一种与(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成相关的蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及一种(Ε)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合 成相关的蛋白，编码其的基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物的间接防御反应是在玉米上首次发现的，这种防御反应的特点是被植食性昆 虫取食之后，植物依靠特异性挥发物的释放来吸引昆虫的天敌，从而达到防御植食性昆虫 的目的。许多植物在被植食性昆虫取食之后可以提高特异性挥发物释放的量，一些植食性 昆虫诱导的挥发物可以吸引植食性昆虫的天敌(捕食性或寄生性），这些挥发物就成为植物 间接防御的媒介(信号)物质，所以植物间接防御研究的核心是植物特异性的挥发性信号物 质及其调控机制。相对于已经有一定研究基础的生态方面的研究，植物间接防御反应在分 子生物学方面的研究还很薄弱。利用分子生物学技术以及转基因技术研究植物特异性的挥 发物可以最大程度的去除背景干扰，容易地找到植食性昆虫诱导后表达量特异性上升的挥 发物。目前植物间接防御反应在分子生物学方面的研究主要进行以下两方面:一方面是有 多少基因直接参与植食性昆虫诱导后，植物特异性挥发物的生物合成；另一方面是这些基 因怎样调控挥发物的合成，产物是什么以及这些产物具有什么样的作用。
[0003] 植物萜烯(单萜烯、倍半萜烯、双萜烯)类化合物是植物在被植食性昆虫诱导后最 常见，最多样的植物挥发物类群。一些特定种类的萜烯化合物在植物间接防御方面的功能， 已经通过人工合成标准化合物，从生态学方面进行了研究。在基因水平上，从调控植物萜烯 合成酶基因的表达出发，也验证了部分萜烯化合物在植物间接防御方面的功能。所有的萜 烯化合物都是由萜烯合成酶调控合成的，萜烯合成酶是合成植物萜烯类挥发物末端合成 酶。因此，研究萜烯合成酶以及萜烯合成酶基因对于确定植食性昆虫诱导的植物特异性挥 发物具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种与萜烯类化合物合成相关的蛋白及其编码基因。
[0005] -种与萜烯类化合物合成相关的蛋白，具有SEQ ID N02所述的氨基酸序列。
[0006] 所述萜烯类化合物为(E) -β-石竹烯和(E) -a-律草烯。
[0007] 上述蛋白的编码基因。
[0008] 所述编码基因具有SEQ ID N01所示的核苷酸序列或SEQ ID N01中第60-1820位核 苷酸序列。
[0009] 含有上述编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。
[0010]上述重组载体为将上述编码基因插入到表达载体中，得到表达所述蛋白的载体。 [0011] 所述编码基因具有SEQ ID N01所述的序列，该序列插入表达载体pET28a的Xho I 和Ncol间。
[0012] 上述重组菌为将上述的重组载体导入目的菌得到的重组菌，所述目的菌具体为大 肠杆菌。
[0013] 上述蛋白或上述编码基因或上述重组载体或上述的重组菌在合成萜烯类化合物 中的应用。
[0014] 上述应用中，上述砲稀类化合物为(Ε)-β-石竹稀和(E)-a-律草稀。
[0015] 本发明的实验证明，本发明得到的立马豆(Ε)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶基 因在大肠杆菌中表达具有F P P合成活性，可催化前体化合物法尼基焦磷酸 (farnesylpyrophosphate，FPP)合成(Ε)-β-石竹稀和(E)-a-律草稀。表明立马豆(Ε)-β-石 竹烯和(E)-a-律草烯合成酶的编码区序列可应用于化合物的生物合成和通过转基因技术 提高水稻、玉米和蔬菜等农作物抗虫性的研究。
[0016] 本发明得到的立马豆(Ε)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶基因具有1)由序列表 中SEQ ID N02所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者2)将序列表中SEQ ID N02的氨基酸序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与萜烯类化合物合成相关蛋 白的由1)衍生的蛋白质。上述的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。上述(2)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID N02所示的DNA序列缺失一个 或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5 '端和/ 或3'端连上表2所示的标签的编码序列得到。上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸 残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理 引起的。
[0017] 上述编码基因为1)-4)中任一一种：
[0018] 1)序列表中SEQ ID N01所示的DNA分子；
[0019] 或2)序列表中SEQ ID N01自5'末端第60-1820位核苷酸所示的DNA分子；
[0020] 或者3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码与萜烯类化合物合成相 关蛋白的DNA分子；
[0021] 或者4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或 至少具有99 %同源性且编码与萜烯类化合物合成相关蛋白的DNA分子。
【附图说明】
[0022] 图1 ·立马豆car/humu基因的PCR扩增
[0023] M:DNA分子量标准(D2000) ;P:PCR产物
[0024] 图2 ·重组质粒 pet28a_car/humu 的 PCR 鉴定
[0025] 其中M:DNA分子量标准(D2000) ;P:PCR产物
[0026] 图3 .pET28a-cary/humu 纯化的 SDS电泳图
[0027] M:蛋白Maker，1-2 :pET28a_cary/humu经IPTG诱导后的上清和包涵体3:纯化到的 的 pET28a_cary/humu蛋白。
[0028] 图4.融合蛋白car/humu合成酶体外酶活产物的GC-MS分析。
[0029] 其中A:以FPP底物的18.26min的酶活产物;Β:(Ε)-β-石竹烯标样18.26min的质谱 图；C:以FPP为底物的18.74min的酶活产物;D: (E)-a-律草烯标样的18.74min的质谱图。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]下述实施例中质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶购自NEB公司，高保真酶 pfu、T_easy载体、大肠杆菌菌株DH5a、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶 购自TaKaRa公司，总RNA的提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，底物FPP(Product Number :F6892)和二氯甲烧等其他化学试剂均购自sigma公司，其他化学试剂为国产分析 纯，引物和测序均由北京华大基因完成。
[0033] 实施例一、cary/humu合成酶基因的克隆 [0034] 1、立马豆总RNA的提取和cDNA的合成
[0035] 立马豆的总RNA的提取参照天根生化科技有限公司RNA simp 1 e总RNA提取试剂盒 中的说明手册提取。琼脂糖凝胶电泳检测并通过NanoDrop测定浓度。cDNA第一链的合成采 用TAKATA公司的primer scriptTM 1st strand cDNA Synthesis System反转录试剂盒，方 法参照试剂盒中的说明手册。同时，为了获得基因全长，用SMARTerTMRACE cDNA扩增试剂盒， 进行cDNA的合成，方法参照试剂盒中的说明手册。
[0036] 2、引物设计与基因克隆
[0037]根据葡萄的（Ε)-β-石竹烯合成酶序列(AEP17005.1)，在菜豆基因组网站http:// phytozome. jgi . doe. gov/pz/portal .html# ； ! info?alias = 0rg_Pvulgaris VI · 0上进行 blast，获得立马豆TPS基因部分保守序列。用primer5.0分别设计5'及3'RACE引物，通过 RACE扩增得到全长序列5RACE primer 1: CAGTGGGTCGAGTAAAGGGAGGT;
[0038] 5RACE primer2:AAGCCTCCCTTAGAC