ATGGTTTG；
[0039] 3RACE primerl:ATAAATGATGCATGCTTAGCTCCTA；
[0040] 3RACE primer2:GCAGGAGGCATAATGAAAGATCATA,
[0041] 引物由北京华大基因公司合成。通过巢氏PCR获得基因全长。
[0042]立马豆种子，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。
[0043]以立马豆的cDNA为模板，通过RACE扩增，得到1892bp的PCR产物（图1 )，含59的5 ' UTR和72的3'UTR序列。目的片段利用TA克隆的方法连接到T-easy载体(购自北京全式金公 司）后，构建成Τ-(Ε)-β-石竹烯和（E)-a-律草烯合成酶测序载体，经过测序（见SEQ ID N01)，该1892bp的PCR产物含有的基因编码区位于第60-1820位，将该基因命名为cary/humu 合成酶，该基因编码的蛋白命名为cary/humu;该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID N02,共586个氨基酸。经过序列比对，cary/humu合成酶与苜蓿MtTPS3核苷酸的相似性为 50% 〇
[0044] cary/humu测序载体为将序列表中的序列1插入T-easy载体得到的载体。
[0045] 实施例二、cary/humu合成酶在合成砲稀类化合物(Ε)-β-石竹稀和(E)-a-律草稀 中的应用
[0046] 1、载体构建
[0047] 以03巧/11111]111合成酶测序载体为模板，利用高保真酶1>3113七31^?38七？；1^11〇财 Polymerase及引物cary/humuF5 ' -GCCAGTGTGATGGATATCTGCA-3 '）/cary/humuR(5 ' - GCTACGAGCTCGGATCCACTAG-3 '），得到1859bp的带有A末端的目的片段(具有序列表中SEQ ID N01的核苷酸）。将上述带有A末端的目的片段参照全式金生物有限公司pEASY-El Expression Kit说明书与载体pEASY-El连接，得到的连接产物转入普通大肠杆菌后涂于含 Amp (50mg/ml)的LB平板上过夜培养。
[0048] 挑取单克隆利用T7F(5 ' -TAATACGACTCACTATA-3 '）及目的基因下游引物NESR进行 检测，得到阳性克隆（图2)。将阳性克隆提取质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列1自5' 末端第60-1820位核苷酸利用TA克隆的方法插入载体pET28a的Xhol和Ncol酶切位点酶切位 点间得到的载体，命名为pET28a-cary/humu。
[0049] 将pET28a-cary/humu转化BL21 (DE3)感受态细胞，转化过程见全式金生物有限公 司BL21 (DE3)Chemically Competent Cell说明书，得到BL21 (DE3)/pET28a_cary/humu合成 酶，将BL21(DE3)/pET28a-cary/humu利用T7F及目的基因下游引物进行PCR检测，证明 pET28a_cary/humu已转入大肠杆菌中。
[0050 ] 2、cary/humu合成酶蛋白的诱导表达、分离及纯化
[0051 ] 将BL21(DE3)/pET28a-cary/humu在加入ΙμΜ的IPTG的LB培养基中培养，条件为16 °C 180rpm、诱导12h，得到培养产物，将培养产物于4°C，1 OOOrpm离心10min收集上清液。
[0052]将上清液利用AKTA FPLC system(Amersham)，HiLoad_16/60_superdex_75_prep_ grade (global)分子筛预装柱分离纯化4ml上样环，洗脱流速：1 ml/min，每1 ml收集一次； 洗脱液50mM Na2HP〇4,300mM NaCl，250mM imidazole，Na0H调pH至8.0,经SDS-PAGE检验后获 得纯化cary/humu合成酶蛋白（为收集2柱体积的洗脱液)（图3)。
[0053] 3、cary/humu合成酶蛋白酶活性鉴定
[0054] 利用蛋白超滤膜离心管，将收集2柱体积的洗脱液(纯化cary/humu合成酶蛋白）用 pH为7 · 0，50mM PBS(通过将39ml0 · 2M的NaH2P〇4、与61ml0 · 2M的Na2HP〇4、混匀后获得）置换， 并将蛋白浓缩4μg/ml。为防止有机溶剂的污染，以下均采用玻璃器皿。按照表1的体系进行 反应，体系111^，37°(3,3〇1^11，得到反应产物。以水替代纯化〇 &^/111111111合成酶蛋白作为对照。
[0055] 表1为cary/humu合成酶蛋白酶活性鉴定反应体系
[0057] 反应结束后，每个样品瓶子中加入500μ1的二氯甲烷，涡旋lmin，冰上放置30min， 抽提产物。小心吸取上清至新的玻璃瓶中，利用稳定的氮气流（14PSI)吹到只剩2ul (约 5min)，加入10μ1的二氯甲烷，待用。
[0058]取 ΙμL 样品进样，利用气质联用系统 GC-MS(HP6890/HP5973，Hewlett-Packard 公 司），色谱柱HP-5MS (60m X 250μπι X 0 · 25μπι; Hewlett-Packard公司），GC-MS仪器进行分析。升 温程序为:40°C保持lmin，以5min5°C的增量升到250°C(l°C/min)，最后250°C保持HmiruMS 检测范围为40-550,温度为170°C。
[0059] GC-MS检测两组的反应产物，结果如图4示（Α)(Ε)-β_石竹烯标样的出峰时间 (18.26min)和质谱图；（B)cary/humu合成酶蛋白催化FPP产物的出峰时间（18.26min)和质 谱图；（C) (E)-a-律草稀标样的出峰时间（18.74min)和质谱图；（D) cary/humu合成酶蛋白催 化FPP产物的出峰时间（18.74min)和质谱图。通过和标样的出峰时间和质谱图对比，说明纯 化cary/humu合成酶蛋白可催化法尼基焦磷酸（f arnesy lpyrophosphate，FPP)合成(E)-β-石竹烯和(Ε)-a-律草烯。
【主权项】
1. 一种与萜烯类化合物合成相关的蛋白，具有SEQ ID N02所述的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的蛋的，所述萜烯类化合物为(Ε)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯。3. 权利要求1或2所述的蛋白的编码基因。4. 根据权利要求3所述的编码基因，具有SEQ ID N01所示的核苷酸序列或SEQ ID N01 中第60-1820位核苷酸序列。5. 含有权利要求3或4所述的编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。6. 权利要求5所述的重组载体，为将权利要求3或4所述的编码基因插入到表达载体中， 得到表达所述蛋白的重组载体。7. 根据权利要求6所述的重组载体，所述编码基因具有SEQ ID N01所述的序列，该序列 插入表达载体pET28a的Xho I和Ncol间。8. 权利要求5所述的重组菌，为将权利要求6或7所述的重组载体导入目的菌得到的重 组菌，所述目的菌具体为大肠杆菌。9. 根据权利要求1或2所述的蛋白或权利要求3或4所述编码基因或权利要求5-8任一重 组载体或重组菌在合成萜烯类化合物中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，所述萜烯类化合物为(Ε)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯。
【专利摘要】本发明一种与(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成相关的蛋白及其应用，属于分子生物学领域。本发明提供的蛋白，是具有如SEQ？ID？NO2所示氨基酸序列的蛋白质。本发明的实验证明，本发明得到立马豆(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶的cDNA核酸序列及(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶编码蛋白序列，大肠杆菌中表达的(E)-β-石竹烯和(E)-a-律草烯合成酶蛋白具有FPP合成活性，可应用于化合物的生物合成和通过转基因技术提高水稻、玉米和蔬菜等农作物抗虫性。
【IPC分类】C12N9/88, C12N15/70, C12P5/00, C12N1/21, C12N15/60
【公开号】CN105524908
【申请号】CN201610077850
【发明人】王桂荣, 李峰奇, 杨婷, 刘杨
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月4日