一种dna类样本保存稀释液及其制备
【专利说明】一种DNA类样本保存稀释液及其制备
[0001 ]所属领域
[0002] 本发明属于生物制品技术领域，属于聚合酶链式反应（PCR)技术领域核糖核酸 (DNA)类样本的稀释和保存范畴，涉及DNA类样本稀释液的制备方法及其应用。
[0003] 发明背景
[0004] 聚合酶链式反应(PCR)技术是重要的分子生物学技术，对现代分子生物学的发展 起到非常重要的作用。PCR技术特点是高灵敏度、高特异性、省时快速，直接检测目的基因的 样本分为DNA类样本或RNA类样本，但是对样本的稀释和保存要求甚高。核糖核酸(缩写为 RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA 由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构 成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶）取代了 DNA中的T ANA的质量好坏和浓度高低直接影响着检测结果，DNA酶是DNA降解的主要原因， DNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内DNA酶外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试 剂、人类皮肤的汗液、唾液中均存在DNA酶，且DNA酶耐热、耐酸碱，蛋白变性剂可使之暂时失 活，但变性剂去除后，又可恢复活性。所以在DNA提取过程中必须避免外源性DNA酶的污染和 抑制内源性DNA酶的活性。DNA易受外界物理因素:温度、湿度;化学因素:pH值、水解反应、氧 化反应;生物因素:酶解及微生物侵染等作用等因素而降解
[0005] 在现有的DNA类样本稀释保存方法中，主要方法有：1)稀释液用DEPC水、DNAsin等； 2)保存主要用液氮或低温保存。其缺点是：1)不同类型的DNA类样本(血清、血浆、组织、尿 液、分泌物、培养液等)无法用同一种缓冲液或稀释液;2)各种缓冲液或稀释液保存的效果 质量差，DNA容易降解;3)保存后的样本要快速进入液氮或低温保存，室温保存时间过短。因 此，开发一种高效防止DNA降解且能适用不同DNA类样本的稀释保存液，具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种DNA类样本稀释保存液的制备方法。可作为临床不同类 型的DNA类样本(血清、血浆、组织、尿液、分泌物、培养液等)的样本稀释或/和保存。
[0007] 本发明的DNA类样本稀释保存液制备方法如下：
[0008] 1、量取若干毫升去离子纯化水；
[0009] 2、分别加入二甲基亚砜（1 % ~3% [v/v])、山梨醇（0· 5mol/L~lmol/L)、Tris-HCl (0 · 01mol/L~0 · 05mol/L)，乙二胺四乙酸（0 · 01mol/L~0 · 05mol/L)，Triton_100(0 · 1 % ~ 0.5%卜八])，即-40(0.1%~0.5%卜八])、〇1616叉-100(1%~5%[￥八])、叠氮钠(0.08% ~0 · 1 % [w/v])，链霉素(400U/ml ~800U/ml);
[0010] 3、调pH值至7.8~8.2后定容；
[0011] 4、密封后高压灭菌，室温备用。
[0012] 本发明为一种可直接使用的样品保存液，其原理是抑制DNase活性，可有效保护新 鲜样本里的DNA免受降解。具有稳定、易保存、便捷等优点。适用于血清、血浆、组织、尿液、分 泌物等DNA类样本的保存和稀释。浸入DNA类样本稀释保存液后，新鲜组织细胞中DNA可以完 好的在37°C下保存1周，在25°C下保存1个月，4°C下保存6个月，在-20°C或_80°C下长期保 存。
【附图说明】
[0013] 图1显示对照组PCR扩增检测图
[0014] 图2显示实验组PCR扩增检测图
[0015] 图3显示37°C环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
[0016] 图4显示37°C环境中普通稀释液稀释的样本(Pl)PCR扩增检测图
[0017] 图5显示37°C环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
[0018] 图6显示37°C环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(Pl)PCR扩增检测图
[0019] 图7显示室温环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
[0020] 图8显示室温环境中普通稀释液稀释的样本(Pl)PCR扩增检测图
[0021] 图9显示室温环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图 [0022]图10显示室温环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(Pl)PCR扩增检测图 [0023]图11显示2-8°C环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
[0024]图12显示2-8°C环境中普通稀释液稀释的样本(Pl)PCR扩增检测图 [0025]图13显示2-8°C环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
[0026] 图14显示2-8°C环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(Pl)PCR扩增检测图
[0027]图15显示_20°C环境中普通稀释液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图 [0028] 图16显示-20°C环境中普通稀释液稀释的样本(Pl)PCR扩增检测图
[0029] 图17显示-20°C环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(P2)PCR扩增检测图
[0030] 图18显示-20°c环境中RNA类样本稀释保存液稀释的样本(Pl)PCR扩增检测图
【具体实施方式】
[0031]以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明。实施例中所用的技术手段若 为特殊指明，均为常规方法。实施例中涉及到的试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径 获取。以下实施例中的DNA类样本稀释保存液测试实验。
[0032] 实施例1 :RNA稀释保存液的制备（100ml)
[0033] 1)量取30ml去离子纯化水，加入灭菌烧杯中；
[0034] 2)吸取lml的二甲基亚砜加入烧杯中，并搅拌均匀；
[0035] 3)称取18.2g的山梨醇加入烧杯中，并搅拌溶解；
[0036] 4)称取0· 12g的Tris-HCl加入烧杯中，并搅拌溶解；
[0037] 5)吸取10mlENDA(0.5mol/L)加入烧杯中，并搅拌均匀；
[0038] 6)吸取0.5mlTriton-100加入烧杯中，并搅拌均匀；
[0039] 7)吸取10mlNP-40(l%)加入烧杯中，并搅拌均匀；
[0040] 8)称取lg的Chelex-100加入烧杯中，并搅拌均勾；
[0041 ] 9)称取0. lg的叠氮钠加入烧杯中，并搅拌溶解；
[0042] 10)吸取0.4ml的链霉素(200U/u 1)加入烧杯中，并搅拌均匀；
[0043] 11)用氢氧化钠调pH值至7.8~8.2;
[0044] 12)把已经调好pH的溶液转移到100ml的容量瓶中，用去离子纯化水定容到10