一种利用snp提高白桦细胞中总三萜和齐墩果酸含量的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程领域，具利用体涉及一种利用SNP提高白桦细胞中白桦三萜和齐墩果酸含量的方法。以白桦花药悬浮细胞为实验材料，按50g/L接种量接种于100mL?B5液体培养基中，培养条件为：120rpm，25℃，光照强度2000lx，光周期16h，湿度40％～50％，培养周期为10d。培养基成分为B5基本培养基，附加激素及浓度为0.2mg/L6-BA和0.6mg/L?TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白1g/L，pH5.5～6.0，121℃高温高压灭菌20min。在细胞悬浮培养第8天加入SNP使其终浓度为1mmol/L，培养12h后收获，齐墩果酸含量最高为1.3089mg/gDW，是对照组的569％。培养48h收获，细胞内总三萜含量达到23.86mg/gDW，为对照组的143.20％。该申请发明为解决天然植物药物来源紧缺和工业化大规模生产白桦三萜和齐墩果酸药物提供了一种新途径。
【专利说明】—种利用SNP提高白桦细胞中总三萜和齐墩果酸含量的方法
所属【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用SNP提高白桦细胞中总三萜和齐墩果酸含量的方法。
【背景技术】
[0002]白桦树皮中具有重要的三萜类物质，三萜类物质可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡或者抑制血管生成等方式发挥抗肿瘤作用，此外三萜类物质还有抗炎、抗病毒的作用。随着三萜化合物生物活性的发现其在医药卫生方面的价值逐步显现，目前已有以齐墩果酸等为主要成分的药物投入临床使用。然而，树木生长周期长，若获得白桦三萜需对树木进行砍伐或扒皮，破坏资源，加之其结构复杂，人工方法合成效率低，成本高等因素而成为制约其不能进行临床大规模应用的主要原因。以细胞全能性为基础建立起来的植物细胞培养技术为植物药生产提供了一条新途径。由于利用植物细胞培养法生产植物天然活性物质具有不受气候、病虫害等自然条件的影响，而且不占用土地，不消耗自然资源，生产周期短和人为可控等优点，因而被认为是解决植物药生产与天然植物资源可持续发展之间矛盾的一种新型生物技术。大量研究表明NO是植物次生代谢产物合成信号转导网络中的关键分子，具有重要作用。但目前尚未见使用NO的供体物质SNP促进白桦花药的愈伤组织和悬浮培养细胞进行合成白桦三萜和齐墩果酸的报道。
【发明内容】
: [0003]为保护白桦自然资源，建立可持续开发利用的资源生产程序，利用来自白桦花药诱导的愈伤组织和悬浮培养细胞，进行总三萜和齐墩果酸的合成与生产，同时利用高效液相色谱法进行定量检测。为进行工业化法大规模生产总三萜和齐墩果酸类药物的提供了新方法。
[0004]技术方案是:在超净工作台上，切下雄穗，用70%酒精浸泡5min，再用5%的次氯酸钠溶液消毒20min，然后放于已灭菌的培养皿中，选择适宜大小的雄穗，在解剖镜下用解剖针剥开雄穗，取出花药，接种到预先经过高温高压灭菌的各种组合的培养基上(NT+1.0mg/L 水解酪蛋白 +3%蔗糖 +0.5 ~4.0mg/L2，4_D，0.2 ~4.0mg/L KT)进行愈伤组织的诱导。每瓶接种大约30-35个花药。先用暗培养一周后进行光培养。培养约7周后，获得花药培养愈伤组织。愈伤组织经过继代培养后，迅速增殖。
[0005]选择细胞生长速度快，松散且总三萜物质含量高的愈伤组织，进行继代和悬浮培养。并在有利于白桦悬浮细胞生长和次生代谢产物积累的B5+0.1~0.3mg/L6-BA+0.5~1.0mg/L TDZ悬浮培养基中培养细胞系。获得高产白桦三萜和齐墩果酸悬浮细胞系，经过滤，烘干，粉碎，有机溶剂(95%乙醇)提取步骤，利用液相色谱方法对白桦酯醇和齐墩果酸检测和定量分析。
[0006]本专利具有以下特点:[0007]I)生产环境不受地域、季节、水质、病虫害、气候等自然环境的影响。
[0008]2)生产周期短，生产过程不产生大量废渣废水，安全无污染，具有生态效益。
[0009]3)培养的白桦悬浮细胞具有生产白桦三萜和齐墩果酸等多种物质的能力，实现了白桦天然植物资源及其药用成分的开发利用。
[0010]4)利用高效液相色谱方法进行齐墩果酸进行检测，方法简单，提取溶剂清洁无毒，操作方便。
[0011]5)为解决抗艾滋病和抗肿瘤天然药物来源紧缺，加速临床大规模应用，提供一种新途径，具有很高的经济效益和社会效益。
【具体实施方式】
[0012]I)植物材料来源
[0013]白桦取自东北林业大学白桦强化种子园内的开花优树。选择雄穗，取出花药，消毒后接种到预先经过高温高压灭菌的各种组合的培养基上(NT+1.0mg/L水解酪蛋白+3%蔗糖+0.5~4.0mg/L2,4-D, 0.2~4.0mg/L KT)进行愈伤组织的诱导。愈伤组织经过继代培养后，迅速增殖。 挑选生长状态良好的愈伤组织将其多次继代后转移至液体培养基悬浮培养。经过6代以上的转接，建立稳定的悬浮培养细胞体系，悬浮培养继代周期为15d，接种量为5g细胞于10mL液体培养基中。
[0014]2)培养条件
[0015]以白桦花药悬浮细胞为实验材料，按50g/L接种量接种于10mL B5液体培养基中，培养条件为:120rpm，25°C，光照强度2000Ix，光周期16h，湿度40 %~50 %，培养周期为1d0培养基成分为B5基本培养基，附加激素及浓度为0.2mg/L6-BA和0.6mg/L TDZ,蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L，pH5.5~6.0，121 °C高温高压灭菌20min。
[0016]3)诱导子添加
[0017]SNP(Sodium Nitroprusside)购自美国Sigma公司，溶于灭菌蒸懼水中后经
0.22 μ m微孔滤膜过滤，在白桦花药悬浮细胞培养至第8天时添加入培养基中，终浓度分别为lmmol/L,添加后12h,48h收获细胞。
[0018]4)总三萜的提取及含量测定
[0019]精密称取0.05g细胞干样，加入2ml95%乙醇并浸泡24h。70°C水浴Ih后再超声40min，取100 μ L上清液于1ml离心管中并置于70°C水浴蒸干。加入200 μ L5%香草醛-冰乙酸和800 μ L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷却。乙酸乙酯定容至5ml后测定其在551nm的吸光值(对照组为200 μ L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯)。
[0020]总三萜的标准曲线以齐墩果酸为标准品进行绘制，其回归方程为y =43.044x-0.6438，相关系数R2 = 0.997，齐墩果酸在4~32mg/L含量范围内具有良好的线性关系。
[0021]5)齐墩果酸的提取及含量测定
[0022]齐墩果酸的提取参照谭朝阳[80]等的方法，具体方法如下:精密称取0.5g细胞干样，加入25mL盐酸-乙醇溶液(2: 8)，加热回流3h，放冷，摇匀并滤过，精密量取续滤液15mL,加蒸馏水15mL，置于80°C水浴上蒸去乙醇，然后用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚萃取液并于40°C低温蒸干，加Iml甲醇溶解残渣，并将其用0.45 μ m有机滤膜滤过，此为样品检测液，然后利用高效液相色谱进行检测。
[0023]高效液相色谱(HPLC)检测条件:用Waters公司600-717-2487色谱系统，色谱柱HiQ sil C18V4.6mmX 250mm ;流动相为乙腈:水=9:1 ;柱温25V ;灵敏度16AUFS ;流速
1.0mT,/miη ;检测波长 210nm,进样 20uL。
[0024]齐墩果酸线性关系考察:精密吸取浓度为0.5mg/mL的齐墩果酸标准品溶液0.2、
0.5、l、2、3、4、5mL，分别置于5mL容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取20 μ L进样，测定其峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。齐墩果酸回归方程为:y = 107x+33446, R2 = 0.9992。结果表明，齐墩果酸在0.2-5.0 μ g范围内具有良好的线性关系。
[0025]本发明的效果:本发明利用SNP来促进细胞生产的能力，获得的白桦总三萜和齐墩果酸含量大大提高。由上述技术方案，以白桦花药悬浮细胞为材料进行实验，其结果是:SNP处理后，白桦花药悬浮细胞中齐墩果酸含量为1.3089mg/gDW，是对照组的569%。细胞内总三萜含量达到23.86mg/gDW，为对照组的143.20%。因此，这是一种很有工业应用前景的白桦总三萜和齐墩 果酸的生产方法。
【权利要求】
1.本专利提出NO促进白桦三萜合成技术为:以白桦花药悬浮细胞为实验材料，按50g/L接种量接种于10mL B5液体培养基中，培养条件为:120rpm，25°C，光照强度20001x，光周期16h，湿度40%~50%，培养周期为10d。培养基成分为B5基本培养基，附加激素及浓度为 0.1 ~0.3mg/L6-BA 和 0.5 ~4.0mg/L TDZ,蔗糖 20g/L,酸水解酪蛋白 lg/L，ρΗ5.5 ~6.0，121 °C高温高压灭菌20min。在细胞悬浮培养第8天加入SNP使其终浓度为lmmol/L，培养12h后收获，齐墩果酸含量最高为1.3089mg/gDff,是对照组的569 %。培养48h收获，细胞内总三萜含量达到23.86mg/gDW，为对照组的143.20%。
2.根据权利要求书I所述的方法，其中的液体培养基为为B5基本培养基，附加激素及浓度为0.1~0.3mg/L6-BA和0.5~4.0mg/L TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L。
3.根据权利要求书I所述的方法，其中的白桦花药细胞接种量为5g鲜细胞含10ml培养液的250ml三角瓶中，摇床转速120r/min。
4.根据权利要求书I所述的方法， 其中SNP溶液通过0.22um无菌膜过滤除菌，在悬浮培养第八天加入，培养周期为10天，且SNP的终浓度为lmmol/L。
5.根据权利要求书I所述的方法，其中的收获时间为SNP添加12-24h后收获悬浮细胞。
6.根据权利要求书I所述的方法，其中SNP处理后齐墩果酸含量最高为1.3089mg/gDff,是对照组的569%。细胞内总三萜含量达到23.86mg/gDff,为对照组的143.20%。
【文档编号】C12P33/00GK104031970SQ201410260611
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2013年12月22日
【发明者】詹亚光, 曾凡锁, 辛颖, 刘堃, 齐凤慧, 范桂枝, 尹静, 由香玲 申请人:东北林业大学, 詹亚光, 曾凡锁