乌苏型三萜3,25?环氧?1α,3α,11α,12,23,25?六羟基?乌苏?12?烯及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种式(I)所示的乌苏型三萜3,25?环氧?1α,3α,11α,12,23,25?六羟基?乌苏?12?烯及其制备方法，本发明所述乌苏型三萜3,25?环氧?1α,3α,11α,12,23,25?六羟基?乌苏?12?烯的提取、分离、纯化方法简单，抑制肿瘤细胞活性明确，具有潜在的开发为抗肿瘤药物的价值，该化合物化学结构经过波谱学数据得到确认，不存在光学异构体，可以避免光学异构体潜在的风险；。
【专利说明】
乌苏型三萜3,25-环氧-1 α , 3α , 11 α , 12,23,25-六羟基-乌苏-12-稀及其制备方法和应用 (一)
技术领域
[00011 本发明涉及一种乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯及其制备方法和应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 卫矛科植物中的巧茶属（Catha Benth.)、南蛇藤属（Celastrus L.)、十齿花属 (Dipentodon Dunn)、卫矛属（Euonymus I·)、沟辦属（Glyptopetalum Thw·)、美登木属 (Maytenus Molina)、假卫矛属（Microtropis wall.ex Mcissa)、核子木属（Perrottetia Η.B.K.)、雷公藤属(Tripterygium Hook.F.)的某些植物在我国作为药用植物和民间药用 植物。传统中医认为其具有清热、祛风、除湿、活血、解毒、消肿的功效，常用于治疗风湿积累 的风湿性关节炎、腰腿痛、筋骨痛、牙痛、闭经、痢疾、跌打损伤、肠风痔漏、毒蛇咬伤、疮疡、 痈疖等症;现代药理研究表明本科植物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗生育、昆虫拒食及毒杀等 活性，目前多用于治疗风湿性及类风湿性关节炎、血液病及皮肤病，也用作农用杀虫剂。
[0003] 因此对该类植物进行系统、科学的研究，探明其有效成分及作用机理，发现一些结 构新颖的活性成分，将对更深层开发利用卫矛科药用植物的食疗保健产品、开发治疗药物 及临床应用产生重要意义。
[0004] 三花假卫矛（学名：Microtropis triflora)是卫矛科假卫矛属（Microtropis Wal 1. ex Meissn.)植物，灌木，高2.5~5米，是中国的特有植物。分布于中国大陆的云南、贵 州、四川、湖北等地，生长于海拔1300~2100米的地区，一般生长在林中以及山坡林缘。
[0005] 本发明以三花假卫矛植物藤茎为研究对象，进行提取、分离、纯化、结构鉴定得到 3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯，属于乌苏型三萜化合物，该化合物 具有一定程度的抗肿瘤活性。 (三)
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏- 12-烯及其制备方法和应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯，其结构式 如式(I)所示：
[0010] 一种式（I)所示的乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯的制备方法，所述的制备方法按如下步骤进行：
[0011] (1)甲醇浸提:将三花假卫矛的藤茎粉碎干燥，加入甲醇浸提提取，之后滤除不溶 物，滤液减压蒸干得到甲醇浸膏；
[0012] 步骤(1)中，所述甲醇浸提提取的具体操作方法为:将粉碎干燥后的三花假卫矛藤 茎与甲醇以料液质量比1:3~5混合，常温(20~30°C)浸提5~10天，过滤得到甲醇提取液， 滤渣重复浸提2~4次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到甲醇浸膏。
[0013] (2)乙酸乙酯萃取:步骤（1)所得甲醇浸膏用乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干得到 乙酸乙酯浸膏；
[0014] 步骤(2)中，所述乙酸乙酯萃取的具体操作方法为:将步骤（1)所得甲醇浸膏分散 于5~10倍质量的水中，得到悬浮液，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压 回收溶剂，得到乙酸乙酯浸膏。
[0015] (3) -次柱层析：用200~300目柱层析硅胶对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏进行柱层 析分离，以石油醚/乙酸乙酯体积比5:1~1:5的混合液和乙酸乙酯(纯)为洗脱剂，进行梯度 洗脱，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得粗品；
[0016] 步骤(3)中，所述梯度洗脱的具体操作方法为：以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为 5:1、1:1、1:3、1:5的混合液、乙酸乙酯（纯)为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为5~ 7mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300~400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压 蒸除溶剂得粗品。
[0017] (4)二次柱层析：用300~400目柱层析硅胶继续对步骤(3)所得粗品进行柱层析分 离，以石油醚/乙酸乙酯体积比4:1~1: 2的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集含目标化 合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到固体物质；
[0018] 步骤(4)中，所述梯度洗脱的具体操作方法为：以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为 4:1、2:1、1:1、1:2的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为3~4mL/min，每种梯 度的洗脱剂的洗脱时间为50~70min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到固体 物质。
[0019] (5)洗涤除杂：将步骤(4)所得固体物质用石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行洗涤除 杂，最后干燥得到所述式（I)所示的乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯；
[0020] 步骤(5)所述的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:1; 所述洗涤除杂的具体操作方法为:在离心管中加入所述固体物质，再加入固体物质的质量2 ~3倍的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，40ΚΗζ超声10s，离心，去除上清液，重复洗涤3次，最后 干燥得到产物。
[0021 ]本发明所述步骤(3)、（4)的柱层析过程中，可通过薄层层析(TLC)检测收集含目标 化合物(乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯）的洗脱液;所述 的目标化合物用TLC检测时，以石油醚:乙酸乙酯=1:2为展开剂，其R f值为0.3。
[0022] 经实验证明，本发明所述乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌 苏-12-烯在制备抗肿瘤活性药物中具有应用前景。
[0023] 本发明所述乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯与 DDP对照组相比较，高浓度时对人乳腺癌Bcap37细胞及人肝癌SMMC7721细胞具有显著的体 外增殖抑制作用，且对S丽C7721细胞的抑制作用强于Bcap37细胞，这提示该化合物具有潜 在的抗肿瘤活性。
[0024]本发明的有益效果在于：本发明所述乌苏型三萜3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23， 25-六羟基-乌苏-12-烯的提取、分离、纯化方法简单，抑制肿瘤细胞活性明确，具有潜在的 开发为抗肿瘤药物的价值，该化合物化学结构经过波谱学数据得到确认，不存在光学异构 体，可以避免光学异构体潜在的风险。 (四）
【附图说明】
[0025]图1为实施例5中DDP、乌苏型三萜(I)对两种癌细胞的半致死浓度(IC50);
[0026] 图2为实施例5中乌苏型三萜(I)对两种癌细胞的生长抑制率。 (五)
【具体实施方式】
[0027] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于 此。
[0028] 实施例1:3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯的制备 [0029] (1)甲醇浸提:将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎500g与甲醇2000mL混合，常温浸提 7天，过滤得到甲醇提取液，滤渣重复浸提3次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到甲 醇浸膏60g。
[0030] (2)乙酸乙酯萃取:将步骤（1)所得甲醇浸膏60g分散于水300mL中，得到悬浮液，用 等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯浸膏20g。
[0031] (3)-次柱层析：用200~300目柱层析硅胶200g对步骤（2)所得乙酸乙酯浸膏20g 进行柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5:1、1:1、1:3、1:5的混合液和乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为7mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 300min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得粗品1.3g;
[0032] (4)二次柱层析：用300~400目柱层析硅胶100g继续对步骤(3)所得粗品1.3g进行 柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为4 :1、2:1、1:1、1:2的混合液为洗脱剂，进行 梯度洗脱，洗脱剂的流速为4mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为50min，收集含目标化 合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到固体物质〇. 2g;
[0033] (5)洗涤除杂:在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.2g，再加入石油醚/乙酸乙 酯体积比1:1的混合溶剂0.4mL，40KHZ超声10s，离心，去除上清液，重复洗涤3次，最后干燥 得到产物3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯0 · 15g。
[0034] 实施例2:3，25-环氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯的制备：
[0035] (1)甲醇浸提:将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎1000g与甲醇3000mL混合，常温浸 提5天，过滤得到甲醇提取液，滤渣重复浸提4次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到 甲醇浸膏11 〇g。
[0036] (2)乙酸乙酯萃取:将步骤（1)所得甲醇浸膏110g分散于水1000mL中，得到悬浮液， 用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯浸膏38g。
[0037] (3)-次柱层析：用200~300目柱层析硅胶300g对步骤（2)所得乙酸乙酯浸膏38g 进行柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5:1、1:1、1:3、1:5的混合液和乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为5mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得粗品2.8g;
[0038] (4)二次柱层析：用300~400目柱层析硅胶250g继续对步骤(3)所得粗品2.8g进行 柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为4 :1、2:1、1:1、1:2的混合液为洗脱剂，进行 梯度洗脱，洗脱剂的流速为3mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为70min，收集含目标化 合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到固体物质〇. 45g;
[0039] (5)洗涤除杂：在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.45g，再加入石油醚/乙酸 乙酯体积比1:1的混合溶剂1.0mL，40KHZ超声10s，离心，去除上清液，重复洗涤3次，最后干 燥得到产物3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯0.41g。
[0040] 实施例3:3，25-环氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯的制备：
[0041] (1)甲醇浸提:将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎500g与甲醇2500mL混合，常温浸提 10天，过滤得到甲醇提取液，滤渣重复浸提2次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到 甲醇浸膏65g。
[0042] (2)乙酸乙酯萃取:将步骤（1)所得甲醇浸膏65g分散于水400mL中，得到悬浮液，用 等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯浸膏22g。
[0043] (3)-次柱层析：用200~300目柱层析硅胶200g对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏22g 进行柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5:1、1:1、1:3、1:5的混合液和乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为6mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 350min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得粗品1.5g;
[0044] (4)二次柱层析：用300~400目柱层析硅胶150g继续对步骤(3)所得粗品1.5g进行 柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为4 :1、2:1、1:1、1:2的混合液为洗脱剂，进行 梯度洗脱，洗脱剂的流速为3mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为65min，收集含目标化 合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到固体物质〇.25g;
[0045] (5)洗涤除杂:在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.25g，再加入石油醚/乙酸 乙酯体积比1:1的混合溶剂0.75mL，40KHZ超声10s，离心，去除上清液，重复洗涤3次，最后干 燥得到产物3，25-环氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯0 · 22g。
[0046] 实施例4:化合物测试 [0047]表1:实验所用仪器
质谱仪 ESI-MS LCQ-Flcct Thermo Fisher Scientific 參司
[0049] 熔点分析仪 ΜΡΛΙΟΟ 美国SRS公司
[0050] 试剂:核磁共振使用氘代DMS0 (二甲亚砜)试剂，质谱使用德国默克(Merck)色谱纯 试剂。
[0051 ]对实施例1、实施例2或实施例3制得的乌苏型三萜化合物（I)进行理化性质和波谱 学分析，m.p.288-290°C，ESI-MS测定值m/z:521[M+H] +，结合匪R数据确定其分子式为 C30H48〇7，分子量为520，不饱和度为7。
[0052]表2:所得乌苏型三萜化合物（I)的NMR数据
[0055] 实施例5:抗肿瘤活性测试
[0056] 我们对实施例1制得的乌苏型三萜(I)进行了体外抗肿瘤活性测试。
[0057]方法：取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度，每孔100此细胞悬液接种于96 孔细胞培养板中，接种24h后给药（100μL孔），分别设细胞对照组以及4个浓度受试药物组。 继续培养72h后每孔加入100yL MTT(lmg/mL，以DMEM培养液溶解），37°C孵育2h，弃去各孔内 液体后加入150yL酸化异丙醇(含0.04mol/L HC1)，避光放置30min，DG3022A型酶联免疫检 测仪测定570nm处吸光度，计算各受试药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，以孙瑞元教授编写的 NDST计算机程序计算各受试药物的半数抑制浓度(IC50)。
[0058]结果:实施例1所制得的乌苏型三萜（I)与DDP对照组相比较，高浓度时对人乳腺癌 Bcap37细胞及人肝癌SMMC7721细胞具有显著的体外增殖抑制作用，其中对SMMC7721细胞的 抑制作用强于Bcap37细胞。这提示该化合物是潜在的抗肿瘤活性的药物(如图1、2所示）。
【主权项】
1. 一种乌苏型三萜3，25-环氧-la，3a，1 la，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯，其结构式如 式(I)所示：2. -种如权利要求1所述的式（I)所示乌苏型三萜3，25-环氧-la，3a，1 la，12，23，25-六 羟基-乌苏-12-烯的制备方法，其特征在于，所述的制备方法按如下步骤进行： (1) 甲醇浸提:将三花假卫矛的藤茎粉碎干燥，加入甲醇浸提提取，之后滤除不溶物，滤 液减压蒸干得到甲醇浸膏； (2) 乙酸乙酯萃取：步骤（1)所得甲醇浸膏用乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干得到乙酸 乙酯浸膏； (3) -次柱层析：用200~300目柱层析硅胶对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏进行柱层析分 离，以石油醚/乙酸乙酯体积比5:1~1:5的混合液和乙酸乙酯为洗脱剂，进行梯度洗脱，收 集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得粗品； (4) 二次柱层析：用300~400目柱层析硅胶继续对步骤(3)所得粗品进行柱层析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比4:1~1:2的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集含目标化合物 的洗脱液，减压蒸除溶剂得到固体物质； (5) 洗涤除杂:将步骤(4)所得固体物质用石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行洗涤除杂，最 后干燥得到所述式（I)所示的乌苏型三萜3，25-环氧-la，3a，1 la，12，23，25-六羟基_乌苏_ 12-稀。3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)甲醇浸提的操作方法为:将 粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎与甲醇以料液质量比1:3~5混合，常温浸提5~10天，过滤得 到甲醇提取液，滤渣重复浸提2~4次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到甲醇浸膏。4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)乙酸乙酯萃取的操作方法 为:将步骤(1)所得甲醇浸膏分散于5~10倍质量的水中，得到悬浮液，用等体积的乙酸乙酯 萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯浸膏。5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中，所述梯度洗脱的操作方法 为：以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5:1、1:1、1 :3、1:5的混合液、乙酸乙酯为洗脱剂，进行 梯度洗脱，洗脱剂的流速为5~7mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300~400min，收 集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得粗品。6. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述梯度洗脱的操作方法 为：以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为4:1、2:1、1:1、1:2的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱， 洗脱剂的流速为3~4mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为50~70min，收集含目标化合 物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到固体物质。7. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)洗涤除杂的操作方法为:在 离心管中加入所述固体物质，再加入固体物质的质量2~3倍的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂， 40KHz超声10s，离心，去除上清液，重复洗涤3次，最后干燥得到产物;所述的石油醚/乙酸乙 酯混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:1。8. 如权利要求1所述的乌苏型三萜3，25-环氧-la，3a，1 la，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯在制备抗肿瘤活性药物中的应用。9. 如权利要求8所述的乌苏型三萜3，25-环氧-la，3a，1 la，12，23，25-六羟基-乌苏-12-烯在制备抗人乳腺癌或人肝癌药物中的应用。
【文档编号】C07J71/00GK106046109SQ201610438998
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】王奎武, 周蔓青
【申请人】浙江工商大学