一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β?内酰胺酶的方法
【专利摘要】本发明提供一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β?内酰胺酶的方法，β?内酰胺酶抗原40U/mL包被酶标板，0.8mg/ml的Rabbit Anti?LACTB按体积比1:800稀释，包被，体积分数5％BSA封闭酶标板，加待测样品，设阴性对照，100ug/ml的β?lactamase?Antibody按体积比1:3000稀释，孵育；1mg/ml羊抗鼠lgG?HRP体积比1:5000稀释加入，孵育；TMB单组份显色液显色；终止反应，测OD450nm，通过待测样品平均OD值与阴性对照组OD值比判定样品中β?内酰胺酶浓度阴性或阳性。该方法具有检测速度快、灵敏度高、操作简单等优点。
【专利说明】
一种优化的用双抗体夹心EL ISA法检测β-内酰胺酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及β-内酰胺酶的检测方法，具体是一种优化的用双抗体夹心ELISA法检 测内酰胺酶的方法。
【背景技术】
[0002] β-内酰胺酶可以裂解牛奶中青霉素、头孢菌素类抗生素，使这些类抗生素在牛奶 中减少或者去除，所以又被称为"解抗剂"。青霉素、头孢菌素类抗生素等被内酰胺酶裂解 后生成青霉噻唑酸等，青霉素噻唑酸与蛋白质结合成青霉噻唑蛋白，它是引起青霉素过敏 的主要物质之一，从而使有过敏体质的人出现皮肤瘙痒、呼吸困难等症状。2009年，我国卫 生部公布了《食品中可能违法添加的非食品用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第二 批)》，其中就含有β-内酰胺酶。
[0003] 目前，国内外对β-内酰胺酶的检测方法研究还处于初始阶段，牛乳中β-内酰胺酶 的检测方法有:杯碟法、碘量法、酸度定量法、高效液相色谱法等，但这些方法存在耗时长， 假阴性和假阳性现象，成本高等缺点，而双抗体夹心酶联免疫法可以有效的检测抗原，具有 检测速度快、灵敏度高、操作简单等优点。因此，本实验利用1^131^丨411^-1^(^8和0-lactamase-Antibody(8A5.A10)建立双抗体夹心ELISA检测方法，为β-内酰胺酶的检测及有 管部门提供了快速有效的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β-内酰胺酶的方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006] 双抗体夹心法具体操作是一种基于抗原抗体反应检测抗原的技术，将特异性抗体 结合到固相载体上形成固相抗体，然后加入待测抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶 标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，通 过酶标仪测定0D值从而判断抗原的含量。具体步骤为：
[0007] 1)包被β-内酰胺酶抗原:β-内酰胺酶抗原包被于酶标板上，每孔100yL，4°C过夜， 次日洗板；
[0008] 2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL7孔包被酶标板，4 °(：孵育过夜，次日洗板；
[0009] 3)封闭：用封闭液封闭酶标板，每孔200yL，37°C孵育2h，洗板；
[0010] 4)加样:加入待测样品，同时设阴性对照，每孔100yL，每份样品至少加双孔，37°C 孵育lh，洗板；
[0011] 5)加单克隆抗体：浓度为 100ug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase-Antibody: PBS缓冲液体积比1: 3000的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版，每孔100μ 1，37°(：孵育111，洗板；
[0012] 6)加酶标二抗:加入羊抗鼠 lgG-HRP，每孔lOOyL，37 °C孵育lh，洗板；
[0013] 7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100yL，室温下避光显色约15min;
[0014] 8)终止反应:每孔加入终止液50yL终止反应，于终止反应后20min内测定实验结 果。
[00?5] 9)测定OD45〇nm:用酶标仪测定450nm的0D值当P/N^： 2.1时，判定样品为阳性，当P/N < 2.1时，判定样品为阴性，其中P为待测样品平均0D值，N为阴性对照组0D值，P/N = 2.1时β-内酰胺酶浓度为25U/ml。
[0016] 上述洗板为:弃去酶标板中剩余液体，用洗涤液250μLν孔洗涤酶标板，每孔洗涤3 次，每次3-5min，在滤纸上拍干；
[0017] 所述封闭液为体积分数5%BSA、体积分数7.5%BSA、体积分数2.5%BSA、质量分数 5%脱脂奶粉、体积分数1%BSA、质量分数1%脱脂奶粉中的一种或二种以上，所述洗涤液为 ρΗ7·4,，0·15Μ的PBS;所述终止液为2M H2SO4。
[0018] 所述β-内酰胺酶抗原包被浓度为40U/mL，为用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内 酰胺酶从200U/mL稀释到40U/mL所得。
[0019] 所述的酶标二抗为将lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用PBS缓冲液按羊抗鼠 lgG-HRP:PBS 缓冲液体积比1:5000稀释所得。
[0020] 所述的封闭液优选为体积分数5%BSA。
[0021] 所述TMB单组份显色液主要成分是3，3 '，5，5 ' -四甲基联苯胺。
[0022]本发明对双抗体夹心ELISA法进行优化，分别对多克隆抗体的包被时间和稀释倍 数，单克隆抗体稀释倍数，酶标抗体孵育时间与稀释浓度的确定，封闭液条件，底物作用时 间等进行选择，根据实验条件选择最佳条件。
[0023]实验得出抗体包被时间不能太短，时间太短抗体与酶标板结合会不是很稳固，影 响实验结果，所以本实验采用4°C过夜，pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液作为包被液，加强结合能 力。而且单克隆抗体和酶标二抗进行稀释倍数优化，选择最佳的稀释倍数用于试验，排除由 于单克隆抗体和酶标二抗浓度不适造成的不确定因素。还需要对封闭时间和底物作用时间 进行测定，从而确定最佳反应条件，经重复性评价，证明本发明提供的方法重复性良好，本 方法检测最低浓度为25U/mL，因此本发明建立了稳定的双抗体夹心ELISA检测方法。
【附图说明】
[0024]图1抗原最佳浓度的曲线；
[0025]图2多克隆抗体和单克隆抗体工作浓度的选择；
[0026]图3酶标抗体工作条件的选择；
[0027]图4封闭液的选择；
[0028] 图5封闭时间的选择；
[0029] 图6底物作用时间的选择；
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0031] 实施例1最佳工作条件的确定：
[0032] (1 )β_内酰胺酶抗原最佳包被浓度的确定：
[0033] 采用棋盘方阵的方法，按图1所示组合进行试验：
[0034] 1)包被β-内酰胺酶抗原：用0.01Μ ρΗ9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶从200U/mL稀 释包被于酶标板上（稀释浓度梯度为30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL)，每孔1 OOyL，4°C过 夜，次日洗板；
[0035] 2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti- LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL7孔包被酶标板，4 °(：孵育过夜，次日洗板；
[0036] 3)封闭：用5 % BSA封闭液封闭酶标板，每孔200yL，37 °C孵育2h，洗板；
[0037] 4)加样：用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶稀释到200U/mL替代实施例1 中的待测样品，同时设阴性对照(磷酸盐缓冲液），每孔l〇〇yL，每份样品加5孔，37°C孵育lh， 洗板；
[0038] 5)加单克隆抗体：浓度为 100ug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase-Ant ibody: PBS 缓冲液体积比 1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500的比例 进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版，每孔l〇〇yL，37°C孵育lh，洗板；
[0039] 6)加酶标二抗:将lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用PBS缓冲液按羊抗鼠 lgG-HRP: PBS缓 冲液体积比1:5000稀释，每孔100yL，37 °C孵育lh，洗板；
[0040] 7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100yL，室温下避光显色约15min;
[0041 ] 8)终止反应:每孔加入2M H2S〇4终止液50yL终止反应，于终止反应后20min内测定 实验结果。
[0042] 9)测定OD45〇nm:用酶标仪测定450nm的0D值，选择接近1，对照阴性值小于0 · 2，P/N 值最大时的抗原为最佳浓度。其中P为待测样品0D值，N为阴性对照组0D值。
[0043]单克隆抗体分别做 1: 500、1:1000、1:1500、1: 2000、1:2500、1: 3000、1: 3500稀释、 1:5000稀释酶标二抗，然后通过酶标仪测定0D450nm值和P/N值。选择接近1，对照阴性值小 于0.2，P/N值最大时的抗原为最佳浓度。
[0044]如图1所示，抗原包被浓度最佳为40U/mL。
[0045] (2)单克隆抗体和多克隆抗体最佳工作浓度的确定：
[0046] 采用棋盘方阵的方法，按照图2所示组合进行试验：
[0047] 1)包被β-内酰胺酶抗原：用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶从200U/mL稀 释到40U/mL包被于酶标板上，每孔100yL，4 °C过夜，次日洗板；
[0048] 2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti- LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:500、1:600、1:700、1:800、1:900的比例进行稀释，稀释后的 溶液1 〇〇μLν孔包被酶标板，4 °C孵育过夜，次日洗板；
[0049] 3)封闭：用5 % BSA封闭液封闭酶标板，每孔200yL，37 °C孵育2h，洗板；
[0050] 4)加样：用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶稀释到200U/mL替代实施例1 中的待测样品，同时设阴性对照(磷酸盐缓冲液），每孔l〇〇yL，每份样品加5孔，37°C孵育lh， 洗板；
[0051 ] 5)加单克隆抗体：浓度为 lOOug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase- Ant ibody: PBS 缓冲液体积比 1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500的比例 进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版，每孔l〇〇yL，37°C孵育lh，洗板；
[0052] 6)加酶标二抗:将lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用PBS缓冲液按羊抗鼠 lgG-HRP: PBS缓 冲液体积比1:5000稀释，每孔100yL，37 °C孵育lh，洗板；
[0053] 7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100yL，室温下避光显色约15min;
[0054] 8)终止反应:每孔加入2M H2S〇4终止液50yL终止反应，于终止反应后20min内测定 实验结果。
[0055] 9)测定OD45〇nm:用酶标仪测定450nm的0D值，选择接近1，对照阴性值小于0 · 2，P/N 值最大时的抗原为最佳浓度。其中P为待测样品0D值，N为阴性对照组0D值。
[0056] 上述洗板为:弃去酶标板中剩余液体，用pH7.4,，0.15MPBS洗涤液250yL/孔洗涤酶 标板，每孔洗涤3次，每次3min，在滤纸上拍干；
[0057] 从图2中可以看出，当多克隆抗体稀释到1:800,单克隆抗体稀释到1:3000时，P/N 值最高，灵敏度最高。因此，选取多克隆抗体1:800，单克隆抗体1:3000作为工作浓度。
[0058] (3)酶标抗体孵育时间与稀释浓度的确定：
[0059] 步骤为按照棋盘方阵的方法，按照图3所示组合进行试验，确定酶标抗体孵育时间 与稀释浓度：
[0060] 1)包被β-内酰胺酶抗原：用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶从200U/mL稀 释到40U/mL包被于酶标板上，每孔100yL，4 °C过夜，次日洗板；
[0061 ] 2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti- LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL7孔包被酶标板，4 °(：孵育过夜，次日洗板；
[0062] 3)封闭：用5 % BSA封闭液封闭酶标板，每孔200yL，37 °C孵育2h，洗板；
[0063] 4)加样:加入待测样品，同时设阴性对照(磷酸盐缓冲液），每孔100yL，每份样品加 5孔，37°C孵育lh，洗板；
[0064] 5)加单克隆抗体：浓度为 100ug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase-Antibody: PBS缓冲液体积比1: 3000的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版，每孔100μ 1，37°(：孵育111，洗板；
[0065] 6)加酶标二抗：lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用roS缓冲液按羊抗鼠 lgG-HRP: roS缓冲 液体积比1: 3000、1:4000、1: 5000、1:6000、1: 7000稀释，每孔100yL，孵育时间分别为37°C 30min、37°Clh、37°C2h，洗板；
[0066] 7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100yL，室温下避光显色约15min;
[0067] 8)终止反应:每孔加入2M H2S〇4终止液50yL终止反应，于终止反应后20min内测定 实验结果。
[0068] 9)测定OD45〇nm:用酶标仪测定450nm的0D值。
[0069] 上述洗板为:弃去酶标板中剩余液体，用pH7.4,，0.15MPBS洗涤液250yL/孔洗涤酶 标板，每孔洗涤3次，每次3min，在滤纸上拍干；
[0070]从图3中可以看出，当多克隆抗体稀释为1:800,单克隆抗体稀释为1:3000，其他条 件不变的情况下，酶标抗体以1:5000，37°C lh时P/N值最高，估选择此条件为最适稀释浓度 和反应时间。
[0071] (4)封闭液种类的确定：
[0072] 步骤为按照棋盘方阵的方法，按图4所示组合方式，确定封闭液种类。抗原、多克隆 抗体、单克隆抗体、酶标二抗均选择上述实验确定的最佳浓度和反应时间等条件，将封闭液 分别选择质量分数1%脱脂奶粉、质量分数5%脱脂奶粉、体积分数体积分数1%BSA、体积分 数2.5 % BSA、体积分数5 % BSA、体积分数7.5 %BSA进行封闭，每孔200yL，37 °C孵育2h，其他 步骤和条件同（3)，通过酶标仪测定0D45Q值，根据P/N值分析选出最佳工作浓度。
[0073] 从图4中可以看出，当多克隆抗体稀释为1:800,单克隆抗体稀释为1:3000，酶标抗 体以1:5000，其他条件不变的情况下，结果显示5%83厶(？/^)>7.5%83厶(？/^)>2.5%83厶(卩/ N)>5%脱脂奶粉(P/N)>1%BSA(P/N)>1%脱脂奶粉(P/N)，因此，选择5%BSA为封闭液。 [0074] (5)封闭时间的确定：
[0075]步骤为按照棋盘方阵的方法，按图5所示组合方式，确定封闭液时间。在上述(4)基 础上，用最佳封闭液封闭，并在37 °C下分别孵育lh、1.5h、2h、2.5h、3h，其他步骤和条件同 (4)，通过酶标仪测定0D45Q值，根据P/N值分析选出最佳工作浓度。
[0076] 从图5中可以看出，当多克隆抗体稀释为1:800,单克隆抗体稀释为1:3000，封闭液 为5%BSA，酶标抗体以1:5000，其他条件不变的情况下，封闭时间371€211(?/^)>37 1€311(?/ N)>37°C2.5h(P/N)>37°C1.5h(P/N)>37°Clh(P/N)。估选择 37°C 封闭 2h 为最佳的封闭时间。 [0077] (6)底物作用时间的确定：
[0078]步骤为按照棋盘方阵的方法，按图6所示组合方式，确定底物作用时间。采用上述 (1 )-(5)选出的最佳反应条件，避光情况下底物显色时间分别选取lOmin、15min、20min、 25min、30min，底物显色后在向每孔中加入50yL的2M H2S〇4终止液，然后用酶标仪测定OD450 值，其他步骤和条件同（5 )，确定出最适的底物作用时间。
[0079] 从图6中可以看出，当多克隆抗体稀释为1:800,单克隆抗体稀释为1:3000，封闭液 为5%BSA，封闭2h，酶标抗体以1:5000，其他条件不变的情况下，当底物作用1511^11时?/^值 最大，因此，室温15min是最适显色时间。
[0080] 实施例2
[0081 ] 1)包被内酰胺酶抗原:内酰胺酶抗原包被于酶标板上，每孔l〇〇yL，4°C过夜， 次日洗板；
[0082] 2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL7孔包被酶标板，4 °(：孵育过夜，次日洗板；
[0083] 3)封闭：用5 % BSA封闭液封闭酶标板，每孔200yL，37 °C孵育2h，洗板；
[0084] 4)加样:加入待测样品，同时设阴性对照(磷酸盐缓冲液），每孔100yL，每份样品加 5孔，37°C孵育lh，洗板；
[0085] 5)加单克隆抗体：浓度为 100ug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase-Antibody: PBS缓冲液体积比1: 3000的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版，每孔100μ 1，37°(：孵育111，洗板；
[0086] 6)加酶标二抗:加入将羊抗鼠 lgG-HRP，每孔100yL，37 °C孵育lh，洗板；
[0087] 7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100yL，室温下避光显色约15min;
[0088] 8)终止反应：每孔加入2M H2S〇4终止液50yL终止反应，于终止反应后20min内测定 实验结果。
[0089] 9)测定OD45〇nm:用酶标仪测定450nm的0D值当Ρ/Ν>2· 1时，判定样品为阳性，当P/N < 2.1时，判定样品为阴性，其中P为待测样品平均0D值，N为阴性对照组0D值，P/N = 2.1时β-内酰胺酶浓度为25U/ml。
[0090] 上述洗板为:弃去酶标板中剩余液体，用PH7.4,，0.15MPBS洗涤液250μLν孔洗涤酶 标板，每孔洗涤3次，每次3min，在滤纸上拍干;所述洗涤液为ρΗ7.4，，0.15Μ的roS;所述终止 液为2M H2SO4。
[0091] 实施例3
[0092]在实施例2的基础上步骤1)中β-内酰胺酶抗原包被浓度为40U/mL，为用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶从200U/mL稀释到40U/mL所得。
[0093] 实施例4
[0094]在实施例3的基础上，酶标二抗为将lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用roS缓冲液按羊抗 鼠 lgG-HRP: PBS缓冲液体积比1:5000稀释所得。
[0095] 实施例5
[0096] 在实施例4的基础上，封闭液优选为体积分数5%BSA。
[0097] 实施例6重复性评价：
[0098] (1)重复性批内试验
[0099] 选取同批已组装好的酶标板，4份不同的待测样品（阳性样品和阴性样品）按实施 例5步骤进行检测，同一酶标板内每个样品进行5次平行试验，按照已建立好的ELISA操作程 序，进行ELISA测定，测0D 45Q值，进行统计分析结果，其变异系数在2.22%~7.14%，小于 10 %，变异程度很小，重复性好，表1。
[0100] 表1组内重复性试验
[0101]
[0102] (2)重复性批间试验
[0103] 选用5个不同时间制定的包被平板，在相同的条件下对4份不同的待测样品（阳性 样品和阴性样品）按实施例1步骤进行检测，按照已建立好的ELISA操作程序，进行ELISA测 定，计算同一份检测样本0D450值的变异系数，统计分析结果，变异系数在2.01%~8.03%， 小于10 %。说明重复性好，可进行试验，表2。
[0104] 表2组间重复性试验
[0106] 四、敏感性评价
[0107] 从β-内酰胺酶标准溶液200U/mL进行稀释，稀释成不同的浓度（150、100、75、50、 25、2〇1]/1111)，用所建立的双抗体夹心机154法测定〇〇45〇值，？/^=2.1时0-内酰胺酶浓度为 25U/ml，检测最低浓度为25U/mL，当P/N彡2.1时，判定样品为阳性，当P/N<2.1时，判定样品 为阳性。
【主权项】
1. 一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β-内酰胺酶的方法，其步骤如下： 1) 包被β-内酰胺酶抗原:β-内酰胺酶抗原包被于酶标板上，每孔l〇〇yL，4 °C过夜，次日 洗板； 2) 包被多克隆抗体:将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB: 碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL孔包被酶标板，4°C孵育 过夜，次日洗板； 3) 封闭：用封闭液封闭酶标板，每孔200yL，37°C孵育2h，洗板； 4) 加样:加入待测样品，同时设阴性对照，每孔100yL，每份样品至少加双孔，37°C孵育 lh，洗板； 5) 加单克隆抗体：浓度为 100ug/ml 的β-lac tamase-Ant ibody 按β-lac tamase-Antibody: PBS缓冲液体积比1: 3000的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版，每孔100μ 1，37°(：孵育111，洗板； 6) 加酶标二抗:加入羊抗鼠1 gG-HRP，每孔100yL，37 °C孵育lh，洗板； 7) 显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100yL，室温下避光显色约15min; 8) 终止反应:每孔加入终止液50yL终止反应，于终止反应后20min内测定实验结果； 9) 测定OD45〇nm:用酶标仪测定450nm的0D值，当P/N》2.1时，判定样品为阳性，当P/N< 2.1时，判定样品为阴性，其中P为待测样品平均0D值，N为阴性对照组0D值，P/N=2.1时β-内 酰胺酶浓度为25U/ml，为本方法最低检测浓度； 上述洗板为:弃去酶标板中剩余液体，用洗涤液250μ!7孔洗涤酶标板，每孔洗涤3次，每 次3_5min，在滤纸上拍干。2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述封闭液为体积分数5%BSA、体积分数 7.5 % BSA、体积分数2.5 % BSA、质量分数5 %脱脂奶粉、体积分数1 % BSA、质量分数1 %脱脂 奶粉中的一种或二种以上，所述洗涤液为PH7.4，，0.15M的PBS;所述终止液为2M H2S〇4。3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述β-内酰胺酶抗原包被浓度为40U/mL。4. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶标二抗即羊抗鼠 lgG-HRP为将 lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用roS缓冲液按羊抗鼠 lgG-HRP: roS缓冲液体积比1: 5000稀释所 得。5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的封闭液为体积分数5 %BSA。
【文档编号】G01N33/577GK106093403SQ201610356629
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】于国萍, 邵美丽, 岳崇慧, 吴昊, 藏小丹, 范美婧, 陈媛, 陈超, 王艳菲
【申请人】东北农业大学