长链非编码RNA Ovol2-AS的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生理和生物医学领域，具体为调控胰岛β细胞增殖和功能的长链非编码RNA(lncRNA)及其应用。建立妊娠期小鼠模型，分离妊娠期及非妊娠期小鼠的胰岛检测其lncRNA差异表达水平，筛选并发现了新的调控胰岛β细胞增殖和功能的lncRNA?Ovol2-AS。在小鼠胰岛原代打散细胞以及小鼠胰岛β细胞系Min6中过表达Ovol2-AS，可以显著促进β细胞的增殖，并起到抑制细胞凋亡的作用。长链非编码RNA?Ovol2-AS可用于抑制胰岛细胞的凋亡、用于促进胰岛细胞的增殖；还可以用于制备或筛选制备治疗糖尿病的药物。
【专利说明】长链非编码RNA 0vol2-AS的应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及生理和生物医学领域，具体为调控胰岛β细胞增殖和功能的长链非 编码RNA(lncRNA)及其应用。 【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌和 (或）作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。在糖尿病发生发展过程中，胰岛β细胞 数量和功能都对其临床进程起着重要作用。近年来糖尿病在全世界特别是中国的发病率迅 速上升，2010年我国在对近10万人进行了长期随访调查的结果显示，我国18岁及以上成人 样本中，根据国际最新临床诊断标准进行诊断的糖尿病估测患病率为11. 6%，约1. 139亿 人，使得此领域的研究也更为重要和迫切，揭示未知的调控机制和治疗靶点是全球研究者 的共同目标。
[0003] 胰岛β细胞的数量和功能在糖尿病发生发展过程中起着重要作用，其中β细胞 的增殖已成为糖尿病研究的关键环节。越来越多研究倾向于认为胰岛β细胞功能缺陷是 糖尿病发生发展的核心环节，而β细胞功能缺陷主要表现为两个方面 ：β细胞数量的减少 和胰岛素分泌异常。无论是1型还是2型糖尿病，都存在胰岛β细胞数量缺陷，因此探讨 影响β细胞数量和功能的原因和机制成为了全球糖尿病研究领域的焦点。胰岛β细胞 数量主要由四种机制调控：β细胞复制（已分化的β细胞进行有丝分裂）、β细胞新生 (前体细胞的发育成熟）、β细胞凋亡（程序性细胞死亡）以及β细胞扩张，任何一种调 控机制的变化都会直接影响β细胞的数量，这四种机制可根据发育的不同阶段或体内代 谢的需求变化而调控β细胞的数量。研究发现，小鼠在胰岛素抵抗或肥胖状况下，β细胞 数量可出现近30倍的增加，而处于相同生理病理状态下的人类胰岛β细胞数量仅会增加 30-40%，成人胰岛的β细胞增殖率非常低，尸体解剖人类胰腺发现β细胞复制（Ki67阳 性β细胞）在5岁左右便降至不到0. 2%，而在成人胰腺中几乎找不到Ki67阳性的β细 胞，这说明在正常生理状况下成人体内胰岛β细胞的增殖非常有限，故如何能让糖尿病病 人功能性的胰岛β细胞数量恢复则成为了糖尿病研究的重点。
[0004] 近年来许多重要研究结果揭示，尽管在特定环境下小鼠 β细胞可以由少量前体 细胞转化而来，但大多数β细胞还是通过自身复制增殖的，胰岛β细胞的复制在胚胎期及 新生儿期会快速增加，而在断奶后直到至发育成熟的时间内其数量几乎不会变化，无论在 成熟的啮齿类动物中还是在人类胰岛其复制速度都非常缓慢，但β细胞仍保留了其加速 复制的能力，在一些特殊的生理病理情况下，比如妊娠、高血糖、胰腺损伤]以及周围胰岛 素抵抗（肥胖状态等）的情况下胰岛β细胞的复制会明显增加。
[0005] 长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。2002年研究 人员在对小鼠全长互补DNA(cDNA)文库的大规模的测序过程中首次发现了这类新的转录 物一IncRNA，根据IncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以将IncRNA分为5 类：正义（sense)、反义（antisense)、双向（bidirectional)、基因内（intronic)、及基因间 (intergenic)，这种位置关系对于推测IncRNA的功能有很大帮助。目前的研究表明IncRNA 可能的来源包括以下方面：（1)编码蛋白质的基因结构发生中断而转变成IncRNAs，比如 Xist IncRNA，（2)染色质重组的结果，即两个非转录的基因与另一个独立的基因并排重组 而产生含多个外显子的IncRNAs，（3)非编码基因复制过程中的反移位产物，（4)局部的串 联复制子邻近产生，（5)基因组中插入一个转座成分而产生有功能的非编码IncRNA，如BC1 和BC200。研究显不，哺乳动物基因组序列中1 %广生的转录本是可编码蛋白，而有4% 产生的转录本是IncRNA，IncRNA起初被认为是基因组转录的"噪音"，是RNA聚合酶II转 录的副产物，不具有生物学功能，哺乳动物中的IncRNA与蛋白编码基因相比较，IncRNA的 长度普遍更短，保守性较差并且表达水平明显低于蛋白编码基因。然而近年来大量研究表 明，IncRNA在表观遗传调控、细胞周期调控、剂量补偿效应及细胞分化调控等许多生物过程 中发挥重要作用。IncRNA没有一种普遍的作用模式，它可以以不同的方式来调控基因表达 和蛋白合成，可以在多个层面上对基因表达进行调控，包括表观遗传学水平调控、转录水平 调控以及转录后水平调控几个方面。
[0006] IncRNA在调控基因表达的机制存在共性，主要从表观遗传学、转录水平以及转录 后水平3个层面实现对基因表达的调控，IncRNA主要可能具有以下几个方面的功能：（1)通 过在蛋白编码基因上游启动子区发生转录，干扰下游基因的表达；（2)通过抑制RNA聚合酶 II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因表达；（3)通过与蛋白编码基因的 转录本形成互补双链，进而干扰mRNA的剪切，从而产生不同的剪切形式；(4)通过与蛋白编 码基因的转录本形成互补双链，进一步在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的 表达水平；（5)通过结合到特定蛋白质上，IncRNA转录本能够调节相应蛋白的活性；(6)作 为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；（7)通过结合到特定蛋白上，改变该蛋白的 胞质定位；（8)作为小分子RNA，如miRNA、piRNA的前体分子转录。而正因为IncRNA可以从 转录和转录后水平参与蛋白质编码基因的调控，这些基因包括疾病发生相关基因及发育相 关基因等，通过参与调控蛋白质编码基因，IncRNA既能影响细胞内信号转导途径，也能影响 生物体发育过程中的信号转导通路。目前已报道IncRNA会对多种疾病的发生和发展产生 影响，包括神经系统的疾病，心血管疾病以及多种肿瘤癌症等疾病。
[0007] 近年来对长链非编码RNA (IncRNA)的研究引起了广泛关注，而胰岛β细胞相关的 IncRNA研究尚非常有限。探索新的在β细胞中扮演重要角色的IncRNA，不仅会揭示调控 β细胞数量和功能的重要机制，还将提供新的治疗靶点，是糖尿病研究中亟待开拓的重要 科学问题。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供调控胰岛β细胞增殖和功能的IncRNA，并将上述IncRNA用于调 控胰岛β细胞增殖和抑制胰岛细胞凋亡。
[0009] 建立妊娠期小鼠这一成熟β细胞增殖模型，分离妊娠期及非妊娠期小鼠的胰岛 检测其IncRNA差异表达水平。用微阵列分析IncRNA表达谱的方法，利用IncRNA芯片检 测了妊娠和非妊娠小鼠胰岛中差异性表达的IncRNA,进行了 G0(Gene ontology)功能分析 以及pathway通路分析，筛选并发现了新的调控胰岛β细胞增殖和功能的IncRNA:结果显 示，根据对IncRNA芯片的分析，发现了约834种IncRNA在妊娠期和非妊娠期小鼠胰岛中的 表达存在显著性差异，结合差异表达的蛋白编码基因进行了 GO分析、pathway分析，通过分 析IncRNA-mRNA在表达水平上的相关性，构建了 IncRNA-mRNA共表达调控网络。根据结果， 表达丰度较高且变化倍数显著的有AK078687、AK080649、AK154298、AK007144、AK149154以 及AK162104等，这几个IncRNA的realtime PCR的结果也与芯片上的结果基本一致。其中 AK007144在小鼠胰岛中表达丰度较丰富，变化差异较大，由于该IncRNA位于蛋白编码基因 ovol2的反义链上，属于antisense overlap的IncRNA,根据IncRNA命名的原则，将其命名 为 0vol2-AS。
[0010] 在小鼠胰岛原代打散细胞以及小鼠胰岛β细胞系Min6中过表达0VO12-AS，，观 察0vol2-AS对胰岛β细胞增殖和凋亡的影响；并进一步检测0vol2-AS对β细胞增殖相 关通路的作用。0v〇12-AS的表达水平在妊娠与非妊娠期小鼠胰岛中存在显著性差异，过表 达0vol2-AS组的胰岛β细胞生长加快、S期细胞比例增加，早期凋亡细胞的比例减少；并 进一步证明，0vol2-AS能使Min6细胞中Akt磷酸化水平增加，同时也增加 GSK-30磷酸化 水平，进而影响c-myc等增殖相关基因的水平。结果显示，过表达0vol2-AS，可以显著促进 β细胞的增殖，并起到抑制细胞凋亡的作用。
[0011] 〇v〇12-AS可以促进胰岛β细胞的增殖并抑制胰岛β细胞凋亡，此作用可能是通 过激活AKT/GSK-3 β通路实现的。
[0012] 因此，长链非编码RNA 0vol2-AS可用于抑制胰岛细胞的凋亡、用于促进胰岛细胞 的增殖；还可以用于制备或筛选制备治疗糖尿病的药物。
[0013] 在胰岛细胞过表达0vol2-AS可促进胰岛细胞增殖，抑制胰岛细胞凋亡。所述的胰 岛细胞为胰岛β细胞Min6或小鼠原代胰岛细胞。在胰岛β细胞Min6中过表达0vol2-AS 还可以激活胰岛β细胞Min6中Akt/GSK-3i3通路。
[0014] 本发明利用妊娠小鼠的模型，通过分离妊娠期及非妊娠期小鼠的胰岛检测其 IncRNA差异表达水平。用微阵列分析IncRNA表达谱的方法，通过分析妊娠期和非妊娠期胰 岛IncRNA的表达水平，为继续研究小鼠胰岛β细胞增殖相关IncRNA的功能和机制提供了 丰富的资源。同时，我们还构建了相关IncRNA的过表达质粒，并包装了慢病毒，实现在胰岛 β细胞Min6细胞系和小鼠原代胰岛上的过表达，证实了妊娠期的β细胞增殖过程中确实 存在IncRNA的参与。进一步筛选和探索IncRNA的功能及其相关调控机制，将可能为糖尿 病的治疗提供新的思路。 【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为实施例1中，小鼠对照组及妊娠组6个样本的IncRNA芯片的箱式图分析
[0016] 图2为实施例1中，妊娠组小鼠胰岛显著性表达升高基因的G0分析
[0017] 图3为实施例1中，妊娠组小鼠胰岛显著性表达升高基因的通路（Pathway)分析
[0018] 图4为实施例1中，妊娠14. 5天组（pregnancy)和对照组（control)小鼠胰岛 IncRNA表达水平差异验证
[0019] 图5为实施例2中，转染pcDNA3. l-〇vol2-AS后Min6细胞中0vol2-AS的表达水 平
[0020] 图6为实施例2中，转染pcDNA3. l-〇vol2-AS后Min6细胞的生长曲线
[0021] 图7为实施例2中，Min6细胞系转染pcDNA3. l-〇vol2-AS过表达质粒48小时后， 免疫荧光检测Ki67的阳性表达
[0022] 图8为实施例2中，细胞系Min6转染0vol2-AS过表达质粒和对照质粒后48小时 后，用流式检测E du的阳性率的结果
[0023] 图9为实施例2中，流式检测分析Min6细胞系转染0vol2-AS过表达质粒和对照 质粒后对细胞凋亡的影响
[0024] 图10为实施例2中，流式检测分析Min6细胞系转染0vol2-AS过表达质粒和对照 质粒后对细胞凋亡的差异
[0025] 图11为实施例2中，小鼠原代打散胰岛细胞转染转染0vol2-AS过表达质粒和对 照质粒后荧光照片
[0026] 图12为实施例2中，细胞凋亡原位检测过表达0vol2-AS对小鼠原代β细胞凋亡 的影响
[0027] 图 13 为实施例 2 中，P-AKT，T-AKT，P-GSK3 β，T-GSK3 β 在转染 0vol2-AS 和对照 质粒的Min6细胞系中的蛋白差异表达
[0028] 图14为实施例2中，Min6细胞系中过表达0vol2-AS后增殖相关基因变化水平 【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[〇〇3〇] 一、主要实验材料：妊娠期小鼠和对照组原代胰岛细胞
[0031] 主要试剂：HBSS(IOX)、（IX) (Invitrogen 公司）；胶原酶 XI (Sigma 公司）； Trizol 裂解液（Invitrogen 公司）。
[0032] 二、实验方法
[0033] ( 一）建立妊娠小鼠模型
[0034] 购买SPF级C57BL/6雌性小鼠和雄性小鼠，于SPF级动物房饲养：分笼饲养（4只 小鼠每笼），小鼠可自由摄食和饮水。动物房的环境温度21±1度，湿度55±10%，昼夜节 律12-12小时。一部分雌性小鼠为对照组，另一部分雌性小鼠与雄性小鼠按照2:1的比例 合笼，取妊娠14. 5天的小鼠，妊娠的小鼠在分离胰岛时再次通过胚胎表型观察确认妊娠时 间。
[0035] (二）从对照组和妊娠14. 5天的C57BL/6雌性小鼠中分离胰岛：
[0036] 1、麻醉动物：采用1%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉小鼠（剂量为50mg/kg)。
[0037] 2、将小鼠于固定于动物操作台上，腹部朝上，固定好四肢；用75%酒精棉球擦拭 腹部，消毒。取腹正中切口，用眼科剪打开腹部呈一 U型切口；充分暴露腹部脏器，将其肝脏 上翻，将十二指肠翻向左侧，小肠和盲肠向左翻，钝性游离胆总管，用文氏血管钳夹闭夹住 胆总管与十二指肠交汇处，即十二指肠大乳头处，以避免胶原酶从此处进入肠道。
[0038] 3、用5ml注射器吸满胶原酶XI工作液（10XXI型胶原酶用lxHBSS稀释为1XXI 型胶原酶，用量为4-5ml/胰腺），将一次性静脉输液针固定在注射器头部连接好，排空内部 的气泡。在显微镜下用一次性静脉输液针在胆囊下方的胆总管处进行穿刺（肝总管分支处 下方的位置）。
[0039] 4、固定好插入胆总管的静脉针头后，轻轻推入少许胶原酶XI工作液，在显微镜下 观察胰腺有少许充盈，且胆总管周围没有渗液，迅速用眼科剪剪破心脏，停止血流，以免胰 腺内混入过多血细胞。继续缓慢注入约2-3ml胶原酶XI工作液，注入时，可感到注射器阻力 增大，即胰腺被充盈至压力逐渐增加，直至胰腺被完全充盈后终止。
[0040] 5、将胰腺与周围组织用镊子轻柔的分离开，找到脾脏，将脾脏连着充盈的胰腺取 下，放于15ml离心管，离心管中提前已加入了 2-3ml胶原酶XI工作液，注意不要将脾脏混入 离心管里。
[0041] 6、接着将15ml离心管置于37°C水浴锅中消化，一般消化时间约为18分钟，期间， 当消化到15分钟、16分钟、17分钟时分别用手剧烈震荡离心管1次，以便加速胰腺组织的 消化。至大约18分钟时肉眼观察可见消化完全的组织呈细沙状。
[0042] 7、消化完毕后，向15ml离心管加入10ml冰上预冷的1 XHBSS，终止消化，以免过度 消化，4度，lOOOrpm(加速9,减速9)，离心1分钟。将上清弃去，加入10ml左右的1 XHBSS， 用洗耳球连接玻璃管轻柔吹打重悬沉淀，将沉淀及液体吸至40目的筛网上，经筛网过滤掉 无法消化的组织块（如脂肪组织等），收集滤液于新的15ml离心管中。用1XHBSS将收集 的过滤液补满至10ml，4度，lOOOrpm离心1分钟。
[0043] 8、弃去上清液体，梯度离心，4度，1500rpm(加速5,减速0)离心20分钟。将离 心后收集到的上清加入l〇mlIXHBSS液体，再次离心，4度，lOOOrpm(加速9,减速9)离心 1分钟。将上清弃去，在离心管中加入lOmllXHBSS液体，使胰岛细胞重悬，洗一遍，4度， lOOOrpm(加速9,减速9)，离心1分钟。将上清弃去，加入10ml含有0· 5% BSA的1XHBSS， 用塑料吸引管吹打重悬沉淀，将混合液体吸入l〇cm培养皿，在体视显微镜下挑取胰岛。
[0044] 9、用于提取RNA的胰岛，挑出至1. 5ml EP管内，4度，lOOOrpm(加速9,减速9)，离 心1分钟，吸掉上清，每管加入lml Trizol裂解液，保存于-80度，或者将挑出的胰岛放入冻 存管中，4度，lOOOrpm，离心1分钟后，吸弃上清，直接存入液氮罐中。
[0045] (三）小鼠原代胰岛RNA提取
[0046] 用上述方法，取妊娠14. 5天雌性小鼠胰岛3组，每组由7只小鼠胰岛组成，标记为 pregl、preg2、preg3 ;对照组年龄匹配的雌性小鼠胰岛3组，每组由7-8只小鼠胰岛组成， 标记为controll、control〗、control3。采用Trizol试剂法，分别从小鼠分离的原代胰岛 提取总RNA，再用逆转录聚合酶链试剂盒（A3500, Promega)制成cRNA，逆转录反应操作按 Promega说明书进行。并进行RNA质量控制检测，对cRNA进行标记后也进行了标记质量控 制。RNA浓度平均在200-500ng/ μ 1之间，28SRNA比18SRNA条带亮度接近1:1，RNA的A260/ Α280比值在1. 8-2. 1之间，Α260/Α230比值大于1. 8。质量良好，符合Mouse4x44K IncRNA expression array微阵列基因表达实验要求。由上海康成生物有限公司采用小鼠 IncRNA Array (4x44K, ArrayStar)完成的基因表达谱检测。
[0047] (四）小鼠 IncRNA芯片分析
[0048] 1、小鼠 IncRNA Array (4x44K, ArrayStar)微阵列杂交分析
[0049] 应用 Agilent gene expression hybridization kit(Agilent p/n5188-5242), Hybridization Chamber, stainless (Agilent p/n G2534A), Hybridization Chamber gasket slides(Agilent p/n G2534-60003), Hybridization oven (Agilent p/n G2545A), Hybridization oven rotator for Agilent Microarray, Hybridization Chambers (Agilent p/nG2530-60029)进行检测。
[0050] 2、IncRNA芯片数据分析
[0051] 每个样本的总RNA进行Mouse4x44K IncRNA expression array微阵列基因表 达谱分析。该小鼠长链非编码RNA芯片上含有约40000种IncRNA，其数据库来自NCBI RefSeq、UCSC、RNAdb2. 0、NRED、Fantom3. 0、UCRs。重复序列以及小于 200bp 的非编码 RNA 被剔除，每个转录本都对应一个匹配的探针，一些管家基因为阳性对照。数据分析首先应 用Agilent GeneSpring GX vll. 5. 1软件校正原始数据，在对原始数据进行了分位数校正 之后，对至少有3个以上样本带有标记的IncRNA进行进一步的control组和preg组的 IncRNAs差异性表达筛选，将control组和preg组各个样本检测信号的比值进行log2变 换，平衡，进行t-test分析并计算p-values ;当某种IncRNA在两组间的t-test分析中得 至lj p-value <0· 05,并且差异性倍数> 1. 5时，便认为control组和preg组的IncRNA有显 著差异性表达。
[0052] 结果显示，妊娠期小鼠胰岛与非妊娠对照组小鼠胰岛之间有大约800多种IncRNA 存在显著性表达差异，约380种IncRNA的表达水平在妊娠期小鼠胰岛中上调，约454种 IncRNA的表达水平在妊娠期小鼠胰岛中下调，通过箱式图（Box-Plot)可见6个样本各组数 据内和各组数据间的水平大致接近，组间均一性较好。通过散点图（Scatter-Plot)可比较 对照组（control)与妊娠组（preg)间差异性表达的IncRNA水平，可见组间IncRNA差异较 明显。图1为芯片的箱式图分析，Y轴为对数化的坐标轴，表示红绿两荧光信号标准化后的 数值之比。
[0053] 对妊娠期与非妊娠期对照小鼠胰岛中有显著表达水平差异的基因进行G0分析， 进行生物学过程、分子功能以及亚细胞组分分类注释分析，按集中趋势由高到低（p-value 越小则集中趋势越高）列出了显著性差异表达基因集中的分类，结果显示，妊娠期小鼠胰 岛中显著性表达水平升高的基因主要与细胞周期、细胞分裂、DNA复制有关。Pathway富集 分析可找出发生差异表达的基因影响的生物学通路，对有显著性表达差异的基因进行KEGG Pathway注释分析，按集中趋势由高到低（p-value越小则集中趋势越高）列出显著性差 异表达基因集中的生物学通路列表，结果显示妊娠期小鼠胰岛中表达升高的基因主要参与 DNA复制、氮代谢、p53信号通路以及卵母细胞成熟等过程。说明相应的妊娠期表达水平显 著升高的IncRNA可能通过调控相应的细胞周期蛋白、参与相应的生物学途径等来调节胰 岛β细胞的增殖过程。图2显示了 G0分析的柱状图，图3显示了 Pathway分析的柱状图。
[0054] 3、妊娠期小鼠胰岛增殖期胰岛IncRNA表达差异分析及统计
[0055] 任意挑选妊娠期小鼠胰岛中差异性表达的112个IncRNA(差异性倍数> 2, p值 <0.05)，进行聚类分析，结果显示，与未妊娠对照组小鼠胰岛相比，妊娠期小鼠胰岛有部分 IncRNA表达上调，部分IncRNA表达下调，组内均一性较好，组间差异较明显。
[0056] 分析表达谱数据，发生表达改变的IncRNA中，表达丰度较高且变化倍数显著的有 AK078687、AK080649、AK154298、AK007144、AK149154 以及 AK162104 等。与未妊娠对照组相 t匕，小鼠胰岛中的这几种IncRNA的表达水平在妊娠期明显上调（表1)。
[0057] 表1对照和妊娠14. 5天小鼠胰岛IncRNA表达差异分析
[0058]
【权利要求】
1. 长链非编码RNA 〇V〇12-AS用于抑制胰岛细胞的凋亡。
2. 长链非编码RNA Ovol2-AS用于促进胰岛细胞的增殖。
3. 长链非编码RNA Ovol2-AS用于制备或筛选制备治疗糖尿病的药物。
4. 一种促进胰岛细胞增殖的方法，其特征在于，在胰岛细胞中过表达Ovol2-AS。
5. 权利要求4所述促进胰岛细胞增殖的方法，其特征在于，所述的胰岛细胞为胰岛β 细胞Min6或小鼠原代胰岛细胞。
6. -种抑制胰岛细胞凋亡的方法，其特征在于，在胰岛细胞中过表达0v〇12-AS。
7. 权利要求6所述抑制胰岛细胞凋亡的方法，其特征在于，所述的胰岛细胞为胰岛β 细胞Min6或小鼠原代胰岛细胞。
8. -种激活胰岛β细胞Min6中Akt/GSK-3i3通路的方法，其特征在于，在胰岛β细 胞Min6中过表达Ovol2_AS。
【文档编号】C12N15/113GK104059887SQ201410260768
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】宁光, 李明蔚, 曹亚南, 姜秀丽 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院