重组人α1-抗胰蛋白酶的制作方法

专利名称：重组人α1-抗胰蛋白酶的制作方法
重组人α 1-抗胰蛋白酶本发明涉及医药产品领域，具体是涉及重组人α 1-抗胰蛋白酶，该酶尤其可用于 α 1-抗胰蛋白酶缺乏相关肺气肿的预防和/或治疗。
背景技术：
α 1-抗胰蛋白酶(AAT)或α 1_蛋白酶抑制剂(α 1ΡΙ)是由活化嗜中性粒细胞释放的蛋白酶天然抑制剂。AAT是由394个氨基酸组成的糖蛋白，并具有52kD的分子量。人 AAT表达为418个氨基酸的前体，其中M个氨基酸的前体被切除以产生394个氨基酸的终产物。AAT主要在肝脏中合成，但也显示了其在嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中的表达。由于嗜中性粒细胞蛋白酶在肺中不可抗及破坏性的作用，低或零血浆AAT水平构成了肺气肿发生的一个风险因子。已经开发了 AAT增加疗法用于AAT缺乏相关肺气肿的预防和/或治疗(Mulgrew等人，2007)。目前，用高剂量的血浆来源(pd)AAT(60mg/kg/周；来自Talecris的Prolastin 、来自Baxter的Aralast 以及来自ZLB的Zemaira )治疗患有AAT缺乏相关肺气肿的患者。为了缓解AAT缺乏相关肺气肿，需要大量及频繁的AAT注射。对血浆来源材料的主要担忧是制备物的安全性。与所有的人源材料一样，PdAAT潜在的风险为朊病毒或其它外来物质的污染。第二个担忧是血浆材料有限的可得性。人血浆来源AAT在第46、83和247位的Asn残基含有三个N-连接聚糖。这些聚糖主要由二触角和三触角结构组成。重组蛋白质上的聚糖的高度唾液酸化对最优的药物动力学(PK)具重要性。至今在大多数重组平台中的低表达限制了 AAT的重组生产(KarnauWiova等人， 2006)。重组AAT已在转基因系统中高水平地产生，但是因为其不理想的药物代谢动力学 (PK)及由于非人污染的安全性问题，其临床开发已被停止(Spencer等人，2005)。因此存在着对有活性的、能足量获取的并具有有用的药物动力学特性的重组人 AAT的需求。发明概述根据本发明，已经显示具有适宜的药物动力学谱的重组人α 1-抗胰蛋白酶 (rhAAT)可以在PER. C6细胞中大量产生。在导致了本发明的研究中，在无血清条件下产生了表达人AAT且共表达α-2， 3-唾液酸转移酶(SB)或α-2，6_唾液酸转移酶(ST6)的细胞系。该细胞系能够表达高水平的rhAAT。因此，达到了多达每细胞每天(pcd) 22皮克rhAAT的产量。重要的是，本发明的rhAAT显示了其具有作为嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的活性。对聚糖谱的分析显示了良好的唾液酸覆盖(cap)总体程度。有趣的是，与血浆来源AATO^rolastin )相比， 注意到本发明的rhAAT中四触角型聚糖的增加。此外，与血浆来源AAT相比，在共表达ST3 的细胞中产生的rhAAT在大鼠中显示了增加的平均残留时间(MRT)。而与血浆来源AAT相比，在共表达ST6的细胞中产生的rhAAT显示了减少的平均残留时间。一方面，本发明因此提供了包含N-连接聚糖的重组人α 1-抗胰蛋白酶(rhAAT)，其中(a)所述N-连接聚糖的至少10%为四触角型聚糖；和(b)在所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度(Z/A)为至少50%。在另一个实施方案中，所述N-连接聚糖的至少20%为四触角型聚糖。在另外的实施方案中，在所述四触角型N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度为至少 30%。在另外的实施方案中，所述N-连接聚糖上总唾液酸化的至少50%为α-2，3_唾液酸化。优选的，所述N-连接聚糖上总唾液酸化的至少90%为α-2，3_唾液酸化。另一方面，本发明提供了制备物和药物组合物，其包含所述rhAAT，以及任选地一或多种药物学可接受的赋形剂。另一方面，本发明涉及所述rhAAT、包含所述rhAAT的制备物和/或药物组合物在预防和/或治疗尤其是AAT-相关的肺气肿和/或具有嗜中性粒细胞介导的组织损伤的炎症性疾病中的用途。在另外的实施方案中，本发明提供了用于产生重组人α 1-抗胰蛋白酶的方法，其包括以下步骤给PER. C6细胞提供编码人α -1抗胰蛋白酶的核酸以使得所述PER. C6细胞含有可表达形式的所述核酸；在有助于所述重组人AAT产生的条件下培养所述PER. C6细胞，其中所述PER. C6细胞被修饰为共表达α-2，3_唾液酸转移酶或α_2，6_唾液酸转移酶。附图简述

图1.过表达α -2，3-唾液酸转移酶的细胞系(A :PER. C6-AAT-ST3)和过表达α-2，6_唾液酸转移酶的细胞(B :PER. C6-AAT-S)分批培养的单位生产率(specific productivity)的频率分布。图2. PER. C6-rAAT (未纯化的)样品的细胞培养收获物的4_12 % BIS-Tris SDS-PAGE凝胶，其用胶体蓝染色。图3.通过Z/A比测定AAT上聚糖的唾液酸化程度的检测方法的原理综述。图4.表达AAT的PER. C6细胞系的单位生产率与PER. C6_rAAT的聚糖的唾液酸化程度不相关(Spearman，s r = -0. 024，ρ = 0. 893)。( :PER. C6-AAT-ST3 ；〇PER. C6-AAT-ST6)。图5.来源于ECL阴性样本的PER. C6_rAAT的聚糖的唾液酸化(图5A)和触角类型(图5B)，其与来源于ECL阳性FIG样本的PER. C6_rAAT和Prolastin 相比。图6. PER. C6-rAAT-ST3的所有聚糖上(图6A)和四触角型聚糖上(图6B)的唾液酸化程度，其与PER. C6-rAAT-ST6和ftOlastin 的聚糖相比。图7.在缓冲液(PBS/T)中或在PER. C6-CM中多种剂量的Prolastin 向大鼠静脉注射给药后的血浆浓度-时间谱。■ :PER. C6-CM 中的 Polastin , 50 μ g/kg ;▲ :PER. C6-CM 中的 Prolastin ， 100 μ g/kg ；· :PER. C6-CM 中的 Prolastin , 200 μ g/kg ；〇PBS/T 中的 Prolastin ， 2000 μ g/kg。图 8. PER. C6-rAAT-ST3、PER. C6_rAAT_ST6 和 Prolastin 的血浆浓度-时间谱。▲ :PER. C6-rAAT-ST3, MRT 18-23 小时；· :PER. C6_rAAT_ST6，MRT 4-4 小时；參 Prolastin, MRT 11-12 小时。图9. AAT 表达载体 pAATopt-ST3 (A)和 pAATopt_ST6 (B)的质粒图谱。CMV =巨细胞病毒启动子，BGHp(A)=牛生长激素聚腺苷酸化序列，fl ori = fl复制起始位点，SV40 =猴病毒40启动子，Neo =新霉素抗性标记，SV40p(A)=猴病毒40聚腺苷酸化序列，AAT =α 1-抗胰蛋白酶，ColEl = ColEl复制起始位点，Amp =氨苄青霉素抗性标记，SIAT4C = ST3的编码基因=人唾液酸转移酶IV(L23767)(图9A)，SIATl = ST6的编码基因=人唾液酸转移酶 I (NM_003032)。发明详述α 1-抗胰蛋白酶(AAT)是一类由活化的嗜中性粒细胞释放的天然蛋白酶抑制剂。 AAT被分泌入血浆，但其主要的作用部位是在肺实质中。人白细胞弹性蛋白酶(HLE)(也被称为人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE))是一类由嗜中性粒细胞的噬天青颗粒作为一般炎症反应的一部分而释放的丝氨酸蛋白酶。在正常的内环境稳定的条件下，AAT是人白细胞弹性蛋白酶(HLE)所引起的蛋白质水解的重要调节剂，从而预防了肺泡基质的损伤。除了 HLE, AAT还抑制其它两种由嗜中性粒细胞释放进肺部的蛋白酶，即组织蛋白酶G(catG)和蛋白酶3 0^3)。已开发了血浆来源的 AAT产品如Prolastin (Talecris) >Aralast (Baxter) 和kmaira (g) (ZLB)，并且目前应用于治疗患有AAT-缺乏(即拥有低或零血浆AAT水平) 相关肺气肿的患者。一般每名患者都需要大量的(大约60mg/kg/week)该产品。除了肺气肿，AAT还是具有嗜中性粒细胞介导的损伤的炎症性疾病的(潜在)疗法。在大多数重组平台的低表达限制了 AAT的重组生产(如大肠杆菌中) (KarnauWiova等人，2006)。重组AAT已在转基因系统中高水平地产生，但是因为其不理想的药物动力学(PK)及由于非人污染的安全性问题，其临床开发已被停止(Spencer等人， 2005)。现在本发明提供了拥有合适药物动力学特性并可以在如PER. C6细胞中被大量产生的重组人α 1-抗胰蛋白酶(rhAAT)。本发明的重组AAT已被显示为有功能活性的(通过基于对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制的显色测定来确定)，并且与血浆来源AAT产品如Prolastin 相比具有有前景的药物动力学特性。本发明因此提供了包含N-连接聚糖的rhAAT，其中a)所述N-连接聚糖的至少10%为四触角型聚糖；和b)所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度(Z/A)为至少50%。N-连接聚糖为与多肽的天冬酰胺残基共价连接的糖链(Varki等人，1999)。N-糖基化的过程开始于一个多萜醇寡糖前体向天冬酰胺前体的附着。随后该前体被修饰为高甘露糖的、杂合的或复杂型的寡糖。在复杂型的N-连接糖中，α 3-和α 6-连接的甘露糖残基都被N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基取代。复杂型N-聚糖可以包含二到五个带有GIcNAc 的分支，其被称为触角。复杂型N-连接糖的最终结构可能变化极大并且依赖于它们所附着的蛋白质、宿主细胞以及培养宿主细胞的条件。带有GlcNAc的分支可以用半乳糖(foil)或 N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)修饰，形成所谓的LacNAc或LacdiNAc结构。还有，带有GlcNAc 的分支可以含有多个LacNAc结构，形成所谓的多乳糖胺结构。末端的半乳糖可以用α 2，3-或α 2，6-连接的唾液酸修饰，而末端的N-乙酰半乳糖胺只可能被α 2，6-连接的唾液酸修饰。末端的Gal或(ialNAc上唾液酸的添加由唾液酸转移酶介导。人类基因组编码可能超过20种不同的唾液酸转移酶(Harduin-Lepers等人，2001)。它们在底物特异性、组织分布和多种生化参数方面不同。天然的AAT有三个糖基化位点。因此，AAT包含三个可出现分支的N-连接聚糖。 这些聚糖可能有2、3或4个所谓的“触角”或分支。令人吃惊的是，已经显示本发明的rhAAT 的所述N-连接聚糖中的至少10%，优选大约10%至大约50%为四触角型聚糖。在另一个实施方案中所述N-连接聚糖中的至少20%为四触角型聚糖，优选所述N-连接聚糖中大约 20%至40%为四触角型聚糖。本发明已令人惊奇地显示了本发明的rhAAT在糖基化谱例如触角型方面，以及在药物动力学特性如平均残留时间方面与血浆来源AAT (如Prolastin )不同。由于在重组蛋白质上的聚糖的完全唾液酸化对最优的药物动力学特性具重要性， 在PER. C6细胞中本发明的rhAAT与唾液酸转移酶组合表达以获取高度唾液酸化的rhAAT 异构体。因此用α-2，3-唾液酸转移酶(PER. C6-ST;3)或α-2，6_唾液酸转移酶(PER. C6-ST6)共转化PER. C6细胞。在本发明一个优选的实施方案中，在所述N-连接聚糖上总唾液酸化的至少50%为α-2，3-唾液酸化。例如，在所述N-连接聚糖上总唾液酸化的至少50%、70%或80%为α-2，3-唾液酸化。而在另一个实施方案中所述N-连接聚糖上总唾液酸化的至少90%为α-2，3-唾液酸化。已经令人吃惊地显示在这些实施方案中与血浆来源AAT如ftOlastin⑧相比，本发明的rhAAT拥有不同的药物动力学特性，特别是延长了的平均残留时间。唾液酸化是指存在于AAT碳水化合物结构上的唾液酸残基的量α -2， 3-唾液酸化意思是指在2，3位上的唾液酸化，即α -2，3-连接的唾液酸(在本领域众所周知的)，而0-2，6_唾液酸化意思是指在2，6位上的唾液酸化，8卩α-2，6_连接的唾液酸(在本领域也是众所周知的)。因此“在所述N-连接聚糖上总唾液酸化的至少50%为α-2， 3-唾液酸化”，其意思是指在rhAAT中出现的唾液酸残基总数的至少50%是在2，3位唾液酸化。本发明在大鼠中的I3K研究已经显示，PER. C6-ST3 (rhAAT_ST3)产生的rhAAT 和PER. C6-ST6 (rhAAT-ST6)产生的rhAAT的平均残留时间(MRT)都显著地与血浆来源 AAT (Prolastin )不同。由此显示了 rhAAT_ST3在大鼠中MRT的范围为大约18-23个小时， 而ftOlastin 在大鼠中的MRT为大约11-12个小时。使用具有延长的MRT的rhAAT可以例如减少每位患者所需的剂量。相反地，与ftOlastin 相比，rhAAT-ST6在大鼠中的MRT却减少了(大约3-4个小时)。使用本发明的rhAAT-ST6可能是有利的由于有“更天然的”2， 6-唾液酸，其对应着血浆来源AAT (如ftOlastin )上的唾液酸连接。在减少的MRT会有好处的情况下rhAAT-ST6可能是更加有利的。如上所述，在重组蛋白质的聚糖上的唾液酸化程度对最优的药物动力学特性具重要性。在一个优选的实施方案中，本发明的rhAAT的所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的总程度(由Z/A比计算而来)因此为至少70%。更优选地，所述N-连接聚糖唾液酸覆盖的程度 (Z/A)为至少80%，甚至更优选所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度(Z/A)为至少90%。在进一步的实施方案中，所述四触角型的N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度为至少20%，如20%至65%。在所述四触角型的N-连接聚糖上相对低程度的唾液酸化可能产生与血浆来源AAT相比拥有减少的MRT的rhAAT产物。在另一个实施方案中，在所述四触角型的N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度为至少50 %，如50 %至97 %，优选至少60 %，更优选70%至95%。本实施方案中更高的唾液酸化水平可能有助于其相比血浆来源AAT的延长的MRT。本发明进一步提供了包含所述rhAAT，以及任选地一或多种药物学可接受的赋形剂的制备物和药物组合物。“药物学可接受的赋形剂”意思是指任何惰性物质，其与活性分子(如药物、试剂或蛋白质)相组合以制备适当的或便利的剂型。所述“药物学可接受的赋形剂”在所采用的剂量及浓度下对受体无毒性并且兼容包括所述活性分子的制剂中的其它成分。本发明的药物组合物可以配制成用于本领域技术人员所熟知的任何给药途径的多种组合物。所述药物组合物的最优给药途径的选择会受若干因素影响，包括如组合物中活性分子的理化特性、临床情况的紧急程度以及活性分子的血浆浓度与预期治疗效果之间的关系。本发明的制备物和药物组合物优选配制用于静脉给药或气雾给药。rhAAT的药物学合适的制剂可以根据本领域技术人员熟知的方法制备(见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 18 版，A. R. Gennaro, Ed. , Mack Publishing Company(1990) ；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer 禾口 L. Hovgaard, Eds. , Taylor 禾口 Francis (2000)；以及 Handbook of Pharmaceutical Excipients,第 3 版， A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press (2000))。一般地，药物组合物在生产和储存的条件下必须是无菌及稳定的。包含本发明 rhAAT的制备物和/或药物组合物可以为粉末状，以在输送前或输送时与适当的药物学可接受的赋形剂重组(reconstitution)。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，其从预先无菌过滤的溶液产生所述活性成分加上任意额外的所需成分的粉末。可选择地，本发明的rhAAT可以在溶液中并且在输送前或输送时可加入和/或混合入适当的药物学可接受的赋形剂以提供单位剂量注射剂型。所述rhAAT、包含所述rhAAT的制备物或药物组合物可以作为药物使用。所述 rhAAT、制备物或药物组合物可以适当地用于预防和/或治疗那些已经证明给予AAT是有益的疾病和/或紊乱。它们尤其可用于AAT-缺乏相关的肺气肿的预防和/或治疗(或其组合)。本发明的rhAAT、制备物或药物组合物可以进一步用于吸烟相关的肺气肿、囊肿性纤维化(CF)和慢性阻塞性肺病(COPD)的预防和/或治疗。由于AAT已经被描述为具有抗炎症及抗细胞凋亡的作用，本发明的rhAAT、制备物或药物组合物还可以用作抗炎剂。(Lewis 等人，2008 ；Koulmanda 等人，2008)在进一步的实施方案中，本发明提供了用于产生重组人α 1-抗胰蛋白酶的方法， 其包括以下步骤给PER. C6细胞提供编码人α 1-抗胰蛋白酶的核酸以使得所述PER. C6细胞携带可表达形式的所述核酸；在有助于所述重组人α 1-抗胰蛋白酶产生的条件下培养 PER. C6细胞，其中所述细胞还含有处于外源启动子控制之下的编码唾液酸转移酶的核酸序列，所述的唾液酸转移酶优选为α-2，6-唾液酸转移酶或α-2，3_唾液酸转移酶。在一个实施方案中，所述唾液酸转移酶为人唾液酸转移酶。然而，本发明的rhAAT还可以在其它哺乳动物细胞如293细胞中产生，其任选地共表达一个唾液酸转移酶。
在一个实施方案中，本发明提供了用于产生重组人α 1-抗胰蛋白酶的方法，其包括以下步骤给PER. C6细胞提供编码人α 1-抗胰蛋白酶核酸序列以使得所述PER. C6细胞携带可表达形式的所述核酸，其中所述细胞还含有处于外源启动子控制之下的编码唾液酸转移酶的核酸序列，所述的唾液酸转移酶优选为α-2，6_唾液酸转移酶或α-2，3-唾液酸转移酶；在无血清培养基中培养所述PER. C6细胞并使得所述人α 1-抗胰蛋白酶在所述细胞中表达；从所述细胞和/或所述培养基中收获所表达的人α I"抗胰蛋白酶；以及任选地纯化所述人α 1-抗胰蛋白酶的步骤。使用PER. C6细胞作为感兴趣的蛋白的生产平台在W000/63403中已被描述，该公开通过引用并入本文。如W000/63403所显示的，PER. C6细胞可以适当地用于重组蛋白质的生产。为了通过细胞培养实现重组蛋白质的大规模的(连续的)生产，优选采用能够无贴壁依赖生长的细胞。本发明中的细胞拥有这种能力。本发明的PER. C6细胞是来源于在 1996 年 2 月 29 日以 ECACC no. 96022940 保藏于 Center for Applied Microbiology and Research & European Collection of Cell Cultures(ECACC)的细胞的上游或下游传代或上游或下游传代的后代细胞(见，如U. S. Patent 5，994，128)。PER. C6细胞在工业过程中的用途已被广泛地描述(如在Nichola等人，2002中)，特别是在重组蛋白质生产中的用途被描述更多(如在Yallop等人，2005a和2005b中)。本发明的细胞，特别是PER. C6细胞，拥有额外的好处即它们可以在不含动物或人来源的血清或动物或人来源的血清组分的培养基中培养。因此，由于培养物中不存在额外的人或动物蛋白质，在安全性增加的同时，分离也更容易，并且该系统非常可靠(合成培养基在重复性方面是最好的)。另外，腺病毒载体Early区域1A( “E1A”)的存在添加了另一水平的优势(与缺少该特定基因的(人)细胞系相比)。已知ElA作为转录激活剂增强来自 CMV即刻早期基因(immediate early gene)的增强子/启动子的转录(Olive等人，1990， Gorman等人，1989)。当要产生的重组蛋白质处于CMV增强子/启动子控制下的时候，其表达水平在所述细胞中提高而在缺少ElA的细胞中不提高。一般来说，在宿主细胞(如PER. C6细胞)中重组蛋白质(如rhAAT)的产生包括可表达形式的核酸向宿主细胞中的导入、在有助于所述核酸表达的条件下培养细胞以及使得所述核酸在所述细胞表达。或者，在所需的宿主细胞中天然表达但不处于足够水平的蛋白质可以通过导入适当的调节序列(如可操作地与所需基因关联的强启动子)而以提高的水平表达(见如WO 99/05沈8，其中通过导入强启动子到内源的EPO基因的上游而在人细胞中过表达该基因)。可表达形式的编码AAT的核酸可以是表达盒的形式，而且通常需要能够引起所述核酸表达的序列，如增强子、启动子、聚腺苷酸化信号等等。若干启动子可用于重组核酸的表达，这些启动子可能包括病毒启动子、哺乳动物、合成启动子等等。在某些实施方案中，驱动感兴趣的核酸表达的是CMV即刻早期启动子，例如包括CMV即刻早期基因增强子/启动子的nt. -735到+95，因为该启动子已被证实在表达腺病毒ElA的细胞中能带来高表达水平(见如WO 03/051927)。感兴趣的核酸可能是基因组DNA、cDNA、合成的DNA、上述的组合寸。细胞培养基可以从不同的供应商处得到，而且现今无血清培养基常被用于细胞培养，因为它们比含血清的培养基更加明确。本发明的细胞在含血清培养基中以及无血清培养基中同样生长良好。本发明的细胞在含血清培养基中通常贴壁生长，但非常适合于在无血清培养基中悬浮生长至高细胞密度(10X106CellS/ml及更高)，这意味着它们并不需要表面来附着，而是在大部分的时间其互相之间以及与培养容器壁之间保持相对的自由。培养本发明的细胞至高浓度和/或从这些细胞获取非常高的产品产量的方法已被描述(W0 2004/099396)。通过遗传工程改变在细胞中产生的重组蛋白的糖基化的概念已经被详细地确立， 并在例如US 2005/0164386中被详细讨论过。为此，可表达形式的编码所需的糖基化酶的核酸被导入或已经被导入到本发明的细胞中，而且在培养本发明的细胞的过程中，当感兴趣的蛋白表达的时候，所需的糖基化酶被表达。与没有重组糖基化酶在细胞中表达时的情况相比较，这导致了感兴趣的蛋白的改变的糖基化模式。在本发明中，所述糖基化酶为唾液酸转移酶，更优选α-2，3-唾液酸转移酶和/或α-2，6-唾液酸转移酶。优选地，所编码的唾液酸转移酶是哺乳动物唾液酸转移酶，更优选为人唾液酸转移酶。编码唾液酸转移酶的核酸优选置于外源启动子的控制下，该启动子应该是具活性的或在本发明的细胞中拥有被调节的可能性。优选地，编码唾液酸转移酶的核酸被整合进细胞的基因组中，以保证稳定的遗传，并在细胞后续的世代中提供唾液酸转移酶稳定的表达。本发明进一步提供重组人ΑΑΤ，其可以根据本发明的方法获得。根据本本发明，所述rhAAT具有与分离的天然人对应蛋白质不同的人糖基化模式。本发明特别提供了包含 N-连接聚糖的rhAAT，其中所述N-连接聚糖的至少10%是四触角型聚糖。另外，根据本发明可获取的rhAAT拥有令人吃惊的药物动力学特性。本发明的重组人AAT包括全长的人AAT，但也可以涵盖生物学活性多肽片段，如具有一或多个氨基酸缺失(如在蛋白质的N-端)的人AAT的片段，以及生物学活性人AAT变体，如具有一或多个氨基酸取代(如保守取代)、一或多个氨基酸缺失或添加的AAT，其不显著改变该蛋白质的功能活性。在一个实施方案中，本发明的rhAAT包括在本文中以SEQ ID No :1提供的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT变体的氨基酸序列与SEQ ID No :1至少有 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同源性。通过下述非限制性的实施例来进一步说明本发明。
实施例实施例1细胞系产生和单位生产率如WO 2006/070011所述，在无血清条件下生成了七百个表达人AAT并共表达 α 2，6-唾液酸转移酶(SIAT1 ；ΝΜ_003032)或α 2，3-唾液酸转移酶6^^4(:^23767)的 PER. C6 细胞系(PER. C6-AAT-ST3/PER. C6-AAT. ST6)。依据用 ELISA(AAT Elisa Kit, US Biologicals)检测的最高产量，从使用核转染作为转染工具的独立细胞系的产生程序选择出产生AAT-ST3 (27个细胞系)或产生AAT-ST6 (20个细胞系)的47个无血清PER. C6细胞系。表达质粒含有人AAT的编码序列(SEQ ID NO 2)和人ST3GalIV的编码序列，都由巨细胞病毒启动子驱动，该启动子被修饰以在PER. C6细胞中实现高水平的基因表达Wallop等人，2005)。AAT表达载体的质粒图谱(pAATopt-ST3和pAATopt_ST6)在图9中显示。所述细胞系的产率在每细胞每天(pcd) 8-22皮克(PER. C6-AAT-ST3)和7-19皮克8/14 页
(PER. C6-AAT-ST6)之间(见图1及表1和2)。所述细胞系在Proper-I培养基(Lonza)中冷冻保存(6小瓶，3-5xl06cells/ml)，其满足所有的验收标准(存活> 80%，复苏后良好生长两代)。产生了用于生化分析(见实施例2)的批量培养物(在ftOper-l培养基中)。实施例2生化分析PER. C6-rAAT 的完整性47个分批培养物的上清液使用SDS-PAGE分析，胶体蓝染色。PER. C6_rAAT (未纯化的)样品的细胞培养收获物显示了 AAT是SDS-PAGE上主要的蛋白质条带。进而，凝胶显示了完整的AAT条带(图2所示)，提示了材料的完整性。PER. C6-rAAT 的活性首先(代替显色活性测定)，通过分析PER. C6-rAAT与人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶复合物的形成而确定对活性的指示。为此，PER. C6-rAAT样品的细胞培养收获物与0、0. 1、 0. 2和0. 4 μ g弹性蛋白酶在37度温浴30分钟，随后实施4-12% BIS-Tris SDS-PAGE并用胶体蓝染色。所有测试的PER. C6-rAAT样品与弹性蛋白酶形成复合物(数据没有显示)， 指示该制备物的活性。进一步的活性测试使用基于人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制的显色测定完成，用I^rolastin⑧作为对照(改编自Bruin等人，2005)。所有测试的PER. C6-rAAT 样品，除了一个之外(PER. C6-rAAT-ST3-234c)，都至少具有像 Prolastin —样的活性(>90%)(表1和2)。PER. C6-rAAT 的聚糖分析为了筛选拥有相对高唾液酸覆盖程度(最优的Hi谱所需要的)的聚糖的PER. C6-rAAT样品，实施了凝集素检测，其使用鸡冠刺桐(Erythrina cristagalli)凝集素 (ECL)来探测暴露的半乳糖(见图3所使用的检测的原理图)。所测试的47个样品中，15 个在0D405显示了 ECL信号 > 空白+0. 2，提示这些AAT样品的聚糖上相对高程度的末端半乳糖的暴露。这些样品中的几个通过使用基于HPLC的方法进行的进一步的聚糖分析确认了其低程度的唾液酸覆盖(Hermentin等人，1996 ；Gervais等人，2003)。因此，在0D405ECL 信号>空白+0.2的样品没有进一步进行扩展的聚糖分析，也没有在1 研究中进行测试。扩展的聚糖谱检测方法示于图3中，包括通过N-糖苷酶F(PNGaseF)从AAT释放 N-连接聚糖，以及用荧光2-邻氨基苯甲酸Ο-aa)标记所述聚糖。随后，所述聚糖通过阴离子交换层析(AEX)依其负电荷分组，即分离具有不同的唾液酸数目的聚糖。从该谱中确定了代表了 N-连接聚糖的带电程度(即唾液酸化)的Z-值。用于Z的式为Z = (AAsialoxO) + (AMonosialoxl) (ADisialox2) + (ATrisialox3) + (ATetrasialox4) (A =面积， Hermentin 等人，1996)进而，非唾液酸化的聚糖依其大小通过正相层析(NP)分组，即分离具有不同的分支程度(触角型)的聚糖。从该谱中确定了代表了 N-连接聚糖的分支程度的A-值。用于A的式为A= (A二触角型x2) + (A三触角型x3) + (A四触角型x4)。最后，通过计算Z/A获得糖蛋白N-连接聚糖唾液酸覆盖的程度(百分比) (Gervais 等人，2003)。
PER. C6-rAAT的聚糖谱示于表1和2。PER. C6_rAAT样品的总体谱(表1和2)显示12巧4%二触角，13-39%三触角和22-48%四触角，以及0-55%二-唾液酸(di-sialo)， 0-30%三-唾液酸(tri-sialo)和 0- % 四唾液酸(tetra-sialo)。PER. C6_rAAT 的聚糖唾液酸覆盖的程度范围为0到92%，该唾液酸覆盖程度与所述PER. C6-rAAT细胞系的单位生产率不相关(Spearman’ s r = -0. 024，ρ = 0. 893)(表 1 和 2 及图 4)。正如所预期的，对比于ELC阴性的PER. C6_rAAT(Z_值范围151-253)，ELC阳性的rAAT的聚糖含有较低水平的带电量(唾液酸化)(Z值范围0-124) (Mann-ffhitney检验分析为差异显著的，P < 0. 001)(见图5)。对比于ECL-阴性的PER. C6_rAAT(A_值范围 266-307)，ECL-阳性的PER. C6_rAAT的聚糖包含更高水平的触角(A-值范围=299-322) (Marm-Whitney检验分析为差异显著的，ρ < 0.001)(见图5)。此外，对比于范围为35% 到 106% 的 PER. C6-rAAT-ST3 (ECL 阴性)，在 PER. C6_rAAT_ST6 (ECL 阴性)的四触角型聚糖上有较低程度的唾液酸化，其范围为6%到62% (Marm-Whitney检验分析为差异显著的，ρ < 0. 001)，而这不是总体唾液酸化程度的情况(表1和2，图6)。ST6对较高分支的聚糖的较低的偏好(Joziasse等人，1987)可能是相比于PER. C6_rAAT_ST3在PER. C6_rAAT_ST6的四触角型聚糖上更低水平唾液酸化的原因。聚糖谱表明与血浆来源AATO^rolastin )相比，在PER. C6_rAAT的聚糖上有更高程度的分支的倾向，而ftOlastin 的谱为80% 二触角，18%三触角和2%四触角(表1和 2)。在A-值比对中该现象也很明显(图5及表1和2)。Prolastin 的聚糖被唾液酸覆盖的程度为96% (表1和2)。实施例3在大鼠模型中PER. C6-rAAT的药物动力学建立了一个大鼠模型以测定PER. C6-rAAT的药物动力学(PK)。该模型应该能在未纯化的PER. C6-条件培养基(CM)中检测到出现的在大约40-100 μ g/mL浓度下(2mL/kg导致大约80-200 μ g/kg的剂量)的AAT。实施了四个实验前两个用来建立该模型而第二、三和四个实验用于选择能产生具有最优I3K特征的rAAT的PER. C6_rAAT细胞系。在这些研究中，人pdAAT(Prolastin ' )被用于建立模型并用作对照。实验步骤如下大鼠(雄性WiStar，8周龄)在尾静脉进行静脉注射用AAT测试样本给药(剂量体积aiil/kg，剂量范围50-200yg/kg，η=每组 3只大鼠)。在给药前和给药后的不同时间点从尾尖收取血样。血被收集在K2EDTA微管 (microvette)中并制备血浆。血浆样品中残留的AAT浓度随后用ELISA(AAT Elisa Kit, Affiity Biologicals)测定。每只大鼠获取的数据用一个2_元模型模型化并随后确定1 参数。如实验1的数据所示(见图7)，发现该模型适合于测定未纯化样品的1 谱，因为掺入(spiked)在 PER. C6-CM 中和在对照缓冲液中(PBS，0. 01 % w/v Tween-80 (PT))的 Prolastin 的血浆浓度对时间的曲线是相似的(剂量200 μ g/kg)。用剂量为IOOyg/ kg的ftOlastin 发现相似的结果(数据未显示)。在图7中也显示，用掺入在CM中的 Prolastin 在50-200 μ g/kg的剂量观察到了提高的响应。由此数据计算出ftx)lastin 拥有 ll-12hr 的平均残留时间(MRT)。还检测了 PER. C6-rAAT 样品，PER. C6-rAAT-ST3-202c 与 Prolastin 相比显示了更慢的清除(MRT 20. 5hr)，而 PER. C6-rAAT-ST6_530 与
1Prolastin 相比则显示了更快的清除(MRT 3. 6hr)(表1和2)。基于这些观察，由此得出结论该模型可被用于未纯化的PER. C6-rAAT样品，其在实验2_4中被检测(所有样品剂量水平在100 μ g/kg)。在图8中展示了与Prolastin 相比的PER. C6_rAAT_ST3和PER. C6-rAAT-ST6具代表性的I3K谱。表1和2的最后一列展示了在Hi实验中获取的MRT值。对样品间或样品组间关于MRT差异的统计学检验通过对其对数转换值的ANOVA进行。所测试的PER. C6_rAAT_ST3 和PER. C6-rAAT-ST6制备物的MRT都显著地不同于Prolastin 。10个所测试的PER. C6-rAAT-ST3制备物中有8个的MRT显著地高于Prolastin 并且范围为18_23hr。在这8 个PER. C6-rAAT-ST3制备物之间MRT的差异并不显著。PER. C6-rAAT-ST3-053b 和-539 的 MRT 显著低于 Prolastin 。对 PER. C6-rAAT-ST3-0539，这是由于其相对低程度的唾液酸化(49，其唾液酸化程度通过共注射去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin)阻断去唾液酸糖蛋白受体期间的第一个小时内该制备物I3K谱的拯救(rescue)确定(数据未显示)。PER. C6-rAAT-ST3_05;3b的聚糖谱是不确定的(没有可能的明确的峰分配)，但是，在这种情况下低唾液酸化仍然最可能是引起低 MRT的原因。对所有测试的PER. C6-rAAT-ST6制备物，MRT都显著低于I^rolastin ，范围为 3. 4-3. 9hr.。这可以由PER. C6_rAAT_ST6上四触角型聚糖低程度的唾液酸化所解释(范围为6到62%)和/或由α-2，3-唾液酸化AAT对比于α-2，6_唾液酸化AAT潜在的不同清除机制所解释。结论本发明生成了能以高产率(达22pcd)和可接受的质量(即该制备物在体外(in vitro)检测中是有活性的)产生人AAT的PER. C6细胞系。令人吃惊的并有趣的是，在大鼠模型中显示了有前途的Hi谱。PER. C6细胞因此形成了用于产生人重组AAT的合适的平台， 所述重组AAT尤其可用于AAT-缺乏相关的肺气肿或用于其他的具有嗜中性粒细胞介导的组织损伤的炎症性疾病。然而本发明的rhAAT还可适合于在其它共表达α2，3-或2，6-唾
液酸转移酶的哺乳动物细胞类型中产生。
1权利要求
1.包含N-连接聚糖的重组人αι-抗胰蛋白酶(rhAAT)，其特征在于(a)所述N-连接聚糖的至少10%为四触角型聚糖；和(b)所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度(Z/A)为至少50%。
2.权利要求1的rhAAT，其中所述N-连接聚糖的至少20%为四触角型聚糖。
3.权利要求1或2的rhAAT，其中所述N-连接聚糖的大约10%至50%为四触角型聚糖。
4.权利要求1或2的rhAAT，其中所述N-连接聚糖的大约20%至40%为四触角型聚糖。
5.权利要求1-4中任一项的rhAAT，其中所述N-连接聚糖上总唾液酸化的至少50%为 α-2, 3-唾液酸化。
6.权利要求5的rhAAT，其中所述N-连接聚糖上总唾液酸化的至少90%为α-2，3_唾液酸化。
7.前述权利要求中任一项的rhAAT，其中所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度(由Z/ A比计算)为至少70%，优选为至少80%，更优选为至少90%。
8.前述权利要求中任一项的rhAAT，其中四触角型的所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度为至少20%。
9.前述权利要求中任一项的rhAAT，其中四触角型的所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度为至少50%。
10.权利要求9的rhAAT，其中四触角型的所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度为大约50%至大约97%。
11.前述权利要求中任一项的rhAAT，其中四触角型的所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度为大约70%至大约95%。
12.前述权利要求中任一项的rhAAT，其用作药物。
13.前述权利要求中任一项的rhAAT，其用于预防和/或治疗AAT缺乏相关的疾病，和 /或包括嗜中性粒细胞介导的组织损伤的疾病。
14.用于产生重组人α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)的方法，其包括以下步骤给PER. C6细胞提供编码人α 1-抗胰蛋白酶的核酸以使得所述PER. C6细胞带有可表达形式的所述核酸；在有助于产生所述重组人α 1-抗胰蛋白酶的条件下培养所述PER. C6细胞，其中所述 PER. C6细胞被修饰为共表达唾液酸转移酶，所述唾液酸转移酶为α 2,3-唾液酸转移酶或 α 2,6-唾液酸转移酶。
15.能通过权利要求14的方法获得的rhAAT。
全文摘要
本发明涉及包含N-连接聚糖的重组人α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)，其中所述N-连接聚糖的至少10％为四触角型聚糖；并且所述N-连接聚糖上唾液酸覆盖的程度(Z/A)为至少50％。本发明进一步涉及用作药物的rhAAT，特别是用于预防和/或治疗AAT缺乏相关的疾病，和/或包括嗜中性粒细胞介导的组织损伤的疾病。
文档编号C07K14/81GK102439037SQ201080017593
公开日2012年5月2日 申请日期2010年4月20日 优先权日2009年4月23日
发明者C·E·哈克, E·C·M·布林克曼, I·范德尼乌文霍弗 申请人:克鲁塞尔荷兰公司