一种克隆酶供体片段及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断领域，具体说是属于均相酶免技术领域的克隆酶供体片段， 及其基因。
【背景技术】
[0002] 利用重组DNA技术制备β-半糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体（enzyme acceptor，EA)，小片段称为酶供体(enzyme donor，ED)。两个片段本身均不具酶活性，但在 合适的条件下结合在一起就具有酶活性。利用这两相片段的特性建立的均相酶免疫测定称 为克隆酶供体免疫测定（cloned enzyme donor immune assay，CEDIA) 〇
[0003] CEDIA的反应模式为竞争法，测定原理为:标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性 抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再 能与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶。加入底物测定 酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。CEDIA主要用于药物和小分子物质的测 定。
[0004] 但是该技术存在以下几个技术难点，导致该技术未能大范围应用，大大限制了其 应用领域。
[0005] 其一，偶联小分子问题，一般来说，蛋白分子中可以用于交联的活性基团有游离氨 基(如赖氨酸的ε_氨基或者末端氨基）、酚基(酪氨酸）、巯基(半胱氨酸）、羟基(丝氨酸或苏 氨酸）。野生的ED(CNBr2)与ΕΑ(Μ15或Μ112)具有较高的互补活性(非-专利文件l:Welply J K,Fowler A V,Zabin I,.beta-Galactosidase alpha-complementation.Overlapping sequences.[J].Journal of Biological Chemistry, 1981,256(13):6804_6810·)，但是其 上的位点并不适合于偶联小分子物质，例如专利US4708929指出通过该片段上的氨基，羧 基，巯基，与小分子化合物偶联后，其所得的产物与EA片段的互补效率大大降低，因此若不 对该片段进行合适的改造，恐怕不能用于直接地偶联小分子。
[0006] 其二，由于ED片段的分子量较小，约有90个氨基酸组成，其分子量只有lOKDa左右， 因此，如果直接用于表达，很容易在表达的过程中就进行降解，使得难以得到完整的ED片 段。为此有以下两种不同的策略去改进，其一是利用多肽合成的方法进行获得片段，例如 专利US7135325B2,利用多肽合成的方法合成了一系列小的ED片段，这些ED片段具有一定的 互补活性。但是利用多肽合成的方法对于小分子多肽的合成上具有一定的优势（小于50个 氨基酸），正如该专利所合成的那样(30~50aa)，但随着多肽分子量的增加，其合成难度以 及成本均急剧上升。而较好的ED片段所含的氨基酸数目为应该是60~100个为宜，因为如果 片段过于的小，其互补效率也会下降，且该片段的稳定性也会受到影响。另一种方法是在 表达方式上进行改善，例如专利US4708929就是通过ED与EA共表达的方式获得EA，有学者则 是通过ED与Trx蛋白融合表达的方式获得(非-专利文件2:李黄金，陈伟，赵林，等.β-半乳糖 苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析[J].广东药学院学报，2010(04) :412-415.)，也有学者则是通过胞外表达的方式获得ED(非-专利文件3:许淑芬，刘磊，孙牧男， 等.大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定[J].吉林大学学报：医学版， 2010，36( 1):40-44.)。但是无论用现有的哪种表达方式，其所获得的ED表达量均很低，很难 满足产业化的要求。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的克隆酶供体片段存在表达量低，稳定性差，偶联易失活等 缺点，提供一种稳定性好，偶联方便，表达量高的克隆酶供体片段。
[0008] 即，本发明是对氨基酸序列进行了一定的突变筛选，找到了一种稳定性好，易于偶 联的ED，并在表达的方式上进行了一定的改进，能够很方便地获得大量ED片段。
[0009] 具体地说，本发明是将三个ED片段，通过凝血酶酶切位点串联起来，获得具有SEQ ID NO: 1所示序列的片段，并进行表达所获得的。
[0010]本发明SEQ ID N0:1所示的该序列具有如下特征：
[0011] (l)SEQ ID NO: 1序列具有三段相同的序列通过凝血酶酶切位点连接起来；
[0012] (2)该片段的分子量约为30KDa;
[0013] (3)每一个重复片段的分子量约为lOKDa;
[0014] (4)每一个重复片段的N端含有6*His Tag标签，可用于亲和纯化；
[0015] (5)每一个重复片段均含有一个半胱氨酸残基，可利用该巯基偶联小分子化合物；
[0016] (6)每一个重复片段均含有一个赖氨酸残基，可利用该侧链的氨基偶联小分子化 合物；
[0017] (7)用于偶联的半胱氨酸和赖氨酸均位于片段的N端，与ED的互补核心序列(非-专 利文件 4:Douglas H. Juers, Raymond H. Jacobson f,Dale ffigley,et al .High resolution refinement of beta-galactosidase in a new crystal form reveals multiple metal-binding sites and provides a structural basis for alpha-complementation.[J].Protein Science A Publication of the Protein Society, 2000,9(9) :1685-1699.)具有一定距离，进而不会明显影响到ED与EA的互补效率D
[0018] SEQ ID NO: 1所示的该序列如下所示：
[0020] 由于该片段的分子量由原先的lOKDa变成了 30KDa，其在表达时不容易被降解，更 加容易获得具有完整片段的酶。
[0021] 本发明还提供一种编码上述克隆酶供体片段的基因。本发明上述的SEQ ID NO: 1 序列为蛋白质序列，那么可以根据密码子的组成规律，很容易获得能够编码该蛋白质序列 的DNA序列，对于一个要想在特定物种中进行表达，则该DNA序列可以进行相应的优化，尽量 避免利用稀有密码子，这样可以提高其表达量，例如若要是在大肠杆菌中进行表达，则可以 针对大肠杆菌中使用密码子的频率来选择合适的DNA序列。本发明所使用的DNA片段可以利 用全基因化学合成的方式获得，也可以利用PCR的方式将三个DNA片段拼接起来。
[0022] 进一步的，本发明还提供一种含有上述基因的载体。对于所使用的载体，则可以选 择pET系列载体，如pET22b(大肠杆菌表达载体），则相应的启动子为T7启动子，后期则要选 择含有DE3溶源菌的菌株，例如BL21(DE3)，表达时则可以利用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷） 进行诱导。也可以选择含有Ara诱导的启动子的质粒，例如pGr 〇7,则后期可以选择JM109等 菌种，同时需要利用阿拉伯糖进行诱导。
[0023] 更进一步的，本发明还提供一种用上述的载体所转化的细胞。
[0024] 本发明还提供一种制备克隆酶供体片段的方法，包括：（1)培养上述的细胞；（2)利 用合适的诱导剂进行诱导表达蛋白；（3)收集菌体并破碎离心；（4)利用亲和纯化的方法进 行纯化;（5)利用凝血酶将蛋白酶切成单个片段。
[0025] 对于菌体的培养，则可以利用常规的培养方式。例如，小规模地可以利用摇床培 养，大规模地可以利用发酵罐培养，所使用的培养基为LB或其它，待其生长至一定的浓度 后，利用相应的诱导剂，如IPTG进行诱导，同时可以适当降低温度，如20°C进行表达。
[0026] 收集表达后的菌体，利用超声破碎将菌体破碎，离心，取上清，利用常规亲和纯化 的方法进行纯化。
[0027]为了获取具有生物学活性的ED片段单体，可以利用凝血酶，将上述纯化得到的ED 串