一种异硫链霉菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种异硫链霉菌及其应用，该菌株为异硫链霉菌（ Streptomyces althioticus ）LMZY，已于2014年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2014110。本发明所选育的菌株可利用农业废弃物后高产木聚糖酶，有效解决农业废弃物的再生利用，降低生产成本，减少环境污染，提高产品附加价值。CCTCC NO: M 20141102014.03.28
【专利说明】一种异硫链霉菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体而言，涉及一株利用玉米芯粉产木聚糖酶能力较强的异硫链霉菌lstreptomyces alth1ticus)及其应用。
[0002]
【背景技术】
[0003]半纤维素是继纤维素以外第二大再生资源，广泛地存在于木材、禾本科植物、农作物废弃物之中。木聚糖作为植物半纤维素的重要组分，约占植物总糖的三分之一，其主要成分为D-2木糖(是一种能够被微生物细胞转化成为单细胞蛋白质和能量来源的五碳糖)。
[0004]木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括内切β-1，4-木聚糖酶、外切β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶等，其中内切β-1，4-木聚糖酶为关键酶。作为新型的纸浆漂白助剂，木聚糖酶能降低漂白氯的用量，降低了造纸工业中的环境污染问题；在食品工业，木聚糖酶处在小麦面粉的改良和提高果蔬汁有效成分浸出率外，其降解形成的功能性低木聚糖有显著的双歧杆菌增殖能力，不被消化特性，无龋齿性，促进人体对钙的吸收等多种良好的生理学特性作为饲用酶制剂，木聚糖酶可以有效解除木聚糖的抗营养性，促进畜禽对粗饲料的消化吸收，同时添加木聚糖酶还可以减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康，使畜禽体重均匀，减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度；木聚糖酶能水解植物中的半纤维素，所形成的戊糖可以进一步用于生产木糖醇、酒精、有机酸等产品，在可再生资源生物转化利用中具有重要作用。因此，木聚糖酶在造纸、食品、饲料、纺织、医药及能源等领域有着广泛的应用。
[0005]木聚糖酶的种类繁多且广泛存在于海洋及陆地，但因为获得难易程度及纯度的原因，当前商用木聚糖酶仍主要依靠微生物发酵制得。已报道产木聚糖酶的微生物主要有细菌、放线菌、真菌、曲霉、木霉等。而国内外研究和应用最多的是细菌、曲霉、木霉所产的木聚糖酶，如:朱启忠等报道用麦草提取的半纤维素诱导链霉菌Strs-2，产酶活力小于50U/ml ;也有研究者直接用农业废弃物诱导菌株产生木聚糖酶，但产酶水平普遍较低。如Charin Techapun等报道菌株链霉菌Abl06利用农业废弃物产酶活力仅15 U/ml ;李家群等用稻草粉在最佳条件下发酵培养链霉菌LH-3，木聚糖酶活力最高为120.3 U/ml)略低于曲霉和木霉，但通常并不分泌纤维素酶，因此其具有较高的工业应用价值。
[0006]
【发明内容】
[0007]由于放线菌产木聚糖酶的报道较少，因此本发明人通过实验室利用农业废弃物对产木聚糖酶的放线菌进行发酵条件优化筛选，筛得的放线菌做进一步选育，获得了一株可利用玉米芯粉高产木聚糖酶的菌株异硫链霉菌{Str印tomyces。本发明所获得的菌株不仅仅能高产木聚糖酶，更重要的是有效解决了农业废弃物的再生利用，降低生产成本，减少环境污染，提高产品附加价值。
[0008]为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验反复进行菌种诱变选育研究，并最终获得了一株利用玉米芯粉产木聚糖酶能力较强的异硫链霉菌C?trep tomycesalth1ticus)\MTi,已于2014年3月28日保藏于中国.武汉.武汉大学.中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC Μ 2014110。
[0009]本发明的涉及的高产木聚糖酶的异硫链霉菌{Streptomyces alth1ticus) LMZY具有如下生物学特征:
形态学特征:孢子丝螺旋形，气生菌丝粉状，白色，背面浅褐色。
[0010]生理特性:利用葡萄糖、果糖、鼠李糖、甘露醇以及半乳糖；在阿拉伯糖、木糖、肌醇以及麦芽糖等作为碳源；产生抑制革兰氏阳性和阴性细菌的异硫霉素(alth1mycin)。
[0011]代谢特性:代谢过程能产木聚糖酶。
[0012]与已有的异硫链霉菌相比，本发明通过诱变筛选获得的异硫链霉菌(S trep tomyces alth1ticus) LMZY具有如下优点和显著进步:
(1)本发明所选育的菌株可利用农业废弃物后高产木聚糖酶，发酵后所得发酵液中木聚糖酶活高达38.86U/ml。
[0013](2)本发明有效解决农业废弃物的再生利用，降低了生产成本，减少环境污染，提高了产品附加价值。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为发酵周期对酶活的影响曲线图。
[0016]图2为发酵温度对酶活的影响柱形图。
[0017]图3为接种量对酶活的影响柱形图。
[0018]图4为初始pH对酶活的影响柱形图。
[0019]图5为装液量对酶活的影响柱形图。
[0020]
【具体实施方式】
[0021]以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0022]实施例一:菌种的选育
(1)菌株
异硫链霉菌(Streptomyces alth1ticus)
(2)培养基
每1 L所述富集培养基含有:自制玉米芯木聚糖10g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、Κ2ΗΡ041.5 g、MgS04.7H20 1 g，所述液体培养基pH自然；
每1 L所述选择性分离培养基含有:自制玉米芯木聚糖8g、KN03 lg、NaCl 0.5g、MgS04
?7H20 0.5g、K2HP04lg、琼脂20g，所述平板固体培养基pH自然；
每1 L所述摇瓶上种子培养基含有:可溶性淀粉20g、KN03 lg、K2HP04 0.5g、MgS04.7H20 0.5g、NaCl 0.5 g、FeS04.7H20 0.0lg，所述液体培养基 pH 自然；
每1 L所述固体斜面培养基含有:可溶性淀粉20g/L、KN03 lg/L、K2HP04 0.5g/L、MgS04
?7H20 0.5g/L、NaCl0.5 g/L、FeS04.7H20 0.01 g/L、琼脂 20 g/L 0.1MPa 灭菌20min,所述斜面固体培养基pH自然；
每1 L所述摇瓶上复筛发酵培养基含有:玉米芯粉20g、酵母粉10 g、K2HP04 0.5g、Na2HP04 0.5g、MgS04.7H20 1.0g，所述发酵培养基 pH5.5。
[0023](3)实验中所用溶液
无菌生理盐水:取8.5g氯化钠溶于1L的蒸馏水中溶解，0.1MPa灭菌20min。
[0024]⑷实验步骤
从造纸厂采集土样10份，水样6分。首先从每份样品中取一定样品，用无菌生理盐水将样品打散；再用富集培养基(自制玉米芯木聚糖10g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、K2HP04 1.5 g/L、MgS04.7H20 1 g/L 0.1MPa 灭菌 20min) 30°C培养 Id ;接着用生理盐水梯度稀释成不同的土壤悬液，取0.1ml涂布于选择性分离平板置37°C条件下，培养2-4d，挑取透明圈大且明显的放线菌形态的菌株作为初筛菌株；挑出平板上的单菌落，接入斜面固体培养基保藏备用。
[0025]通过摇瓶发酵试验验证，获得了一株利用玉米芯粉产木聚糖酶能力较强的异硫链霉菌{Streptomyces alth1ticus) LMZY，于2014年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC Μ 2014110。
[0026]实例二:异硫链霉菌LMZY的培养条件优化
(1)菌株:实例一筛选出的菌种异硫链霉菌LMZY
(2)方法步骤:
发酵培养基为初始培养基(玉米芯粉20g/L、酵母粉10 g/L、K2HP04 0.5g/L、Na2HP040.5g/L、MgS04.7H20 l.0g/L)。初始发酵条件为:自然pH，接种量10%，装液量50 ml/250ml, 37 °C，180r/min 摇瓶发酵 72h。
[0027]采用单因素试验考察异硫链霉菌LMZY的发酵温度、初始pH、发酵周期、接种量、装液量对木聚糖酶产量的影响。
[0028]a.发酵周期的优选试验
其它发酵条件为初始发酵条件，每隔12h取样测量木聚糖酶酶活，确定异硫链霉菌LMZY产木聚糖酶的最优发酵周期。
[0029]由图1可知，当发酵到120h时酶活最高，为3.546U/ml。故选择发酵周期为120h。
[0030]b.发酵温度的优选试验
发酵时间取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，分别在25 °C、28 °C、31 °C、34 °C、37 °C、40 1:和43 °C摇床中进行发酵培养后测定木聚糖酶酶活，考察温度对异硫链霉菌LMZY产木聚糖酶的影响。
[0031]由图2可知，当发酵温度为40°C时，酶活最高，为4.129 U/ml。故选择发酵温度为40。。。
[0032]c.接种量的优选试验
发酵时间和发酵温度取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%和12%时，考察接种量对异硫链霉菌LMZY产木聚糖酶的影响。
[0033]由图3知，当接种量为6%时，酶活最高，为4.589U/ml。故选择接种量为6%。
[0034]d.初始pH的优选试验
发酵时间、温度、和接种量取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，调整初始pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，摇瓶发酵培养后测定木聚糖酶酶活，考察PH对异硫链霉菌LMZY产木聚糖酶的影响。
[0035]由图4可知，当发酵初始pH为5.0时，酶活最高4.876U/ml。故选择初始pH为5.0。
[0036]e.发酵摇瓶装液量的优选试验
发酵时间、温度、和接种量和初始PH取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，采用250 ml摇瓶装液，摇瓶装液量分别为30ml、50ml、70ml、90ml时，考察装液量对异硫链霉菌LMZY产木聚糖酶的影响。
[0037]由图5可知，当摇瓶装液量为50ml (摇瓶体积250ml)时，酶活为4.887U/ml。故选择装液量为50ml (摇瓶体积250ml)。
[0038]实例三:发酵验证试验
以异硫链霉菌LMZY为发酵菌株；培养条件为发酵时间120h，温度40°C，接种量6%，初始ρΗ5.0，装液量50ml (摇瓶为250ml);培养基成分为:玉米芯粉31.45g/L、大豆粉16 g/L、硝酸钾 8g/L、K2HPO4 0.4g/L、Na2HPO4 0.528g、MgSO4.7H20 0.4g/L，进行发酵验证试验。发酵后所得发酵液中木聚糖酶活为38.86U/ml。
【权利要求】
1.异硫链霉菌(5.^Γ<9/7?ο?_7--(95.LMZY,它的专利保藏编号为 CCTCC Μ2014110。
2.权利要求1所述的异硫链霉菌LMZY发酵产木聚糖酶的工艺。
3.权利要求1所述的异硫链霉菌LMZY在利用农业废弃物玉米芯粉生产木聚糖酶的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104263667SQ201410260651
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】蔡俊, 罗玲, 王常高, 杜馨, 周安盛, 向梦雄 申请人:湖北工业大学