[0033]
[0034] 实施例2液体发酵生产耐酸性高溫a-淀粉酶
[0035] 斜面培养：将所述地衣芽抱杆菌突变株M6-X3取一接种环接种于LB固体斜面， 34°C下恒溫培养36h。 阳036] 摇瓶培养：取一接种环斜面种子菌苔，接入LB液体培养基中，在初始P册.6、36 °C、 摇床转速25化pm条件下培养IOh。
[0037] 种子罐培养：将摇瓶培养的种子液按照接种量的4%接入种子罐，在初始P册.3、 发酵溫度34°C、转速25化pm条件下培养13h。 阳03引种子罐培养基配方为：麦芽糊精3 %，酵母粉0. 2 %，氯化巧0. 25 %，硫酸锭0. 8 %，蛋白腺0. 5 %，憐酸氨二钢0. 5 %，P册.3。
[0039] 发酵罐培养：按照发酵罐培养基体积的5 %进行接种，培养溫度35°C，罐压 0. 07MPa，转速80化pm，溶氧在30-40%，发酵过程中抑高于6. 5开始补料，补料控制抑在 6. 2-6. 3,菌体自溶严重时结束发酵，培养周期15化。
[0040] 发酵培养基配方为：木馨淀粉8 %，豆饼粉6 %，玉米浆1 %，憐酸氨二锭0. 3 %，氯 化巧0. 5%，P册.3。
[0041] 补料配方为：麦芽糖40 %，憐酸二氨钢0. 5 %，氯化巧0. 5 %，抑在5. 0。
[0042] 下表是进行6批发酵的发酵周期和发酵酶活力，平均发酵酶活力为：42470u/mL。
[0043] 阳044] 实施例3所产耐酸性高溫a-淀粉酶的基本性质 W45]W酶活力41518u/mL的耐酸性高溫a-淀粉酶为基准，分别在不同溫度和不同抑 下进行酶活测定实验，该菌株所产酶的最适反应溫度为96-100°C，最适抑范围为4. 0-5. 0。 在95°C保溫处理化，剩余酶活力为95%。
[0046] 另本发明耐酸性高溫a-淀粉酶酶活定义及测定方法如下：
[0047] (1)酶活定义：
[0048] 在70°C、P册.0的条件下，Imin液化Img可溶性淀粉所需的酶量即为一个酶活力 单位，Wu/mL(u/g)表示。 W例 似试剂和溶液：
[0050] 原舰液：称取22.Og舰化钟和11.Og舰，用少量水完全溶解，定容至SOOmU胆于栋 色瓶中。
[0051] 稀舰液：吸取原舰液2.OOmU加入20.Og舰化钟，用水溶解并定容至SOOmU胆于栋 色瓶。
[0052] 20g/L可溶性淀粉溶液：称取2.OOOg可溶性淀粉（W绝干计），精确至0.OOOlg, 用水调成浆状物，在揽动下缓缓倾入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液 并入其中，揽拌加热直至完全透明，冷却定容至lOOmL。溶液现配现用。
[0053] 憐酸缓冲液（pH=6. 0):称取45.23g憐酸氨二钢（胞2册〇4?2&0)、8.07g巧樣酸 (QftO, ?&0)，用水溶解并定容至1000血，配好后用抑计校正。
[0054] 盐酸溶液[C化印=0.Imol/L]，按GB601配制。
[0055] (3)待测酶液的制备
[0056] 准确吸取酶液ImU用少量憐酸缓冲液（P册.0)充分溶解，样品全部移入容量瓶 中，用憐酸缓冲液（P册.0)定容至刻度，摇匀，四层纱布过滤，滤液待用。稀释的酶液浓度在 60u/mL-6加/mL范围内。
[0057] (4)测定方法：
[0058] 吸取20g/L的可溶性淀粉溶液20.OmL和憐酸缓冲液（pH= 6. 0) 5.OmL于试管中， 混合均匀，在70°C恒溫水浴中预热平衡8min。加入稀释好的待测酶液1.OOmU立即计时，摇 匀，准确反应5min。反应结束立即吸取反应液1. 00血，加到预先盛有0.Imol/L盐酸0. 5血 和稀舰液5.OOmL的试管中，摇匀。W0.Imol/L盐酸0. 5mL和稀舰液5.OOmL的混合液作试 剂空白，于660皿波长下，用IOmm比色皿迅速测定其吸光度（A)。根据吸光度查表（表格详 见GB8275-2009)，求得测试酶液的浓度。
[0059] 耐酸性高溫a-淀粉酶酶活计算公式：
[0060] X=CXNXie. 67
[0061] 式中：
[0062] X--样品酶活力，u/mL; 阳06引 C一一测试酶样的浓度，u/血；
[0064] N一一样品稀释倍数； W65] 16. 67-一根据酶活力定义计算的换算系数。
【主权项】
1. 一株高产耐酸性高温a -淀粉酶的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株具体为地 衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)M6-X3,菌株保藏编号为：CGMCC NO. 10785。2. 根据权利要求1所述的高产耐酸性高温a -淀粉酶的地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢 杆菌菌株具有高产耐酸性高温a -淀粉酶特性，液体发酵活力在3. 8-4. 2万u/mL。3. 如权利要求1所述的高产耐酸性高温a -淀粉酶的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述 耐酸性高温a -淀粉酶的最适pH为4. 0-5. 0,最适反应温度为96-100°C，在95°C的条件保 温3h，剩余酶活力为95%。4. 一种利用权利要求1所述地衣芽孢杆菌生产酸性高温a _淀粉酶的方法，包括如下 步骤： 种子罐培养条件：接种量3% -6%，培养温度34°C -40°C，培养时间11-16小时，pH在 6. 0-6. 5 ； 种子罐培养基组成：麦芽糊精3-4 %，酵母粉0. 2-0. 3 %，氯化钙0. 2-0. 3 %，硫酸铵 0? 8-1. 0%，蛋白胨 0? 5-0. 6%，磷酸氢二钠 0? 4-0. 5%，pH6. 0-6. 5。 液体发酵：接种量3-5 %接种于发酵培养基，培养条件为：pH6. 0-6. 5,培养温度 35-40°C，罐压0. 07MPa，溶氧在30% -40%，转速200-800rpm，发酵期间pH高于6. 5开始补 料，补料控制pH在6. 0-6. 5,菌体自溶严重时发酵结束，培养周期130-160小时。5. 根据权利要求4所述一种利用地衣芽孢杆菌生产酸性高温a -淀粉酶的方法，其特 征在于，所述发酵培养基组成为：木薯淀粉6-8 %，豆饼粉6-7 %，玉米浆1-3 %，磷酸氢二铵 0? 1-0. 3%，氯化钙 0? 5-1. 0%，pH6. 0-6. 5。6. 根据权利要求4所述一种利用地衣芽孢杆菌生产酸性高温a -淀粉酶的方法， 其特征在于，所述补料的培养基组成为：麦芽糖30-40 %，磷酸二氢钠0. 5-1. 0 %，氯化钙 0? 5-1. 0%，pH 在 5. 0-5. 5。
【专利摘要】本发明涉及一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌及其液体发酵方法。所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌(Bacillus？licheniformis)M6-X3，菌株保藏编号为：CGMCC？NO.10785。地衣芽孢杆菌诱变株CGMCC？NO.10785液体发酵产耐酸性高温α-淀粉酶的方法发酵活力在3.8万-4.2万u/mL。所产的耐酸性高温α-淀粉酶在95℃保温3h后剩余酶活力为95％，最适反应温度范围96-100℃，最适反应pH4.0-4.5，具有良好的耐高温性和耐酸性，可广泛应用在淀粉加工、啤酒酿造、发酵及纺织等多个行业。CGMCC NO.1078520150507
【IPC分类】C12N9/28, C12R1/10, C12N1/20
【公开号】CN105154376
【申请号】CN201510677368
【发明人】王兴吉, 吕彦茹, 刘文龙
【申请人】山东隆科特酶制剂有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月19日