经步骤b所获得的水相层I中加水，经温浴以及固液分离依次处理后，再对固液分离后的清液进行干燥处理，即获得小球藻生长因子；
g、水解蛋白肽制备:往经步骤f固液分离后所获得的固体物质中加水并使得固体物质重新悬浮，往悬浮液中添加蛋白酶，悬浮液经温浴酶解后，再过滤除去未能酶解的残渣，经过滤所获得的清液再进行干燥处理，即获得小球藻水解蛋白肽。
[0012]其中，所述步骤a所采用的小球藻原料为鲜活小球藻藻液，在原料预处理过程中，小球藻藻液先经过离心处理而获得小球藻藻浆，小球藻藻浆再经过板框压滤处理以脱去水分，小球藻藻浆脱水后即可获得含水量为65±3%的小球藻藻泥，最后将小球藻藻泥降温至-10°C以下进行冷冻处理并制备成藻冰。
[0013]其中，所述步骤a所采用的小球藻原料为小球藻干粉，在原料预处理过程中，将小球藻干粉倒入于配料罐中并往配料罐内加水，在常温下进行搅拌处理并浸润24小时以上，而后再经过板框压滤处理以脱去水分，脱水后即可获得含水量为65±3%的小球藻藻泥，最后将小球藻藻泥降温至-1o°c以下进行冷冻处理并制备成藻冰。
[0014]其中，所述步骤b所采用的萃取容器为带有超声波装置的萃取罐，在破壁萃取过程中，藻冰倒入于萃取罐中，并往萃取罐中加入由乙酸乙酯、水所组成的有机萃取溶剂，其中，乙酸乙酯、水以及藻冰的体积比为2.4:0.6:1，超声波装置利用超声波空化作用进行细胞破壁，经搅拌静置后分层，上层为含有叶绿素和藻油的有机相层I，下层为含有小球藻破壁细胞浆的水相层I ;移去上层的有机相层I并往下层的水相层I中添加与藻冰体积相等的乙酸乙酯，经超声波破壁、搅拌静置后移去再次形成的有机相层I，重复进行上述乙酸乙酯添加、超声波破壁、搅拌静置以及移去有机相层I动作，直至有机相层I绿色不明显为止。
[0015]其中，所述步骤c中所指的有机相层I为所述步骤b所获得的各有机相层I合并，步骤c采用萃取罐为反应容器，其中，乙醇、水以及总有机相层I的体积比为1:0.1:1，搅拌静置后分层，上层为含有藻油的有机相层II，下层为含有叶绿素的水相层II;移去水相层II并保留有机相层II于萃取罐内，往萃取罐内的有机相层II内添加乙醇和水，其中，乙醇、水以及有机相层II的体积比为1:0.1:2，经搅拌静置后移去再次形成的有机相层II，重复进行上述乙醇、水添加、搅拌静置以及移去有机相层II动作，直至有机相层II绿色不明显为止。
[0016]其中，所述步骤d中所指的有机相II为所述步骤c所获得的各有机相层II合并，步骤d所采用的浓缩设备为真空干燥塔，总有机相层II倒入于真空干燥塔内，真空干燥塔经抽真空而脱去乙酸乙酯并获得粗藻油产物,其中，真空干燥塔内的真空度为0.03Mpa,温度低于50 °C。
[0017]其中，所述步骤e所采用的干燥设备为真空干燥塔和喷雾干燥塔，步骤c所获得的水相层II倒入于真空干燥塔内进行干燥处理并脱出水相层II中的乙醇，其中，真空干燥塔内的真空度为0.01Mpa，温度低于35°C;经真空干燥塔干燥处理后的剩余组分倒入于喷雾干燥塔内进行喷干处理，喷雾干燥塔内的温度为160°C _165°C，加热时间为2秒，干燥后即获得小球藻叶绿素粗品。
[0018]其中，所述步骤f采用反应釜或酶解罐为容器，将步骤b所获得的水相层I倒入于反应釜或者酶解罐内，并往反应釜或者酶解罐内加水以配置成浆液，其中，水与水相层I的体积比为1:1，在小球藻生长因子提取过程中，温浴的反应温度为45±2°C并采用离心方式实现固液分离，经固液分离 所获得的清液倒入于真空干燥塔内进行干燥处理，其中，真空干燥塔的真空度为0.01Mpa，温度为50±2°C，清液经水分脱除后即获得干粉状的小球藻生长因子。
[0019]进一步的，在小球藻生长因子提取过程中，可往水相层I与水配置而成的浆液中添加核酸酶，其中，核酸酶为脱氧核糖核酸酶(DNase)，添加量为脱氧核糖核酸酶按每升浆液加500-1000万单位，且调节浆液PH=7±1，反应时间为60-120分钟。
[0020]其中，所述步骤g采用反应釜或酶解罐为容器，在水解蛋白肽制备过程中，经步骤f固液分离后所获得固体物质倒入于反应釜或者酶解罐中并加水使得固体物质重新悬浮，悬浮液的含固率为20%，步骤g所采用的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶或者枯草杆菌蛋白酶中的一种，也可以为胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶或者枯草杆菌蛋白酶中的两种或者两种以上组合；步骤g的酶解反应时间为24-48小时，且酶解后利用中空纤维超滤系统除去未能酶解的细胞残渣，经过滤所获得的清液再利用真空干燥塔进行脱水干燥处理，其中，真空干燥塔的真空度为0.01Mpa，干燥温度为65±2°C。
[0021]进一步的，步骤g所采用的蛋白酶为木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的添加量为每升悬浮液2g，酶解24-48小时。
[0022]更进一步的，步骤g所采用的蛋白酶为胰蛋白酶，胰蛋白酶的添加量为每升悬浮液3g，酶解24-48小时。[0023]另外，步骤g所采用的蛋白酶可以为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶两种，首先将木瓜蛋白酶添加至悬浮液中，木瓜蛋白酶的添加量为每升悬浮液2g，PH=6.5±0.5，酶解温度为60 ± 5°C ;在木瓜蛋白酶酶解12-24小时以后，再添加胰蛋白酶继续对悬浮液进行酶解，胰蛋白酶的添加量为每升悬浮液3g，PH=8±0.2，酶解温度为37±0.5°C，酶解时间为12-24小时。
[0024]本发明的有益效果为:本发明所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其包括有原料预处理、破壁萃取、脂质分溶、藻油浓缩、叶绿素干燥、小球藻生长因子提取以及水解蛋白肽制备工艺步骤；通过上述工艺步骤以分级制备获得粗藻油、叶绿素粗品、小球藻生长因子及水解蛋白肽等产品，本发明能够有效地适用于中试以上级别的小球藻加工生产，且可用于公斤级小批量生产以及更大规模生产；本发明实现了小球藻各个功效成分逐级制备，所获组分可进行进一步加工、精炼并用于下游产品开发，以实现小球藻价值的最大化；本发明所采用的试剂均为无毒无害、价格低廉且主要溶剂可回收重复利用；另外，本发明对所需的设备要求低，且常规的植物提取设备即可满足生产需求，提取时间短，效率高，能耗低。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体的实施方式来对本发明进行说明，其中，本发明所指的小球藻为分类学中定义为小球藻属(Chlorella)的各个小球藻种株，且本发明所采用的设备均指中试(公斤级设备)以及中试以上规模设备。
[0026]实施例一
利用鲜活小球藻藻液进行藻冰原料制备，具体为:将培养好的小球藻藻液，经离心后，获得浓缩的小球藻藻浆，再利用板框压滤机脱除胞外水，板框压滤采用的滤布为250目，压滤完成后，获得湿藻泥，经测定，含水量约为65±3% ;将藻泥称重并分装，按每10公斤藻泥为一个包装，装入不锈钢材质的容器，在-1o°c以下的冷库中冰冻成块，作为下步提取使用。藻泥留样，_80°C冰箱保存， 利用真空冷冻干燥机(_40°C)冻干48小时后，取样测取蛋白质、脂肪酸和叶绿素a含量指标，蛋白质含量利用凯氏定氮仪测定，脂肪酸含量利用高效气相色谱测定，叶绿素a含量利用高效液相色谱测定；其中，测得每百公斤小球藻原料中，蛋白含量为59.42公斤,藻油(甘油三酯)为18.44公斤，叶绿素a为3.40公斤。
[0027]实施例二
利用小球藻干粉进行藻冰原料制备，具体为:取小球藻干粉(含水量~5%)300公斤，置于3m3的配料罐中，加入1200公斤水,在室温下，以30rpm的转速搅拌并浸润24小时,至小球藻细胞完全吸水膨胀后用板框压滤机脱除胞外水，板框压滤采用的滤布为250目，压滤完成后，获得湿藻泥，经测定，含水量为65±3% ;将藻泥称重并分装，按每10公斤藻泥为一个包装，装入不锈钢材质的容器，在-10°C以下的冷库中冰冻成块，作为下步提取使用。
[0028]实施例三
破壁萃取工序如下，具体为:利用实施例一或者实施例二的藻冰为原料，含水的小球藻细胞经冰冻后，胞内水形成冰晶后，细胞膨胀，甚至胀破胞壁，以便于破壁萃取；利用5m3的超声萃取罐(带有超声波装置的萃取罐)为破壁萃取的反应容器，加入750公斤藻冰(约750L)，1800L乙酸乙酯和450L水，此时罐中乙酸乙酯:水:藻冰(v/v/v) =2.4:0.6: 1，然后进行超声处理，超声功率为2w/cm2，超声时间为25分钟，萃取罐搅拌速率为30rpm，并控制反应温度在25°C以下；超声至15分钟时，藻冰完全融解，此时取样稀释，镜检观察，并计算小球藻细胞破壁率，超声至20分钟时，镜检观察小球藻细胞破壁已达到>95%，继续超声至25分钟，停止超声和搅拌，静置I小时以上；移去上层有机相层I后，再次加入750L乙酸乙酯，按上述条件超声5分钟后，静置I小时以上，移去有机相层I，反复此项步骤3次，此时有机相层I中绿色(叶绿素)不再明显，而后将有机相层I (乙酸乙酯层，其中含有叶绿素和藻油等脂溶性物质)合并，并收集水相层I (破壁藻浆)，分别作为下步提取的原料。
[0029]实施例四
脂质分溶工序如下，具体为:利用5m3的萃取罐为脂质分溶的反应容器，加入1600L实施例三所获得的总有机相层I (乙酸乙酯层，含叶绿素和藻油等脂溶性物质)，再加入1600L乙醇和160L水，此时罐中乙醇:水:有机相(ν/ν/ν)=1:0.1:1，搅拌转速为120rpm，搅拌15分钟，静置I小时分层，移走水相层II (含乙醇，水，叶绿素等亲水物质)，萃取罐中保留的有机相层II (含乙酸乙酯，藻油，少量叶绿素)中再加入800L乙醇以及80L水，此时萃取罐中乙醇:水:有机相层ΙΙ(ν/ν/ν)=1:0.1:2，搅拌转速为120rpm，搅拌时间为15分钟，静置I小时分层，移走水相层II，重复此步骤4次，此时有机相层II中绿色不再明显，收取有机相层II (乙酸乙酯和藻油)，合并水相层II (乙醇、水和叶绿素)，以作为下步反应的原料。
[0030]实施例五
藻油浓缩工序如下，具体为:将实施例四所获得的有机相层II，利用真空干燥塔抽真空脱去乙酸乙酯，真空度为0.03Mpa，温度控制在50°C以下，残留的物质为粗藻油；测定粗藻油中14~18C甘油三酯含量为74 .58%，根据提取原料中的藻油含量数据，计算藻油提取率为87.41% (占藻油总含量)，即每百公斤小球藻干物质可获得21.61公斤粗藻油，其中藻油净含量为16.12公斤；另外，乙酸乙酯经回收塔回收可重复利用。
[0031]实施例六
叶绿素干燥工序如下，具体为:叶绿素干燥在真空干燥塔中进行，将实施例四所获得的水相层II合并后，加入到真空干燥塔中，真空度为0.02Mpa，温度控制在35°C以下，脱除乙醇；脱除乙醇后，剩余组分(叶绿素和水)利用喷雾干燥塔进行干燥，温度为165°C，加热时间为2秒；干燥后即获得叶绿素粗品，经检测,其中叶绿素a含量为63.48%,其余为叶绿素b,β_胡萝卜素以及其他类胡萝卜素等物质，根据原料中的叶绿素a含量数据，计算叶绿素a得率为74.37%(占叶绿素总含量)，即每百公斤小球藻干物质获得3.98公斤叶绿素粗品，其中叶绿素a净含量为2.53公斤；另外，乙醇经回收塔回收，可重复使用。
[0032]实施例七
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C,搅拌转速为150rpm,提取时间为60分钟；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm，离心获得的藻渣浓浆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa,控制温度为50±2°C,干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为1.78% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子1.78公斤。
[0033]实施例八小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C,搅拌转速为150rpm,提取时间为90分钟；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm，离心获得的藻渣浓浆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa,控制温度为50±2°C,干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.15% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.15公斤。
[0034]实施例九
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为120分钟；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm，离心获得的藻渣浓浆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.18% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.18公斤。
[0035]实施例十
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为60分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为500万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm,离心获得的藻洛浓衆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.27% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.27公斤。
[0036]实施例1^一
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为90分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为500万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm,离心获得的藻洛浓衆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.38% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.38公斤。
[0037]实施例十二
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为120分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为500万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm，离心获得的藻渣浓浆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.0謹?&，控制温度为50±21:，干燥后即获得〇6?干粉；经称重计算，CGF得率为2.41% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.41公斤。
[0038]实施例十三
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为60分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为750万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm,离心获得的藻洛浓衆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.37% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.37公斤。
[0039]实施例十四
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为90分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为750万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm,离心获得的藻洛浓衆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.47% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.47公斤。
[0040]实施例十五
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为120分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为750万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm，离心获得的藻渣浓浆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.52% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.52公斤。
[0041]实施例十六
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间`为60分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为1000万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm，离心获得的藻渣浓浆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.42% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.42公斤。[0042]实施例十七
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为90分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为1000万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm，离心获得的藻渣浓浆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.53% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.53公斤。
[0043]实施例十八
小球藻生长因子(CGF)提取工序如下，具体为:以1000L反应釜为CGF提取的容器，将实施例三所获得的水相层I (破壁细胞浆)350L加入到反应釜中，并添加350L水，反应温度为45±2°C，搅拌转速为150rpm，提取时间为120分钟；其中，在提取反应时，添加脱氧核糖核酸酶，添加量为1000万单位/升反应液；反应完毕后，反应液利用碟片式离心机进行离心，离心转速>4500rpm，离心获得的藻渣浓浆作为下步水解蛋白肽制备原料；离心获取的清液，利用真空干燥塔进行干燥，真空度为0.01Mpa，控制温度为50±2°C，干燥后即获得CGF干粉；经称重计算，CGF得率为2.55% (占小球藻原料干重比)，即每百公斤小球藻干物质获得小球藻生长因子2.55公斤。
[0044]实施例十九
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iil中进打，将实施例七至十八获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的反应液，总反应体积为700L，在反应液中添加木瓜蛋白酶，添加量为2g/升悬浮液，调节pH为木瓜蛋白酶最适pH=6.5 ±0.5，酶解温度为木瓜蛋白酶的最适温度60 ± 5°C，酶解时间为24小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa,控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉(含水溶性多糖，扣除木瓜蛋白酶含量)28.12公斤，其中含蛋白多肽25.63公斤(91.15%)，多糖1.03公斤(3.66%)，其余物质(主要为水分，另有微量成分的核酸、核苷酸、矿物质等)1.46公斤(5.19%)，蛋白的酶解率(占蛋白总比率)为43.13%。[0045]实施例二十
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iil中进打，将实施例七至十八获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的反应液，总反应体积为700L，在反应液中添加木瓜蛋白酶，添加量为2g/升悬浮液，调节pH为木瓜蛋白酶最适pH=6.5 ±0.5，酶解温度为木瓜蛋白酶的最适温度60 ± 5°C，酶解时间为36小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa,控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉(含水溶性多糖，扣除木瓜蛋白酶含量)30.88公斤，其中含蛋白多肽28.37公斤(91.87%)，多糖1.06公斤(3.43%)，其余物质(主要为水分，另有微量成分的核酸、核苷酸、矿物质等)1.45公斤(4.70%)，蛋白的酶解率(占蛋白总比率)为47.74%。
[0046]实施例二^^一
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iil中进打，将实施例七至十八获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的反应液，总反应体积为700L，在反应液中添加木瓜蛋白酶，添加量为2g/升悬浮液，调节pH为木瓜蛋白酶最适pH=6.5±0.5，酶解温度为木瓜蛋白酶的最适温度60±5°C，酶解时间为48小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa,控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉(含水溶性多糖，扣除木瓜蛋白酶含量)31.05公斤，其中含蛋白多肽28.51公斤(91.82%)，多糖1.05公斤(3.38%)，其余物质(主要为水分，另有微量成分的核酸、核苷酸、矿物质等)1.49公斤(4.80%)，蛋白的酶解率(占蛋白总比率)为47.98%。
[0047]实施例二十二
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iil中进打，将实施例七至十八所获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的悬浮液，总反应体积为700L，在反应液中添加胰蛋白酶，添加量为3g/升悬浮液，调节pH为胰蛋白酶的最适pH=8±0.2，酶解温度为胰蛋白酶的最适温度37±0.5°C，酶解时间为24小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa,控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经检测，干粉中的蛋白含量为92.53%，其余7.47%为水溶性多糖；经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉29.33公斤，其中含蛋白多肽26.87公斤(91.61%)，多糖0.95公斤(3.24%)，其余物质为1.51公斤(5.15%)。蛋白的酶解率为(占总蛋白比率)45.22%。
[0048]实施例二十三
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iil中进打，将实施例七至十八所获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的悬浮液，总反应体积为700L，在反应液中添加胰蛋白酶，添加量为3g/升悬浮液，调节pH为胰蛋白酶的最适pH=8±0.2，酶解温度为胰蛋白酶的最适温度37±0.5°C，酶解时间为36小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa，控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉33.88公斤，其中含蛋白多肽31.33公斤(92.74%)，多糖0.96公斤(2.83%)，其余物质为1.59公斤(4.69%)。蛋白的酶解率为(占总蛋白比率)52.72%。
[0049]实施例二十四
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iil中进打，将实施例七至十八所获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的悬浮液，总反应体积为700L，在反应液中添加胰蛋白酶，添加量为3g/升悬浮液，调节pH为胰蛋白酶的最适pH=8±0.2，酶解温度为胰蛋白酶的最适温度37±0.5°C，酶解时间为48小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa，控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉35.55公斤，其中含蛋白多肽32.79公斤(92.24%)，多糖0.96公斤(2.83%)，其余物质为0.94公斤(2.64%)。蛋白的酶解率为(占总蛋白比率)55.18%。
[0050]实施例二十五
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iil中进打，将实施例七至十八所获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的悬浮液，总反应体积为700L。在反应液中添加木瓜蛋白酶，添加量为2g/升悬浮液，调节pH为木瓜蛋白酶最适pH=6.5 + 0.5,酶解温度为木瓜蛋白酶的最适温度60±5°C，酶解时间为12小时，反应釜搅拌转速为120rpm ;然后，往悬浮液中再添加胰蛋白酶，添加量为3g/升悬浮液，调节pH为胰蛋白酶的最适pH=8 ±0.2，酶解温度为胰蛋白酶的最适温度37 ±0.5 °C，酶解时间为12小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa，控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉50.16公斤，其中含蛋白多肽46.68公斤(93.06%)，多糖1.10公斤(2.19%)，其余物质为2.38公斤(4.74%)，蛋白的酶解率为78.56%。 [0051]实施例二十六
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iil中进打，将实施例七至十八所获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的悬浮液，总反应体积为700L。在反应液中添加木瓜蛋白酶，添加量为2g/升悬浮液，调节pH为木瓜蛋白酶最适pH=6.5±0.5，酶解温度为木瓜蛋白酶的最适温度60±5°C，酶解时间为18小时，反应釜搅拌转速为120rpm;然后，往悬浮液中再添加胰蛋白酶，添加量为3g/升悬浮液，调节pH为胰蛋白酶的最适pH=8±0.2，酶解温度为胰蛋白酶的最适温度37±0.5°C，酶解时间为18小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa，控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉53.27公斤，其中含蛋白多肽49.47公斤(92.87%)，多糖1.07公斤(2.00%)，其余物质为2.73公斤(5.12%)，蛋白的酶解率为83.25%。
[0052]实施例二十七
水解蛋白妝制备工序如下，具体为:水解蛋白妝制备在1000L酶解iip中进打,将实施例七至十八所获得的藻渣浓浆加水重新悬浮，调节至含固率为20%的悬浮液，总反应体积为700L。在反应液中添加木瓜蛋白酶，添加量为2g/升悬浮液，调节pH为木瓜蛋白酶最适pH=6.5 + 0.5,酶解温度为木瓜蛋白酶的最适温度60±5°C，酶解时间为24小时，反应釜搅拌转速为120rpm;然后，往悬浮液中再添加胰蛋白酶，添加量为3g/升悬浮液，调节pH为胰蛋白酶的最适pH=8±0.2，酶解温度为胰蛋白酶的最适温度37±0.5°C，酶解时间为24小时，反应釜搅拌转速为120rpm。酶解完毕后，利用膜孔径为0.1 μ m的中空纤维超滤系统进行超滤，过滤除去未能酶解的细胞残渣；将滤液利用真空干燥塔将清液干燥成干粉，真空度为0.01Mpa，控制温度=65±2°C，即获得水解蛋白肽干粉。经称重计算，每百公斤小球藻干物质获得水解蛋白肽干粉53.47公斤，其中含蛋白多肽49.67公斤(92.89%)，多糖1.08公斤(2.02%)，其余物质为2.72公斤(5.09%)，蛋白的酶解率为83.59%。
[0053] 以上内容仅为本发明的 较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【权利要求】
1.一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于，包括有以下工艺步骤，具体为: a、原料预处理:利用鲜活小球藻藻液或者小球藻干粉制备小球藻藻泥，而后将小球藻藻泥进行冰冻处理并制备成藻冰； b、破壁萃取:将经步骤a所获得的藻冰倒入于萃取容器中，并往萃取容器内加入有机萃取溶剂，经破壁萃取后获得含有叶绿素和藻油的有机相层I以及含有小球藻破壁细胞浆的水相层I; C、脂质分溶:往经步骤b所获得的有机相层I中加入作为萃取分溶剂的乙醇和水，经分溶后获得含有藻油的有机相层II以及含有叶绿素的水相层II ; d、藻油浓缩:将经步骤c所获得的有机相层II进行浓缩处理并脱去其中的乙酸乙酯，即获得粗藻油产物； e、叶绿素干燥:将经步骤c所获得的水相层II进行干燥处理，即获得小球藻叶绿素粗品; f、小球藻生长因子提取:往经步骤b所获得的水相层I中加水，经温浴以及固液分离依次处理后，再对固液分离后的清液进行干燥处理，即获得小球藻生长因子； g、水解蛋白肽制备:往经步骤f固液分离后所获得的固体物质中加水并使得固体物质重新悬浮，往悬浮液中添加蛋白 酶，悬浮液经温浴酶解后，再过滤除去未能酶解的残渣，经过滤所获得的清液再进行干燥处理，即获得小球藻水解蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于:所述步骤a所采用的小球藻原料为鲜活小球藻藻液，在原料预处理过程中，小球藻藻液先经过离心处理而获得小球藻藻浆，小球藻藻浆再经过板框压滤处理以脱去水分，小球藻藻浆脱水后即可获得含水量为65±3%的小球藻藻泥，最后将小球藻藻泥降温至-10°C以下进行冷冻处理并制备成藻冰。
3.根据权利要求1所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于:所述步骤a所采用的小球藻原料为小球藻干粉，在原料预处理过程中，将小球藻干粉倒入于配料罐中并往配料罐内加水，在常温下进行搅拌处理并浸润24小时以上，而后再经过板框压滤处理以脱去水分，脱水后即可获得含水量为65±3%的小球藻藻泥，最后将小球藻藻泥降温至-1o°c以下进行冷冻处理并制备成藻冰。
4.根据权利要求2或者3所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于:所述步骤b所采用的萃取容器为带有超声波装置的萃取罐，在破壁萃取过程中，藻冰倒入于萃取罐中，并往萃取罐中加入由乙酸乙酯、水所组成的有机萃取溶剂，其中，乙酸乙酯、水以及藻冰的体积比为2.4:0.6:1，超声波装置利用超声波空化作用进行细胞破壁，经搅拌静置后分层，上层为含有叶绿素和藻油的有机相层I，下层为含有小球藻破壁细胞浆的水相层I ;移去上层的有机相层I并往下层的水相层I中添加与藻冰体积相等的乙酸乙酯，经超声波破壁、搅拌静置后移去再次形成的有机相层I，重复进行上述乙酸乙酯添加、超声波破壁、搅拌静置以及移去有机相层I动作，直至有机相层I绿色不明显为止。
5.根据权利要求4所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于:所述步骤c中所指的有机相层I为所述步骤b所获得的各有机相层I合并，步骤c采用萃取罐为反应容器，其中，乙醇、水以及总有机相层I的体积比为1:0.1:1，搅拌静置后分层，上层为含有藻油的有机相层II，下层为含有叶绿素的水相层II;移去水相层II并保留有机相层II于萃取罐内，往萃取罐内的有机相层II内添加乙醇和水，其中，乙醇、水以及有机相层II的体积比为1:0.1:2，经搅拌静置后移去再次形成的有机相层II，重复进行上述乙醇、水添加、搅拌静置以及移去有机相层II动作，直至有机相层II绿色不明显为止。
6.根据权利要求5所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于:所述步骤d中所指的有机相II为所述步骤c所获得的各有机相层II合并，步骤d所采用的浓缩设备为真空干燥塔，总有机相层II倒入于真空干燥塔内，真空干燥塔经抽真空而脱去乙酸乙酯并获得粗藻油产物，其中，真空干燥塔内的真空度为0.03Mpa，温度低于50。。。
7.根据权利要求6所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于:所述步骤e所采用的干燥设备为真空干燥塔和喷雾干燥塔，步骤c所获得的水相层II倒入于真空干燥塔内进行干燥处理并脱出水相层II中的乙醇，其中，真空干燥塔内的真空度为0.01Mpa，温度低于35°C;经真空干燥塔干燥处理后的剩余组分倒入于喷雾干燥塔内进行喷干处理，喷雾干燥塔内的温度为160°C _165°C，加热时间为2秒，干燥后即获得小球藻叶绿素粗品。
8.根据权利要求7所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于:所述步骤f采用反应釜或酶解罐为容器，将步骤b所获得的水相层I倒入于反应釜或者酶解罐内，并往反应釜或者酶解罐内加水以配置成浆液，其中，水与水相层I的体积比为1:1，在小球藻生长因子提取过程中，温浴的反应温度为45±2°C并采用离心方式实现固液分离，经固液分离所获得的清液倒入于真空干燥塔内进行干燥处理，其中，真空干燥塔的真空度为0.01Mpa，温度 为50±2°C，清液经水分脱除后即获得干粉状的小球藻生长因子。
9.根据权利要求8所述的一种规模化分级制备小球藻活性组分的工艺方法，其特征在于:所述步骤g采用反应釜或酶解罐为容器，在水解蛋白肽制备过程中，经步骤f固液分离后所获得固体物质倒入于反应釜或者酶解罐中并加水使得固体物质重新悬浮，悬浮液的含固率为20%，步骤g所采用的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶或者枯草杆菌蛋白酶中的一种，也可以为胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶或者枯草杆菌蛋白酶中的两种或者两种以上组合；步骤g的酶解反应时间为24-48小时，且酶解后利用中空纤维超滤系统除去未能酶解的细胞残渣，经过滤所获得的清液再利用真空干燥塔进行脱水干燥处理，其中，真空干燥塔的真空度为0.01Mpa,干燥温度为65±2°C。
【文档编号】C12R1/89GK103740794SQ201410006094
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】俞建中 申请人:东莞市绿安奇生物工程有限公司