一种高通量提取园艺植物叶片基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种高通量提取园艺植物叶片基因组 DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 足量的高品质DNA是展开植物分子生物学研究的基础，但是，目前，园艺植物细胞 中常含有大量的色素、多糖、酚类等次生代谢产物，特别是多糖在DNA提取过程中的共沉淀， 使提取的DNA呈胶状难以溶解，纯度显著下降。
[0003] 常规使用的CTAB法、SDS法、尿素提取法和高盐低pH法在提取园艺植物DNA时或耗 时长、操作复杂，或提取效果差，易降解，或提取成本非常昂贵，具体为： 常规的CTAB法需要用液氮研磨材料，提取过程中需要使用酚/氯仿抽提2-3轮，且需要 低温长时间离心，耗时长，操作繁琐，提取通量低，每人每天只能提取5-10份，耗时长，并且 效率非常低下。
[0004] 使用常规CTAB法及其它方法提取的基因组DNA中一般都有大量的RNA污染，需要加 入RNA酶消化去除RNA。
[0005] 现有技术中通常所采用的高通量制备DNA的方法，或需要使用组织研磨仪在96孔 板或普通EP管中进行高通量研磨，设备昂贵(5-10万元/台），常规实验室无法使用，或直接 将材料在稀碱溶液中煮沸裂解，效果不稳定易降解。
[0006] 并且，目前市场上的商业试剂盒在提取植物DNA时一般都需要液氮研磨材料，其质 量和效果因生产批次不同而不稳定，且价格比较昂贵，难以进行高通量提取。
[0007] 一些改进的CTAB法、SDS法、酶解法虽能进行高通量制备，但提取的DNA纯度不高， 且一般需要组织研磨仪等特殊设备，难以满足常规实验室的要求。
【发明内容】
[0008] 针对于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种经济、快速、去糖效 果良好、高通量的园艺植物叶片基因组DNA提取方法，该方法采用改良的提取液和制备工 艺，能够从少量植物叶片提取高质量的DNA，具有巨大的应用价值。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 提供一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，包括以下步骤： (1) 取10-30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200-300ul研磨液，l〇-15mg石英砂 和维生素 C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加 lml所述研磨液，涡旋混匀； (2) 在8000rpm，室温离心1分钟，去除离心所得上清液，向沉淀中加入500-700ul 65°C 预热的裂解液和l〇ul 2-巯基乙醇，涡旋混匀，60-65°C保温10-15分钟； (3) 待步骤(2)中的混合液冷却至室温后，加入与步骤(2)中的裂解液等体积的氯仿，剧 烈震荡30s，室温下，放置2分钟;再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟； (4) 取300-400ul上清，转入另一离心管中，加入1/4所述上清体积的5M氯化钠，颠倒混 匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10-15分钟;再于13000rpm，室温 下，离心5-10分钟，弃上清，得沉淀； (5)向步骤(4)中得到的沉淀加入400u 1TE，用移液器吹打，溶解，再加入1 /10所述TE体 积的3M醋酸钠，pH5.2，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置 10-15分钟;再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，弃上清，得沉淀。
[0010] (6)将步骤(5)所得沉淀用70-75%乙醇洗涤后，室温下风干6-10分钟，加入50ul TE 溶液，得到基因组DNA。
[0011] 所述步骤(1)、（2)和(3)替代为： (1) 取10-30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200-300ul裂解液，10-15mg石英砂 和维生素 C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加300-400ul裂解液和10ul 2-巯基乙 醇，涡旋混匀，60-65°(3保温10-15分钟； (2) 待步骤（1)中的混合液冷却至室温后，加入与步骤(2)中的第一次和第二次加入的 裂解液体积之和等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温下，放置2分钟;再于13000rpm，室温下， 尚心5-10分钟。
[0012] 所述步骤(5)、（6)替代为： (5)将步骤(4)所得沉淀用70-75%乙醇洗涤后，室温下风干6-10分钟，加入50ul TE溶 液，得到基因组DNA。
[0013]步骤⑴中，所述石英砂和维生素 C的质量比为1:1 · 所述研磨液的配方组成为： 200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.2M的氯化钠和0.2g/L交联 聚乙烯吡咯烷酮，PH8.0; 所述裂解液的配方组成为:体积比为1:1的A液和B液； 所述A液的配方为:0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐 酸、50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000，pH8.0; 所述B液的配方为:8M氯化锂； 所述TE配方为： 10mM三羟甲基氨基甲烷.盐酸和ImM乙二胺四乙酸二钠。
[0014] 所述电动研磨仪由小型电钻和设置于所述电钻上的金属研磨棒组成。
[0015] 所述植物叶片为植物新鲜叶片或室温干燥保存的叶片;所述植物为草莓、桃、梨、 柑橘、李子、甘蓝或南瓜。
[0016] 本发明的方法具有以下有益效果： 1)简单快速，高通量;本方法无需液氮研磨，提取过程中仅需要用氯仿进行1轮抽提，室 温短时间离心，耗时短，配合简单组装的电动研磨仪便可以实现高通量提取，每人每天能提 取80-120份，提取效率得到大大提尚。
[0017 ] 2 )无 RNA污染;本方法提取的基因组DNA几乎不含RNA，纯度高。
[0018] 3)成本低，效果稳定，常规实验室即可使用;本方法在高通量制备时，只需将常规 的电钻和金属研磨棒组合成电动研磨仪，在1.5毫升离心管中仅需10秒即可将材料研磨至 匀浆状，研磨完一个样品后，只需用灭菌蒸馏水冲洗干净即可用于下一组材料的研磨，样品 少时也可以用研钵进行研磨，效果稳定，重复性好，成本低，使用方便。
[0019] 4)本发明的方法操作简单快捷，无需液氮研磨，制备通量高，耗费时间短，DNA得率 和纯度比较高;并且在裂解液中使用高浓度的氯化锂替代了氯化钠，使得到的DNA基本不含 RNA污染，纯度高，本发明得到的DNA可用于园艺植物群体遗传学、系统进化、分子标记、和常 规PCR等实验，适用于普通生物实验室研究。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例1-8提取的不同植物叶片基因组DNA的凝胶电泳图。
[0021 ]图2为以本发明实施例1 -8提取的不同植物叶片基因组DNA为模板进行扩增的ISSR 凝胶电泳图。
[0022]图3为以限制性内切酶EC0R頂每切消化本发明实施例1-8提取的不同植物叶片基 因组DNA的示意图。
[0023]图4为以本发明实施例1 -8提取的不同植物叶片基因组DNA为模板扩增叶绿体rbc 1 基因的PCR凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0024]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及 相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。
[0025] 实施例1 (1) 取20mg新鲜的草莓叶片置于1.5ml离心管中，再向离心管中加入200ul研磨液，以及 10 mg石英砂和维生素 C的混合物，用电动研磨仪将上述混合物研磨至匀浆状，补加 lml研磨 液，涡旋混匀；其中，石英砂和维生素 C的加入量均为5mg;电动研磨仪由常规的小型电钻和 设置于电钻上的金属研磨棒组成，成本低，组装简单，使用方便； (2) 将步骤(1)得到的研磨液在8000 rpm，室温下，离心1分钟，去除离心所得上清液，向 沉淀中加入600ul 65°C预热的裂解液以及10 ul 2-巯基乙醇，涡旋混匀，65°C保温10分 钟，期间颠倒混匀1 -2次； (3) 将步骤(2)得到的混合液冷却至室温后，加入600 ul氯仿，剧烈震荡30秒，室温放置 2分钟;再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟； (4) 取400 ul上清转入另一个离心管中，加入100 ul的5M氯化钠，颠倒混勾，加入lml无 水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟;再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保 留沉淀。
[0026] (5)在步骤(4)的沉淀中加入400ul TE，用移液器吹打加速溶解，再加入40ul 3M的 醋酸钠，PH5.2，颠倒混匀，加入800ul无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟;再于13000rpm， 室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保留沉淀； (6)将步骤(5)所得沉淀用75%乙醇洗涤后，室温风干10分钟，加入50ulTE溶解，得到基 因组DNA，-20°C保存。
[0027] 上述方法中，研磨液的配方组成为:200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四 乙酸二钠、〇. 2M的氯化钠和0.2g/L交联聚乙烯吡咯烷酮(pH8.0); 裂解液的配方组成为:体积比为1:1的A液和B液;其中， A液的配方为：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐酸、 50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000(pH8.0); B液的配方为:8M氯化锂。
[0028] TE的配方组成为：10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸和ImM乙二胺四乙酸二钠。
[0029] 实施例2 采用的植物为梨叶片，提取步骤同实施例1，得到梨叶片基因组DNA。
[0030] 实施例3 (1) 取20mg新鲜的桃叶片置于1.5ml离心管中，再向离心管中加入300ul 65°C预热的裂 解液，以及10 mg石英砂和维生素 C的混合物，用电动研磨仪将上述混合物研磨至匀浆状，再 加入400 ul裂解液和10 ul 2-巯基乙醇，涡旋混匀，65°C保温10分钟，期间颠倒混匀1-2次； (2) 将步骤(1)得到的混合液冷却至室温后，加入700 ul氯仿，剧烈震荡30秒，室温放置 2分钟;再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟； (3) 取400 ul上清转入另一个离心管中，加入100 ul的5M氯化钠，颠倒混勾，加入lml无 水乙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟;再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，彻底弃上清，保 留沉淀； (4 )在步骤(3 )的沉淀中加入400u 1 TE，用移液器吹打加速