在d乳酸生产中有缺陷以及具有改善的免疫特征的约氏乳杆菌菌株cncm i-1225的天然衍生物的制作方法
【专利摘要】概括地本发明涉及益生菌细菌领域。特别地，本发明涉及具有改善性质的约氏乳杆菌菌株CNCM?I-1225的天然衍生物。例如，本发明涉及在D-乳酸生产中有缺陷、并进一步地表现改善的免疫特征(profile)的约氏乳杆菌菌株CNCM?I-1225的天然衍生物。
【专利说明】在D乳酸生产中有缺陷以及具有改善的免疫特征的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物
[0001]概括地本发明涉及益生菌领域。特别地，本发明涉及具有改善特性的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)株CNCM 1-1225的天然衍生物。例如,本发明涉及在D-乳酸生产中有缺陷、并进一步地表现改善的免疫特征(profile)的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0002]一种人分离物，约氏乳杆菌CNCM 1-1225，也称为约氏乳杆菌NCC533，或称为约氏乳杆菌 Lil,或称为嗜酸乳杆菌 Lai, (Bernet-Camard, M.F.，等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63，2747-2753)，是益生菌，目前以Lcl商标非常成功地在商业上销售。
[0003]约氏乳杆菌CNCM 1-1225有一些被文献充分证明的健康益处，其中，例如对免疫调节的活性(Haller, D.，等人，2000，Infect.1mmun.68:752-759 ；Haller, D.，等人，2000，Gut47:79-87 ;或 Ibnou-Zekri, N.,等人,2003, Infect.Tmmun.71:428-436),或病原体抑制(Bernet, M.F.，等人，1994，Gut, 35 =483-489)，且其具有长的安全使用历史。
[0004]在炎症和感染的情况下，肠道微生物群通常失去天然平衡。益生菌阻碍炎症过程、稳定肠道微生物环境。益生菌还稳定肠道屏蔽功能。通过这些功能，其有助于防止许多炎症性疾病，例如炎症性肠病，该疾病每年影响大约600，000美国人。
[0005]因而，尽管约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225具有优越的免疫调节特性，仍然需要可用的具有相同免疫调节特性(例如粘膜中的稳态)，但比约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225更好地抗炎症的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的变体。
[0006]限制约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225在一些产品种类(例如，企图用于小孩和婴儿的产品)中应用的一个方面是产生了占主导地位的来自糖类发酵的D-乳酸异构体。例如，如果在MRS培养基中生长，约氏乳杆菌CNCM 1-1225以60:40%的比率将乳糖发酵为D-和L-乳酸。
[0007]CODEX婴儿配方指导不推荐小于3岁的婴儿消耗D-乳酸和产生D-乳酸的细菌，理由是其有限的D-乳酸清除可导致D-乳酸中毒。
[0008]支持这一结论的证据是有限的，主要基于食品中存在的D-乳酸，而不是基于施用生产D-乳酸的细菌，其是胃肠道的天然菌群。
[0009]因而，一些报道挑战了此观点(Connolly，E.等人，NTRAfoods3(3)，37-49.2004 ；Haschke-Becher, E.，等人，2008, Ann.Nutr.Metab.53:240-244, Mack, D.R., 2004, Can.J.Gastroenterol.18:671-675)但是到目前为止CODEX婴儿配方指导的建议并没有改变。
[0010]CODEX基本上排除了产生D-乳酸的益生菌作为婴儿配方中的补充剂但是鼓励仅产生L-乳酸的遗传改造的菌株。该开发的一个例子是生成遗传修饰的生物体(GMO)，特别是遗传修饰的约氏乳杆菌菌株，其中分离d-乳酸脱氢酶(D-LDH)基因(IdhD)，并通过基因置换使用体外截短的IdhD基因克隆拷贝失活基因组拷贝(Lapierre，L.，等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:4002-4007)。
[0011]仅仅为了实验室的目的生产该基因工程的菌株，其从未被用于食品生产中，因为其遗传物质被使用重组DNA 技术改变了，因而该菌株被认为是GM0。[0012]但是，获得允许个体也能够获得约氏乳杆菌菌株CNCM-1225的许多健康益处的这一可能性将是所需的，因为D-乳酸或产生D-乳酸的细菌的消耗目前是不建议的。
[0013]因而，在本领域中强烈需要天然益生菌株，特别是约氏乳杆菌菌株CNCM-1225的天然衍生物，其在D-乳酸生产是缺陷的，但是有活力的，并表现了改善的抗炎症特性。
[0014]本发明的发明人满足了这一需要。 [0015]因而，本发明的目标是为本领域提供一种约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物，其可用于针对婴儿和小孩的产品并同时尊重CODEX婴儿配方指导的现行规定，其表现了改善的抗炎症特性，且其是天然的，并不被认为是GM0。
[0016]本发明人令人惊奇地发现其能够实现独立权利要求主旨所要求的本发明的目标。从属权利要求进一步地发展了本发明的想法。
[0017]本发明人研究了分离天然(非GM0)、有活力、遗传稳定的约氏乳杆菌Lal的变体的可行性，该菌株仅产生L-乳酸，且具有改善的储存稳定性，并具有改善的抗炎症特性。
[0018]基因组序列的改变天然地发生，例如，由于受损DNA的错误修复、或DNA复制中的错误，其具有相对低的频率。
[0019]为了检索此种约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，本发明的发明人筛选了大约21，000个约氏乳杆菌CNCM 1-1225的菌落，鉴定了一个天然缺乏D-乳酸的变体，其实现了本发明的目标。
[0020]本发明人进一步地确定了 MRS培养物上清中D-和L-乳酸的浓度，表明与培养物上清中总乳酸浓度相比，相对的D-乳酸浓度低于1.5% ;即大约1.0%。
[0021]DNA序列分析鉴定了乳酸脱氢酶基因中改变酶的氨基酸序列、进而改变其催化特性的主要的点突变。
[0022]经证明天然衍生物是有活力且稳定的，没有恢复生产D-乳酸的例子。
[0023]为了评估约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225天然衍生物的抗炎症特性，本发明人确定了与约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225接触时人PBMC的细胞因子分泌分布图，并将其与约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物接触时人PBMC的细胞因子分泌分布图进行了比较。
[0024]发现约氏乳杆菌CNCM1-1225的天然衍生物比约氏乳杆菌CNCM 1-1225诱导较少的促炎症细胞因子(IFN和IL-12p40)，而诱导的IL-10 (抗炎性细胞因子)没有改变。
[0025]因而，本发明的一个实施方式是约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物在D-乳酸生产中有缺陷，比约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225诱导更少的通过外周血单核细胞分泌的I型T辅助性细胞因子。
[0026]据本发明人所尽知的，这是第一次提供约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，该天然衍生物在D-乳酸生产中有缺陷，并表现比约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225改善的抗炎症性能。
[0027]“D-乳酸生产中有缺陷”指为了本发明的目的，与全部乳酸产量相比，菌株生产小于5%、优选小于2%、甚至更优选小于1.5%、理想地大约1.1 %的D-乳酸。可在不含细胞的培养物上清中测量D-和L-乳酸浓度。
[0028]由约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225天然衍生物产生的乳酸的全部产量最初涉及细胞生长。当细胞进入静止期并停止分裂时，他们继续代谢糖产生更多的乳酸。但是，发现产生的D-和L-乳酸的比率是恒定的。[0029]约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的“天然”衍生物指不被认为是GMO的菌株。此类天然衍生物可以通过，例如，筛选基因组序列中遭受天然发生的改变的菌落而获得，例如，所述改变由于受损DNA错误的修复或DNA复制中的错误造成的。此天然发生的错误可通过使菌落遭受压力条件而增加，例如，通过甲基磺酸乙酯(EMS)的使用。
[0030]为了本申请的目的，术语“GM0”应当根据关于遗传修饰的生物体的有意环境释放和废止理事会90/220/EEC指令的2001年3月12日的欧洲议会和理事会2001/18/EC指令定义。因而，“遗传修饰的生物体”指除人外的生物体，其中遗传物质以非天然发生的方式被改变，天然发生的方式指通过交配和/或天然重组的方式。
[0031]在该定义的术语中，遗传修饰至少通过使用如下发生
[0032](I)重组核酸技术，其包括遗传物质新组合的形成，其通过如下实现:将通过任何方式在生物体外生产的核酸分子插入至任何病毒、细菌质粒或其它载体系统，将其整合至宿主生物体，所述宿主生物体中该核酸分子并非天然发生，但是其能够在该宿主生物体内繁殖；
[0033](2)包括将生物体外制备的可遗传物质直接导入生物体的技术，包括显微注射法、巨量注射法(macroinjection)和微胶囊法；或
[0034](3)细胞融合(包括原生质的融合)或杂交技术，其中通过非天然发生的方法通过使两个或两个以上细胞融合形成具有可遗传的遗传物质新组合的活细胞。
[0035]如果其具有至少99.95%的核酸同一性，例如至少99.99%，优选至少99.995%的核酸同一性，则认为该菌 株是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的“衍生物”。例如，与约氏乳杆菌CNCM 1-1225相比，如果一个菌株具有不超过500个，例如不超过100个，优选不超过50个核酸改变，则认为该菌株是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物。
[0036]评估由外周血单核细胞分泌的I型T辅助性细胞因子的诱导是本领域技术人员公知的标准方法，公开于例如Miettinen, M.,等人，1998, Infection andImmunity66:6058-6062。例如可依据实施例6描述的方法。
[0037]本发明人发现本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物在负责D-乳酸缺陷表现型的d-ldh基因中显示突变。
[0038]因而，约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可能具有改变的D-乳酸脱氢酶的序列。例如，约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以在氨基酸位点260包括天冬氨酸到天冬酰胺的氨基酸改变。
[0039]这样的改变显然显著地改变了 D-乳酸脱氢酶的酶功能，因而产生了非常少的D-乳酸或不产生D-乳酸。
[0040]D-乳酸脱氢酶酶蛋白质序列中这样的改变是基于D-乳酸脱氢酶基因中核酸序列的改变。
[0041]使获得的酶失活的D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列中的任何天然改变可以实现本发明的主旨。而且，野生型序列中一个或多个后继核苷酸、或D-乳酸脱氢酶基因的部分或全部的至少一个缺失，可以实现本发明的主旨。
[0042]本发明人分析了本发明的约氏乳杆菌CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列。
[0043]因而，本发明还涉及约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中在约氏乳杆菌CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列包括核酸位点820上G至A的转换。
[0044]尽管这样的导致D-乳酸脱氢酶失活的改变在自然界可以以较低的频率自发地发生，其是随机的、且可以以相同的频率被修复回亲本序列(野生型)。
[0045]如果失活的基因给予变体生长不利，则该修复的频率甚至可以更高。考虑到从培养物收集到最终产物有相当数量的传代，该改变稳定是非常重要的，当是单个碱基对的改变时尤其重要，因为单个碱基对改变比缺失在遗传上更不稳定。 [0046]有利地，还发现该改变是稳定的。
[0047]详细地分离、纯化并表征了实现本发明目标的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的一个例子。
[0048]因而，本发明涉及约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以是约氏乳杆菌CNCM 1-4435。
[0049]根据布达佩斯条约，约氏乳杆菌CNCM 1-4435于2011年2月8日，保藏于法国国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismses (CNCM),Institut Pasteur,25Rue du Docteur Roux, F_75724Paris Cedexl5, France)。
[0050]该菌株被完整测序。
[0051]根据布达佩斯条约，约氏乳杆菌CNCM 1-1225保藏于1992年6月30日，保藏在CNCM。
[0052]约氏乳杆菌CNCM 1-4435 一共含有17个核苷酸改变，包括预期的负责该菌株生产D-乳酸缺陷的D乳酸脱氢酶基因中的改变。在两个基因中有改变，预期这两个基因的功能对生长是重要的，即，LJO135-天冬酰胺合成酶和LJ0354b-50S核糖体蛋白L30。正如由约氏乳杆菌CNCM 1-4435以与Lal相似的速率在MRS肉汤中生长、且在MRS和工业培养基中实现相似的最终CFU所确认的，个别的改变以及组合的改变对生长没有显著的副作用。需要注意的是LJ-0859-半乳糖激酶，一个半乳糖发酵操纵子中的基因/酶。该改变位于半乳糖激酶保守结构域之外，但似乎降低酶活性，因为约氏乳杆菌CNCM 1-4435表现出降低的半乳糖发酵。约氏乳杆菌菌株CNCM 1-4435是受关注的。因为其含有非常少的次级核苷酸改变，该改变导致具有改变序列的12个蛋白质。
[0053]本发明还延伸至根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物以生物纯的培养物形式存在。
[0054]根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以根据任何适当的方法培养，除本发明的组合物外，例如还可以通过冷冻干燥或喷雾干燥制备。
[0055]益生菌株约氏乳杆菌CNCM 1-1225提供了许多大量文献记载的健康益处，其中的一些已在上文描述。
[0056]“益生菌”指微生物细胞制剂或微生物细胞组分，其对宿主的健康或康乐具有有益的作用(Salminen S 等人“Probiotics:how should they be defined，，Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0057]考虑到所提供的健康益处，根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物基本上可以被认为是生物等效性的。
[0058]科学工作已经表明从约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的生物纯的培养物分离的不含细胞的培养物上清也具有一些健康益处(参见，例如，Bernet-Camard, M.-F.，等人，1997，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, p.2747-2753)。
[0059]因而，本发明进一步扩展至不含细胞的培养物上清，其分离自根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的生物纯的培养物。
[0060]由于约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和本发明的不含细胞的培养物上清具有许多健康益处，其可被由于治疗或预防人或动物体中的疾病。
[0061]因而，本发明涉及包括根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或不含细胞的培养物上清的组合物，用于制备用于通过疗法治疗人或动物体的方法中的组合物。
[0062]本发明还涉及包含根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或不含细胞的培养物上清的组合物在用于制备药物组合物或药物中的用途。
[0063]广泛研究了约氏乳杆菌CNCM 1-1225的益生菌相关的活性，包括免疫调节(Haller, D.，等人，2000，Infect.1mmun.68，752-759 ；Haller, D.，等人，2000，Gut47，79-87 ；Ibnou-Zekri, N.，等人.，2003, Infect.Tmmun.71,428-436)，病原体抑制(Bernet, M.F.,等人，1994，Gut35，483-489)，和上皮细胞附着(Neeser, J.R.，等人，2000，GlycobiologylO,1193-1199 ；Granato, D.，等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65，1071-1077)。
[0064]由于生物等效性，根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或其不含细胞的培养物上清 提供相同的健康益处。
[0065]因而，本发明涉及包含根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或其不含细胞的培养物上清的组合物，用于治疗或预防与衰弱的免疫系统相关的疾病。
[0066]本发明还涉及根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或不含细胞的培养物上清在制备用于治疗或预防与衰弱的免疫系统相关的疾病的组合物中的用途。
[0067]衰弱的免疫系统相关的疾病是本领域公知的，本领域技术人员将理解哪些疾病与衰弱的免疫系统相关。
[0068]衰弱的免疫系统相关的疾病的典型实例可以选自流感、鼻炎、普通感冒及其组合。
[0069]包括根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或不含细胞的培养物上清的组合物还可以用于治疗或预防与肠毒性细菌或病毒的细胞附着和细胞侵入有关的疾病。
[0070]本发明还扩展至根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或不含细胞的培养物上清在制备用于治疗或预防与肠毒性细菌或病毒的细胞附着和细胞侵入有关的疾病的组合物中的用途。
[0071]肠毒性细菌和病毒是本领域公知的。欧洲食品安全管理局(EFSA)在2010年11月公布了这样的病原体的列表。
[0072]例如，肠毒性细菌或病毒种可以选自沙门氏菌属(Salmonella);弯曲杆菌属(Campylobacter);李斯特菌属(Listeria);大肠杆菌菌株，如 ETEC, EHEC, EPEC 或 EIEC菌株；如耶尔森氏菌属(Yersinia);志贺氏菌属(Shigella);产毒素细菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),肉毒杆菌(Clostridium botulinum),或腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus), Vibrio vulnifucus/溶血性弧菌(parahaemoIyticus);轮状病毒；诺沃克病毒(norovirus);产vero毒素的大肠杆菌(verotoxigenic E.coli);阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii);产毒产气荚膜梭菌(toxigenic C.perfringens) (A,B型)；食源性寄生虫，如棘球属(Echinococcus),弓形虫属(Toxoplasma),或贾第虫属(Giardia);幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori);艰难梭菌(Clostridium difficile)；破伤风梭菌(Clostridium tetani);或它们的组合。
[0073]对本领域技术人员很明显，哪些疾病与何种肠毒性细菌或病毒种相关。
[0074]例如，与肠毒性细菌或病毒种的细胞附着和细胞侵入有关的疾病可以选自下呼吸道感染、胃肠道感染、中耳炎、以及其组合。
[0075]本发明的组合物可以是适于向人或动物施用的任何种类的组合物。 [0076]本发明的组合物特别地可以是口服、肠道内、胃肠外或局部施用。组合物可以以适用于所选择的施用模式的任何盖伦形式提供。
[0077]本发明的组合物可以施用到任何年龄组。
[0078]优选地，本发明的组合物在寒冷的季节施用，例如从秋季到春季施用。
[0079]其也可以在任何时间施用。优选在早晨施用本发明的组合物，例如，以加强一天的免疫系统。
[0080]例如，组合物可以选自食品组合物、宠物食品组合物、饮料、乳制品、营养配方、婴儿配方、食品添加剂、营养食品(nutraceutical)、药物组合物、食品成分和/或化妆品组合物。
[0081 ] 例如，组合物可以选自酸化的乳制品，例如酸奶或酸奶饮品；或基于乳类的粉末。
[0082]如果以耐储存的粉末形式提供组合物，其是特别优选的，特别是对于粉末制品。为了获得耐储存并保证益生菌的活力，可以提供含有小于0.2 (例如在0.19-0.05的范围内)，优选小于0.15的水活度的组合物。水活度或&￥是系统中水的能量状态的测量。其被定义为来自粉末/产品的水的蒸汽压除以相同温度下纯水的蒸汽压；因而，纯净水的水活度恰好为I。
[0083]本发明的组合物可以是清洁、防护、治疗或护理霜、护肤乳液、凝胶或泡沫、例如进行清洁或消毒洗液、沐浴组合物或除臭剂组合物。
[0084]至于更具体地用于外部局部施用的组合物，它们可以是水性、水-醇或油性溶液，洗剂或浆液型的溶液或分散液，液体或半液体稠度的乳剂，乳类型的，其通过以下方式获得:在水相中分散脂相(0/W)，或反之亦然(W/0)，或软质、半固体或固体稠度的悬浮剂或乳齐?，霜型的，含水或无水凝胶，微乳剂，微胶囊，微粒，或者离子和/或非离子型的囊泡分散体。
[0085]有利地，根据本发明的局部用组合物可方便地配制成适合于护发的任何盖伦形式，特别是配制成以下形式:美发乳，洗发水，特别是去头屑洗发水，护发素，柔顺液(detangler),发乳或凝胶,造型光漆,定型洗液，护理洗液，染料组合物(特别是用于氧化染色的)任选地以着色洗发水的形式，毛发重组洗剂，持久烫发组合物，用于防治脱发的洗剂或凝胶，抗寄生虫的洗发水或药用洗发水，尤其是抗皮脂溢的洗发水，头皮护理产品，尤其是抗刺激，抗老化或重组，或激活血液循环的。
[0086]当本发明的组合物是乳剂时，脂相的比例可以是相对组合物的总重量，5%至80%的重量比的比例范围，优选10%至50%的重量比。在乳剂形式的组合物中使用的油、乳化剂和助乳化剂选自化妆品和/或皮肤病学领域中常规使用的那些。在组合物中，乳化剂和助乳化剂可以以相对于组合物总重量的0.3%至30%的重量比的比例范围，优选0.5%至20%的重量比的比例范围存在。
[0087]当本发明的组合物是油性凝胶或溶液时，脂相可代表大于90%的组合物总重量。
[0088]局部施用的盖伦形式还可以包括习惯地用于化妆品、药物和/或皮肤病学领域的佐剂，例如，亲水性或亲脂性胶凝剂，亲水性或亲脂性活性剂，防腐剂，抗氧化剂，溶剂，芳香剂，填充剂，掩盖剂(screens)、气味吸收剂和着色剂。这些各种佐剂的含量是在考虑的领域中常用的那些，并且例如是组合物总重量的0.01%至20%。根据其性质，这些佐剂可以被引入脂相和/或引入水相。
[0089]作为可用于本发明的脂质，可以提及的是矿物油，例如，氢化聚异丁烯和液体凡士林，植物油，例如，乳木果油(shea butter)的液体馏分、葵花子油和杏仁油，动物油，例如，角S烧(perhydrosqualene)、合成油、特别是百洛油(Purcellin oil)、肉豆蘧酸异丙酯和棕榈酸乙基己酯，不饱和脂肪酸和氟油，例如，全氟聚醚(perfluoropolyether)。也可以使用脂肪醇，脂肪酸，例如，硬脂酸，例如蜡，特别是石蜡，巴西棕榈蜡和蜂蜡。同时还可以使用硅氧烷化合物,如硅油，例如，环聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷,和硅蜡(siliconewax),树脂和树胶。
[0090]作为可用于本发明的乳化剂，可以提及的例如是硬脂酸甘油酯，聚山梨醇酯60，由汉高(Henkel)公司以名称SilinowaxAO?出售的含33mol环氧乙烧的鲸蜡硬脂醇/氧乙烯化的嫁腊硬脂醇(cety lstearyl alcohol/oxyethylenated cetylstearyl alcohol)混合物，由Gattefosse公司以Tefose? 63名称出售的PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯混合物，PPG-3肉豆蘧基醚，硅酮乳化剂，如鲸蜡基聚二甲基硅氧烷共聚醇，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯或三硬脂酸酯，PEG-40硬脂酸或氧乙烯化脱水山梨醇单硬脂酸酯(oxyethylenatedsorbitan monostearate,20E0)。
[0091]作为可以使用在本发明中的溶剂，可以提及的是低级醇，特别是乙醇，异丙醇和丙二醇。
[0092]本发明的组合物，也可有利地包含泉水和/或矿物水，特别是选自Vittel水，来自维希盆地的水，和la Roche Posay水。
[0093]作为亲水性胶凝剂，可以提及的是羧基聚合物，如卡波姆，丙烯酸类共聚物，例如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚物，聚丙烯酰胺，尤其是聚丙烯酰胺的混合物，C13-14异链烷烃和由SEPPIC公司以Sepige丨305?名称出售的Laureth-7,多糖，例如衍生物，例如羟烷
基纤维素，特别是羟丙基纤维素和羟乙基纤维素，天然树胶如瓜尔豆胶，槐豆胶，角豆胶，黄原胶，和粘土。
[0094]作为亲脂性胶凝剂，可以提及的是改性粘土，如膨润土，脂肪酸的金属盐，如硬脂酸铝和疏水性二氧化硅，或者是乙基纤维素和聚乙烯。
[0095]根据本发明的组合物也可以是构成清洁皂或清洁皂块固体制剂。
[0096]它们也可能以溶液，乳膏，凝胶，乳剂或摩丝的形式，或者可选地以在压力下还含有推进剂的气溶胶组合物的形式被用于头皮。[0097]在根据本发明的用于口服给药的口服使用的情况下，优选使用可吸收的支持物或载体。可吸收的支持物或载体可以是不同性质的，这取决于所考虑的组合物类型。
[0098]乳类，酸奶，奶酪，发酵乳，基于乳类的发酵制品，冰淇淋，基于谷物的产品或发酵的基于谷物的产品，早餐谷物，麦片或谷麦棒(granola bar)，基于乳类的粉末，婴儿和婴儿配方奶粉，糖果类食品，巧克力或谷物类，动物饲料(特别是用于家畜的)，片剂，胶囊或锭剂，液体细菌悬浮液，干燥形式的口服补充剂和液体形式的口服补充剂，特别适合于用作可吸收的支持物或载体。 [0099]将口服施用的根据本发明的组合物，可以被配制成例如，包衣片剂，凝胶胶囊，凝胶，乳剂，片剂，胶囊，水凝胶，食品棒，紧凑或松散粉末，液体混悬剂或溶液，糖果产品，发酵乳，发酵奶酪，口香糖，牙膏或喷雾溶液或食品载体的形式。
[0100]片剂或锭剂，干燥形式的口服补充剂和液体形式的口服补充剂适于用作饮食或药物的支持物或食品载体。
[0101]该组合物可以是例如食品补充剂，其可以通过常规方法配制，特别是生产允许释放可控的糖包衣片剂，凝胶胶囊，凝胶，乳剂，片剂，胶囊和水凝胶。
[0102]特别地，根据本发明的微生物体可以被加入所有类型的食品补充剂中或富集在食品中，例如，食品棒或紧凑或非紧凑粉末。粉末可溶于水、汽水、乳产品或大豆衍生物中，或可被加入到食品棒中。
[0103]而且，本发明的微生物体、其部分和/或其代谢物可以与通常用于这种口服组合物或食品补充剂的赋形剂和组分一起配制，即，特别地，在食品行业常用的脂肪和/或水性组分，湿润剂，增稠剂，防腐剂，纹理剂(texturing agent),增味剂和/或包衣剂,抗氧化剂，防腐剂和染料。
[0104]用于口服组合物，特别是用于食品补充剂的配方制剂和赋形剂是本领域已知的，并不是本文详细描述的目的。
[0105]在治疗应用中，组合物以足以至少部分地治愈或阻止疾病症状及其并发症的剂量施用。足以实现这一目标的剂量被定义为“治疗有效剂量”。用于此目标的有效剂量取决于本领域技术人员已知的多种因素，例如疾病的严重性和患者的体重和一般状态。
[0106]在预防性应用中，根据本发明的组合物以足以至少部分地减少发展成疾病的风险的量施用给对特定疾病易感或除此之外有风险的患者。这样的量被定义为“预防有效剂量”。而且，精确的量取决于许多患者的具体因素，如患者的健康状态和体重。
[0107]本发明的组合物包括至少一个治疗或预防有效量的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或本发明不含细胞的培养物上清。
[0108]本领域技术人员将能够相应地调整剂量。
[0109]例如，组合物可以包括每日剂量IO6-1O12Cfu,例如IO8至IOltlCfu的根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0110]之前的工作还表明非复制的约氏乳杆菌CNCM1-1225可被用于治疗或预防免疫系统相关的疾病，包括感染，参见W02010/133475，其全文在此引作参考。发现约氏乳杆菌CNCM1-1225强烈地诱导组成型hBDl表达，而且热处理的约氏乳杆菌CNCM 1-1225比其活的对应物更强烈地上调hBDl。
[0111]因而，根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物还可以以非复制的形式存在。
[0112]“非复制的”约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物包括被热处理的衍生物。其包括失活的、死的、无活力的和/或作为例如DNA、代谢物、细胞质的化合物和/或细胞壁物质片段存在的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0113]“非复制的”指通过经典的铺板方法不能检测到有活力的细胞和/或菌落形成单兀。在微生物书 James Monroe Jay, Martin J.Loessner, David A.Golden.2005.Modernfood microbiology.第 7 版，Springer Science, New York, N.Y.790p 中总结了这样的经典铺板方法。典型地，缺乏有活力的细胞可表现为如下:用不同浓度的细菌制剂(“非复制的”样品)接种并在适当的条件下孵育(有氧或无氧的气氛下至少24小时)后，在琼脂糖平板上没有可见的菌落或在液体生长培养基中没有增加的浊度。
[0114]显然地，非复制的微生物体不形成菌落，因而，该术语被理解为获得自IO6和1012cfu/g复制细菌的非复制微生物体的含量。
[0115]组合物还可以包括含量为每天的剂量为0.005mg-5000mg,例如0.5mg至50mg的根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0116]本领域技术人员将理解，其可以自由组合文中描述的本发明的所有特征，而不偏离公开的本发明的范围。特别地，描述用于本发明用途的特征可被用于本发明的食品，反之亦然。
[0117]在以下的实施 例和附图中，本发明进一步的优点和特征是显然的。
[0118]图1表示用乙基甲磺酸酯处理的约氏乳杆菌CNCM 1-1225的“生存曲线”。
[0119]图2表示从G碱基氧化到DNA链分离的天然突变的分子过程，导致亲本和修饰的DNA类型的混合物和混合的亲本和修饰菌落。
[0120]图3表示约氏乳杆菌CNCM 1-1225D-乳酸脱氢酶基因的基因序列(SEQ ID NO:1)以及在被环化的约氏乳杆菌CNCM 1-4435的对应基因中鉴别的改变。还表示了翻译的D-乳酸脱氢酶(SEQ ID NO:2)以及相应的约氏乳杆菌CNCM 1-4435的改变。
[0121]图4表示在来自四个供体的人PBMC上约氏乳杆菌CNCM 1-1225 (NCC533)和约氏乳杆菌CNCM 1-4435 (NCC2917)的免疫特征。测量培养物上清中的IFN-a、IL_12p40和IL-10，培养基中的PBMC作为对照。
[0122]图5A表示约氏乳杆菌CNCM 1-4435D-乳酸脱氢酶基因的基因序列(SEQ ID NO:6)，与亲本株约氏乳杆菌CNCM 1-1225 (G)相比在778位碱基处画框并被改变。
[0123]图5B表示约氏乳杆菌CNCM 1-4435D-乳酸脱氢酶的蛋白质序列(SEQ ID NO:7)，与亲本株约氏乳杆菌CNCM 1-1225 (D)相比在778位氨基酸处画框并被改变。
[0124]实施例1、乙基甲磺酸酯处理约氏乳杆菌CNCM 1-1225培养物。用Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液冲洗三次100 μ I含有大约16小时约氏乳杆菌CNCM 1-1225培养物的IO8菌落形成单元的样品。最终将细胞混悬于Iml PBS中，加入O或10 μ I乙基甲磺酸酯，在37°C下孵育，不振荡。在PBS中冲洗处理的细胞两次，确定处理的和未处理的培养物的CFU，作为生存者以作图给出“生存曲线”，如图1所示。最初瞄定产生1%生存者的条件，并在时间点前后将其归为一类，将细胞稀释，并在MRS平板上作为单一菌落铺板，用于计数。用余下的处理细胞接种10ml MRS肉汤，在37°C孵育16小时生长。然后稀释培养物，在MRS平板上铺板，以产生用于筛选的单个菌落。[0125]在细菌中主要通过双链DNA中鸟嘌呤(G)残基的氧化天然地发生突变，典型地，当通过DNA复制解决该问题时，产生单个碱基对改变，如图2所示。这导致G到腺嘌呤(A)，以及胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的天然突变特征，取决于哪条DNA链被测序。乙基甲磺酸酯通过G碱基的化学氧化发挥作用，导致如天然突变相同的突变特征，即，G到A和C到T，这取决于哪条DNA链被测序。这随后被D-乳酸脱氢酶基因和基因组序列的DNA测序确定，其中观察到的大部分改变是G到A或C到T。 [0126]实施例2、对在D-乳酸生产中有缺陷的菌株的单个菌落的筛选。将单个的乙基甲磺酸酯处理的菌落挑至含有200 μ I MRS肉汤的96-孔平板，在37°C下孵育24小时，以形成小培养物。使用Tecan sunrise微平板读取器,在620nm下通过吸光度估计培养物的生长。10 μ I培养物上清混合190 μ I反应混合物，该反应混合物含有IOOmM Tris HCl pH9，2.5mMEDTA pH8.0, 20U/ml D-乳酸脱氧酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)),lmg/ml ΝΑ?(β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，以及3%水合肼(hydrazinium hydroxide),在室温下培养I小时。然后使用Tecan sunrise微平板读取器,在320nm下测量吸光度(β -NADH的形成)，将数据输入excel用于分析。在每个平板上包括含有单独的MRS的对照和浓度为5 %、25 %、50 %或100 %的约氏乳杆菌CNCM 1-1225培养物上清，作为数据归一化的标准。
[0127]这是一个分离菌落的表现型分析，以确定生长后培养基中D-乳酸的存在或缺失。当筛选D-乳酸存在的单个菌落时，也很明确含有50% D-乳酸生产者和50%非D-乳酸生产者的“混合”培养物将导致D-乳酸存在为“阳性”的培养物。因而，我们瞄定的D-乳酸缺陷的表现型被认为是D-乳酸生产表现型“隐性的”。当我们考虑图2所示的致突变概要时，这是重要的，因为单一的氧化G碱基将导致最后的菌落是亲本和改变的个体的混合物，因而在表现型上是D-乳酸阳性。在这种情况下，为了分离D-乳酸生产缺陷的菌株，乙基甲磺酸酯处理后包括在MRS肉汤中的生长是重要的。在筛选某些21，000个乙基甲磺酸酯处理的菌落后，分离了 15个D-乳酸生产缺陷的菌落，用于进一步的分析。
[0128]实施例3、确定培养基中D-乳酸水平。培养物在37°C下在MRS肉汤中生长16小时，通过离心移除细菌。为了确定D-乳酸的浓度，在水中稀释不含细胞的培养物上清，如上所述进行分析，并与用D-乳酸钠稀释液制备的标准曲线比较。用兔肌肉L-乳酸脱氢酶交换D-乳酸脱氢酶，并用L-乳酸钠作为标准，以相同的方式确定L-乳酸的浓度。对于CNCM1-4435的该分析结果在表1中表示，包括对照约氏乳杆菌CNCM 1-1225，带有GMO失活的D-乳酸脱氢酶基因的约氏乳杆菌NCC9006和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)NCC2461和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) NCC4007，二者均被认为是生产L-乳酸的菌株。
[0129]副干酪乳杆菌NCC2461 (保藏号:CNCM 1-2116)根据布达佩斯条约于1999年I月12日保藏于CNCM (地址在上面已经提及)。鼠李糖乳杆菌NCC4007(保藏号:CGMCC1.3724)根据布达佩斯条约于2004年10月保藏于中国普通微生物保藏中心(CGMCC)，中国科学院微生物所，西北辰路I号，朝阳区，北京100101，中国。约氏乳杆菌NCC9006是衍生自约氏乳杆菌 Lal 的菌株，如 Lapierre 等人，题目 “D-Lactate Dehydrogenase Gene (IdhD)Inactivation and Resulting Metabolic Effects in the Lactobacillus johnsoniiStrains Laland N312”(Appl.Environ.Microbiol.1999，65 (9):4002)的文章所述。[0130]表1、从不含细胞的培养物中测定的约氏乳杆菌CNCM 1-1225、约氏乳杆菌CNCM
1-4435的D-和L-乳酸值。包括作为对照的菌株NCC9006、带有GMO失活的D-乳酸脱氢酶基因的约氏乳杆菌菌株，副干酪乳杆菌NCC2461和鼠李糖乳杆菌NCC4007，二者均被认为是生产L-乳酸的菌株。以一式三份进行实验，给出了中位值并在括号中给出标准差。
[0131]
【权利要求】
1.约氏乳杆菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物在D-乳酸生产中有缺陷，比约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225诱导更少的通过外周血单核细胞分泌的I型T辅助性细胞因子。
2.根据权利要求1所述的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的D-乳酸脱氢酶酶序列在氨基酸位点260包括天冬氨酸到天冬酰胺的氨基酸改变。
3.根据权利要求1或2所述的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列在核酸位点820上包括G到A的转换。
4.根据权利要求1至3任一项所述的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-4435。
5.根据权利要求1至4任一项所述的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物以生物纯的培养物存在。
6.从根据权利要求1至4任一项所述的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物的生物纯的培养物分离的不含细胞的培养物上清。
7.包含根据权利要求1至5任一项所述的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或根据权利要求6所述的不含细胞的培养物上清的组合物，用于制备用于通过疗法治疗人或动物体的方法中的组合物。
8.包含根据权利要求1至5任一项所述的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或根据权利要求6所述的不含细胞的培养物上清的组合物，用于治疗或预防与衰弱的免疫系统相关的疾病。
9.用于根据权利要求8所述的用途的组合物，其中与衰弱的免疫系统相关的疾病选自流感、鼻炎、普通感冒及其组合。
10.包含根据权利要求1至5任一项所述的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或根据权利要求6所述的不含细胞的培养物上清的组合物，用于治疗或预防与肠毒性细菌或病毒的细胞附着和细胞侵入有关的疾病。
11.用于根据权利要求10所述的用途的组合物，其中与肠毒性细菌或病毒种的细胞附着和细胞侵入有关的疾病选自下呼吸道感染、中耳炎、胃肠道感染、以及其组合，以及，其中优选地肠毒性种选自沙门氏菌属；弯曲杆菌属；李斯特菌属；大肠杆菌菌株，如ETEC，EHEC, EPEC或EIEC菌株；耶尔森氏菌属；志贺氏菌属；产毒素细菌，如金黄色葡萄球菌(Staphtlococcus aureus),肉毒杆菌(Clostridium botulin um),或腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus) ；Vibrio vulnifucus/溶血性弧菌；轮状病毒；诺沃克病毒(norovirus);产vero毒素的大肠杆菌；阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii);产毒产气荚膜梭菌(A，B型)；食源性寄生虫，如棘球属，弓形虫属，或贾第虫属；幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylor ;艰难梭菌(Clostridium difficile);破伤风梭菌(Clostridiumtetani);或它们的组合。
12.用于根据权利要求7至11任一项所述的用途的组合物，其中组合物选自食品组合物、宠物食品组合物、饮料、乳制品、营养配方、食品添加剂、营养食品、药物组合物、食品成分和/或化妆品组合物。
13.用于根据权利要求7至12任一项所述的用途的组合物，其中组合物选自酸化的乳制品，例如酸奶或酸奶饮品；或基于乳类的粉末。
14.用于根据权利要求7至13任一项所述的用途的组合物，其中组合物包含每日剂量1O6-1O12Cfu的根据权利要求1至5任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
15.用于根据权利要求7至14任一项所述的用途的组合物，其中组合物包含每日剂量大约0.005mg-5000mg的根据权利要求1至5任一项所述的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
【文档编号】C12N9/04GK103649306SQ201280025792
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年3月29日 优先权日:2011年3月29日
【发明者】R-D·普里德莫尔, F·福阿塔, M·戴雷, I·扬科维奇 申请人:雀巢产品技术援助有限公司