利用含有羟化酶的发酵液生产11α-羟基坎利酮的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用羟化酶通气转化生产11α-羟基坎利酮的方法，属应用微生物【技术领域】。主要为解决在分批发酵中步骤繁琐、转化产物吸附于菌丝体难以分离纯化等问题。将可以产羟化酶的菌种加入到培养基中，培养一段时间待菌体生长粗壮后，对菌丝体进行超声破碎，然后进行离心，得到的上清液即为转化所需酶液。将一定浓度溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的坎利酮溶液，加入到酶液中，通入无菌空气、保持搅拌和一定温度进行转化，转化结束后用乙酸乙酯萃取反应液，萃取液进行减压蒸干，得到的干物质即为转化后的粗产物。该工艺步骤简单，效率高，成本低，时间短。
【专利说明】利用含有羟化酶的发酵液生产11 α-羟基坎利酮的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用含有羟化酶的发酵液生产11α-羟基坎利酮的方法，属于应 用微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 坎利酮（Canrenone)是一种留体激素类心血管药物，其化学名称为（17 a )-17-羟 基-3-氧代孕_4,6-二烯-21-羧酸-γ -内酯，临床上用作醛固酮拮抗剂来治疗心衰、高血 压、水肿、肝腹水等心血管疾病。虽然其效果明显，但危险性比较大，在心脏病治疗中有可能 引起用药过量而致死的危险后果。目前人们开始通过硝基化、羟基化等途径，加紧研制其衍 生物，以期增强疗效，减少副作用。而在人体内发挥主要作用的是C n位羟基化的甾体底物。
[0003] 11 α -轻基坎利酮（11 a -Hydroxy-canrenone)是坎利酮轻基化反应后形成的甾 体类衍生物，是临床治疗心血管疾病药物依普利酮（Eplerenone)的关键医药中间体。依普 利酮是由11 α -羟基坎利酮出发经六步化学反应最终合成，于2002年4月获得美国食品药 物管理局（FDA)批准，2003年由Pharmacia公司在美国上市。2003年Kelli L. Davis等研 究发现，依普利酮比起螺内酯（Spironolactone)等，副作用明显减少。因此，11 α -轻基坎 利酮作为合成依普利酮的重要中间体，有着显著的市场需求。化学合成11 α -羟基坎利酮 步骤多，专一性不高，存在很多副反应，产品纯度及收率均较低，生物酶催化技术作为工业 生物技术可持续发展最有希望的技术之一，能有效克服化学合成法的不足。
[0004] 国内目前对微生物转化合成11 α -羟基坎利酮有部分研究和报道，所用的微生物 主要是赭曲霉、根霉等。例如专利（CN 1727494Α)和专利（CN 103255192Α)分别用赭曲霉（AS 3. 4411)和赭曲霉（TCCC41060)进行发酵合成了 11 α -羟基坎利酮；专利（CN 101845474A) 用经过波长为200nm-280nm紫外线照射10-30小时的赭曲霉，作为发酵合成11 α -羟基坎 利酮的微生物；2005年茅燕勇利用赭曲霉（NG0216)、葡枝根霉（NG0305)和粉红单端孢霉 (NG0207)均进行发酵合成了 11 α -羟基坎利酮，其用冷凝回流法对产物11 α -羟基坎利酮 进行了提取，用三次重结晶法对提取的11 α -羟基坎利酮进行了纯化；2012年崔凤杰等对 利用根霉sp. UJS-0602)发酵合成11 α -轻基坎利酮，并进行分离提取。但是直 接利用微生物的酶液进行转化合成11 α -羟基坎利酮鲜见有报道。
[0005] 由于坎利酮、11 α -羟基坎利酮在水中的溶解度极低，微生物转化法产物11 α -羟 基坎利酮主要吸附在菌丝体表面，很难依靠过滤、离心或萃取单纯的物理方法分离。转化过 程中菌体仍会生长代谢，产生色素等副产物，使产率降低，产物中杂质增多,给纯化带来一 定困难。
【发明内容】
[0006] 本发明先用菌体制备可转化坎利酮生成含有能够转化生成11 α -羟基坎利酮的 羟化酶的发酵液，然后利用发酵液转化坎利酮，生产11 α -羟基坎利酮，再对产物11 α -羟 基坎利酮进行提取。
[0007] 本发明提供一种利用含有羟化酶的发酵液生产11 α -羟基坎利酮的方法，具体操 作如下： (1)斜面菌种制备： 生产菌种为根霉(肋办即狀沙.UJS-0602, CICC3143,购于中国工业微生物菌种保藏管 理中心)，将该菌接种到斜面培养基，25-31°C环境条件下恒温培养4-8天后，待其表面布满 孢子，然后转接到斜面培养基上，25-31°C环境条件下继续恒温培养4-8天后，待其表面布 满孢子后，即得生产斜面。
[0008] (2)孢子悬浮液制备： 无菌条件下，将无菌水加入到生产斜面，洗下孢子，用无菌水调节孢子液，以得到浓度 为106-101(lCfu/mL的孢子悬浮液。
[0009] (3)摇瓶种子制备： 将孢子液加入装有50-150mL新鲜无菌培养基的500mL三角瓶中，接种量1-10%， 25-31°C、摇床转速150-220r/min条件下培养12-48h后，制得种子液。
[0010] ⑷种子液制备： 将所得的摇瓶种子接入培养基经过灭菌的一级种子罐中，接种量1-10%，通入无菌空气 培养，通气量为0. 1-2. Ov/v/m，搅拌转速为50-500r/min，控制温度为28-31°C，培养12-48 小时后即得一级种子。将所得的一级种子接入培养基经过灭菌的二级种子罐中，接种量 1-10%，通入无菌空气培养，通气量为0. 1-2. Ov/v/m，搅拌转速为50-500r/min，控制温度为 28-31°C，培养12-48小时后即得二级种子。
[0011] (5)羟化酶液制备： 将所得的二级种子接入培养基经过灭菌的机械搅拌发酵罐中，接种量1-10%，通入无 菌空气培养，通气量为〇. 1-2. Ον/ν/m，搅拌转速为50-500r/min，控制温度为28-31°C，培 养12-60小时后即得发酵液。将制得的发酵液在无菌条件下，进行超声处理，超声频率： Ι-lOkHZ，超声时间5-30min。然后1000-15000r/min离心20-60min，所得上清液即为酶液。
[0012] (6)加坎利酮通气转化： 将所得的酶液置于经过空消灭菌的机械搅拌发酵罐中，加入坎利酮，使坎利酮在混合 液中的浓度为〇. l-10g/L，通入无菌空气进行转化，通气量为0. 1-2. Ov/v/m，搅拌转速为 50-500r/min，控制温度为28-31°C，转化24-108小时后结束。用等体积乙酸乙酯对所得转 化液进行萃取，高效液相（HPLC)检测所得11 α -羟基坎利酮，纯度可达90. 0-99. 5%。
[0013] 本方法中，根霉斜面培养基组分包括（g/L):葡萄糖22.0,酵母膏20.0,大豆蛋白 胨20. 0,琼脂30. 0,用浓度为10%磷酸将pH调至5. 0。摇瓶种子、种子液、发酵液培养基组 分包括（g/L):葡萄糖15. 0-25. 0,酵母膏14. 5-20. 0,玉米浆30. 0-35. 0。
[0014] 11 α -羟基坎利酮用高效液相色谱（HPLC)检测条件，色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 _X4. 6 mm, 5 μ m);测定条件：甲醇-水为流动相，梯度洗脱40 min ; 流速：〇. 8 mL/min ;检测波长280 nm ;柱温：30°C ;进样量：5 μ L。采用外标法计算公式计算 坎利酮和11-α-羟基坎利酮。转化率计算方法：
【权利要求】
1. 利用含有羟化酶的发酵液生产11 α -羟基坎利酮的方法，其特征在于，按照以下步 骤进行： (1) 斜面菌种制备： 生产菌种为根霉0?办O/OTS 5/7. UJS-0602)，将该菌接种到斜面培养基，25-31°C环境条 件下恒温培养4-8天后，待其表面布满孢子，然后转接到斜面培养基上，25-31°C环境条件 下继续恒温培养4-8天后，待其表面布满孢子后，即得生产斜面； (2) 孢子悬浮液制备： 无菌条件下，将无菌水加入到生产斜面，洗下孢子，用无菌水调节孢子液，以得到浓度 为106-101(lCfu/mL的孢子悬浮液； (3) 摇瓶种子制备： 将孢子液加入装有50-150mL新鲜无菌培养基的500mL三角瓶中，接种量1-10%， 25-31°C、摇床转速150-220r/min条件下培养12-48h后，制得种子液； (4) 种子液制备： 将所得的摇瓶种子接入培养基经过灭菌的一级种子罐中，接种量1-10%，通入无菌空气 培养，通气量为0. 1-2. Ov/v/m，搅拌转速为50-500r/min，控制温度为28-31°C，培养12-48 小时后即得一级种子；将所得的一级种子接入培养基经过灭菌的二级种子罐中，接种量 1-10%，通入无菌空气培养，通气量为0. 1-2. Ov/v/m，搅拌转速为50-500r/min，控制温度为 28-31°C，培养12-48小时后即得二级种子； (5) 羟化酶液制备： 将所得的二级种子接入培养基经过灭菌的机械搅拌发酵罐中，接种量1-10%，通入无 菌空气培养，通气量为〇. 1-2. Ον/ν/m，搅拌转速为50-500r/min，控制温度为28-31°C，培 养12-60小时后即得发酵液；将制得的发酵液在无菌条件下，进行超声处理，超声频率： Ι-lOkHZ，超声时间5-30min ;然后1000-15000r/min离心20-60min，所得上清液即为酶液； (6) 加坎利酮通气转化： 将所得的酶液置于经过空消灭菌的机械搅拌发酵罐中，加入坎利酮，使坎利酮在混合 液中的浓度为〇. l-l〇g/L，通入无菌空气进行转化，通气量为0. 1-2. Ov/v/m，搅拌转速为 50-500r/min，控制温度为28-31°C，转化24-108小时后结束；用等体积乙酸乙酯对所得转 化液进行萃取，高效液相检测所得11 α -羟基坎利酮，纯度可达90. 0-99. 5%。
2. 根据权利要求1所述的利用含有羟化酶的发酵液生产11 α -羟基坎利酮的方法，其 特征在于，所述的根霉斜面培养基组分包括（g/L):葡萄糖22.0,酵母膏20.0,大豆蛋白胨 20. 0,琼脂30. 0,用浓度为10%磷酸将pH调至5. 0 ;所述的摇瓶种子、种子液、发酵液培养基 组分包括（g/L):葡萄糖15. 0-25. 0,酵母膏14. 5-20. 0,玉米浆30. 0-35. 0。
【文档编号】C12P33/20GK104046675SQ201410260970
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】管国强, 黄达明, 孙文敬, 张志才, 崔鹏景, 崔凤杰, 钱静亚 申请人:江苏大学