专利名称：一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及医学领域，具体地，本发明涉及一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法。
背景技术：
肿瘤发病率从 有癌症记录以来，一直呈上升的趋势，特别是过去二三十年以来，肿瘤发病率以每年3%-5%的速度增长。随着肿瘤发病率的增长，针对肿瘤的治疗方案也在不断发展，免疫治疗是其中一种重要的治疗手段，此种治疗手段对于清除肿瘤患者体内残留的和转移的肿瘤细胞、防止肿瘤的转移和复发及提高患者的生存率具有重要的意义。其中细胞生物治疗已经初露锋芒，并成为肿瘤治疗的重要发展方向。继淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)及CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)后，细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer,CIK)的杀瘤作用日益受到重视。CIK细胞最早于1991年由美国斯坦福大学Schmidt Wolf等首次报道，他们发现在多种细胞因子(干扰素、CD3单克隆抗体、白介素I和白介素2)作用下，外周血淋巴细胞可以被定向诱导并大量增殖成为肿瘤杀伤细胞。由于此类细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，因此具有T细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞(NK)的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤等优点。与其他过继性免疫治疗细胞相比，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤范围广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点。因此，CIK细胞被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选方案。Schmidt Wolf 等使用常规密度梯度离心方法分离健康成人外周血，制备单个核细胞悬液，调整细胞浓度为I X IO6个/ml进行培养，于培养第I天在培养体系中加入I X IO3U/ml的干扰素-Y (Interferon-gamma, IFN-Y ),培养24小时后加入3X 102U/ml的重组人IL-2,lX102U/ml的重组人IL-l，50mg/ml的⑶3单克隆抗体，以后每3天更换一次新鲜培养液并补充重组人IL-2，并调整细胞浓度至2X IO8L'郝希山、任秀宝等将纤连蛋白(Fibronectin, FN)的活性片段作为细胞因子添加到CIK细胞培养体系中，得到的细胞群中含有高比例的在细胞表面同时表达CD3、CD56分子的细胞。CIK细胞体外大量增殖并获得强大的细胞毒活性与多种因素密切相关，这些因素包括细胞因子IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN和⑶3单克隆抗体等，其中IL-2是T细胞分泌的一种细胞因子(由133个氨基酸组成的多肽，相对分子质量约为15 X IO3)。它是人体免疫应答的核心物质，能促进所有亚型的T细胞增殖，是效应最强的细胞因子，虽然CIK细胞的体内杀瘤活性不依赖IL-2的存在，但在体外大量培养时，IL-2可促进CIK细胞增殖和杀伤活性。⑶3单克隆抗体(⑶3McAb)作为一种有丝分裂促进剂可促进细胞增殖。在采自淋巴瘤患者外周血的CIK细胞中加入抗CD3单克隆抗体，并将其与多种淋巴瘤和白血病细胞株共孵育，这些细胞株对于CIK细胞介导的溶细胞作用的敏感性明显增加。纤连蛋白(fibronectin,FN)是一种位于细胞外基质中的大分子糖蛋白，分子量约550KD。FN由成纤维细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞等合成并分泌，参与细胞黏附、迁移、凋亡、形态改变等过程，具有止血、损伤修复等功能。由于FN分子量大，全分子表达存在基因工程上的困难。因此人们试图表达FN功能多肽并研究其功能，以期代替FN。细胞与FN的连接由整联蛋白介导，主要是整联蛋白a 5 ^ 1，又称极晚期活化抗原VLA-5，可识别FN细胞结合结构域I (Cell-I)的RGD序列；整联蛋白a 40 I，即VLA-4，可以与细胞结合结构域II(Cell-II)的CSl及CS5结合；硫酸软骨素蛋白聚糖及⑶44分子可与FN羧基端肝磷脂结合结构域(Heparin-II)结合。美国专利第5198423号中成功构建了含有FN三个关键结构域的质粒，并转入大肠杆菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)。研究表明，含有FN三个关键的功能结构域，即细胞结合域(cell binding domain)、肝憐脂域(heparin domain)和CS-1区域的多肽能够发挥FN的主要生理功能。该多肽可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。在培养淋巴细胞时加入该多肽和抗CD3抗体，该多肽能够与静息状态的T细胞表面整合素家族成员VLA-4、VLA-5相结合，抗CD3抗体可与T细胞上的TCR结合，两者共同作用激活酪氨酸激酶ppl25FAK，然后通过Ras途径刺激T细胞的增殖和分化。吸附在培养介质上的重组该多肽可以在CD3单克隆抗体的协同作用下刺激T细胞活化。细胞粘附分子(cell adhesion molecule, CAM)是介导细胞与细胞或细胞与外基质间相互接触和结合的膜表面糖蛋白。细胞间粘附分子-I (intercellular cell adhesionmolecule-1, I CAM-1)是一种重要的细胞粘附分子，它由Rothlein等于1986年在研究淋巴细胞粘附时发现。人ICAM-I基因定位于染色体19P 13. 3-13. 2区，长15. 5k b，含7个外显子和6个内含子。人ICAM-I为经由长3. 3kb的可诱导的mRNA编码的单链糖蛋白，属免疫球蛋白超家族，由于糖基化程度不同，不同种类细胞的ICAM-I分子量有所不同，介于76-114kD，其中核心多肽的分子量为55KD。在结构上ICAM-I分为细胞外功能区、跨膜区和胞质区。细胞外功能区由483个氨基酸组成，含有5个免疫球蛋白(Ig)样功能区，每个Ig样区由一个单独的外显子编码。信号肽和跨膜区及胞浆区分别由两个不同的外显子编码。其膜外NH2-端的第1,2功能区为淋巴细胞功能相关抗原-I (lymphocyte functionalantigen-l，LFA-l)的结合部位。第2和第3结构域之间有一段连接序列，富含脯氨酸，类似免疫球蛋白的绞链区，可发生扭曲。以此连接区为界，氨基端的I-II结构域可结合LFA-I分子和鼻病毒，而羧基端侧的III结构域可以结合巨噬细胞分化抗原-I分子(Mac-1)。LFA-I是ICAM-I的主要受体，Mac-I与ICAM-I的亲和力较低，且在激活的白细胞上只有一小部分Mac-I (约10% )可介导ICAM-I粘附。ICAM-I的主要胞外功能结构域为NH2段I-II结 构域，经序列分析及文献检索，ICAM-IN段Q28-T207的180个氨基酸为主要功能序列，在ICAM-I与LFA-I分子结合过程中发挥关键作用。在现有的细胞免疫治疗方案中，淋巴细胞体外高效增殖过程十分关键，而其中如何提高外周血单个核细胞体外扩增效率依然是目前本领域尚待完善的问题；另一方面，CIK细胞中起到关键杀瘤作用的是CD3/CD56双阳性细胞，因此在提高细胞增殖数量的基础上，提高⑶3/⑶56双阳性细胞的比例显得同样重要。现有技术得到的CIK细胞中⑶3/⑶56双阳性细胞的比例仅占总细胞数的10-30%，无法充分满足有效治疗的需要，因此需要寻找新的培养方法来提高CD3/CD56双阳性细胞的比例
发明内容
针对现有技术中外周血单个核细胞体外扩增效率及CIK细胞中⑶3/⑶56双阳性细胞所占比例均偏低的问题，本发明提供一种提高人体外周血单个核细胞体外扩增效率和CIK细胞中CD3/CD56双阳性 细胞所占比例的制备人细胞因子诱导的杀伤细胞的方法。本发明的目的通过以下技术手段得以实现一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前用含有有效量的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶的步骤，和在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体的步骤；其中所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-I功能结构域和人纤连蛋白功能结构域融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-I功能结构域为人细胞间粘附分子-I胞外第1、11结构域，所述人纤连蛋白功能结构域为人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-I结构域，所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。本发明的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中引入融合蛋白ICAM-FN，并在细胞培养全过程中加入CD3单克隆抗体，更好的刺激了淋巴细胞的增殖，同时提高CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例，从而使得外周血单个核细胞体外扩增效率是传统方法的I. 3倍，所得CIK细胞中⑶3/⑶56双阳性细胞所占比例是传统方法的I. 3-6倍，同时还提高了 CD3/CD8双阳性细胞所占比例，增强了 CIK细胞的杀瘤活性，本发明的CIK细胞制备方法相对于传统方法杀瘤活性提高10-40%。
图I为本发明构建的pColdlI-ICAM-FN表达质粒；图2为IPTG诱导前后及不同浓度IPTG诱导的BL21 (DE)表达的ICAM-FN融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中各泳道如下A :蛋白Marker，B :IPTG诱导前阳性菌裂解液上清，C :0. ImM IPTG诱导3h后阳性菌裂解液上清，D :0. 5mM IPTG诱导3h后阳性菌裂解液上清，E 1.0mM IPTG诱导3h后阳性菌裂解液上清；图3为ICAM-FN融合蛋白表达的Western Blot检测结果，其中，泳道A :阳性菌裂解液上清；泳道B :空白对照菌裂解液上清；图4为纯化后的ICAM-FN融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道A :纯化后的目的蛋白；泳道B :蛋白Marker ；图5为PI染色检测CIK细胞活率的流式细胞检测图谱，其中活细胞比率为98. 47% ；图6为CIK细胞生长曲线；图7为本发明的方法得到的CIK细胞与传统方法得到的CIK细胞的细胞表型流式细胞检测图谱比较，其中，A :传统方法得到的CIK检测结果；B:本发明的方法得到的CIK检测结果；图8为本发明的方法得到的CIK细胞与传统方法得到的CIK细胞的杀瘤活性比较，其中，A :传统方法得到的CIK杀伤效率；B :本发明的方法得到的CIK杀伤效率。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明的实施方案中构建了人细胞间粘附分子-I功能结构域和人纤连蛋白功能结构域融合蛋白ICAM-FN，并在原核细胞中进行表达纯化，然后用有效量的重组ICAM-FN和人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶，并用该细胞培养瓶培养经分离得到的人外周血单个核细胞，在该单个核细胞培养过程中于细胞培养液中加入人CD3单克隆抗体进行持续刺激，且人CD3单克隆抗体在细胞培养液中浓度小于前述包被液中浓度，以达到最佳刺激效果，之后检测由单个核细胞诱导得到的CI K细胞的各项指标。其中所述重组ICAM-FN的原核表达采用低温诱导的方式进行，以抑制大肠杆菌自身蛋白表达，便于目的蛋白的纯化。本发明的实施方案中重组ICAM-FN构建及表达过程中使用的分子生物学方法为常规的分子生物学方法，未详述的技术方案可从例如《分子克隆实验指南(第3版)》中获得。本发明实施例提供一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前用含有有效量的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶的步骤，和在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体的步骤；其中所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-I功能结构域和人纤连蛋白功能结构域融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-I功能结构域包含人细胞间粘附分子-I胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-I结构域，所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。本发明的CIK细胞制备方法引入了融合蛋白ICAM-FNjf淋巴细胞进行更有效的刺激，并在细胞培养全过程中加入CD3单克隆抗体，以形成持续的刺激。经测得，该实施例方法得到的外周血单个核细胞体外扩增效率是传统方法的I. 3倍，得到的CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例为传统方法的I. 3_6倍，同时提高了 CD3/CD8双阳性细胞所占比例，因而增强了 CIK细胞的杀瘤活性，提高了细胞免疫治疗的效果。优选地，本发明实施例的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中，所述细胞培养瓶的包被液中，所述融合蛋白浓度为5-25ii g/ml，优选浓度为10-15ii g/ml，所述人⑶3单克隆抗体浓度为I-IOii g/ml,优选浓度为4-7 V- g/ml,最优选浓度为5 y g/ml。该实施例的优选浓度条件下，可得到最佳的刺激效果，有效提高细胞免疫治疗的效果。优选地，本发明实施例的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中，所述细胞培养液中人CD3单克隆抗体浓度为50-100ng/ml。优选地，本发明实施例的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中，所述融合蛋白中人细胞间粘附分子-I功能结构域(ICAM-I)和人纤连蛋白功能结构域(FN)通过柔性肽连接，以利用其柔性使融合的两个结构域ICAM-I和FN在空间上可自由伸展，避免了活性位点的相互掩盖。优选地，所述柔性肽序列为GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: I)。优选地，本发明实施例的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中，所述含有柔性肽的人细胞间粘附分子-I功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白的DNA序列为 SEQ ID NO:2。优选地，在所述融合蛋白的构建过程中，所述人细胞间粘附分子-I功能结构域的正向引物为Pl (SEQ ID NO: 3)，反向引物为P2 (SEQ ID NO:4);所述人纤连蛋白功能结构域的正向引物为P3 (SEQ ID NO: 5)，反向引物为P4 (SEQ IDNO:6)，通过两步PCR法得到拼接到一起的目的基因序列SEQ ID N0:2。优选地，本发明实施例的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中，所述人细胞间粘附分子-I功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白于大肠杆菌中表达，大肠杆菌表达载体是分子生物学常用表达载体，具有成本较低，生长周期短的优点。优选地，所述人细胞间粘附分子-I功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白的表达载体为pColdll，并采用低温诱导的方式表达，优选于15°C诱导表达，以抑制大肠杆菌自身蛋白表达，便于目的蛋白的纯化。以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细描述。实施例一 I.目的基因的获得根据人的ICAM-I和FN基因序列，设计两对引物 人ICAM-I的正向引物P1，反向引物P2;人FN的正向引物P3，反向引物P4。并通过两步PCR获得目的基因序列。弓丨物序列如下Pl :5，-CATCATCATCATCAT CATATG^ CAGACATCTGTGTCCCC-3’ (SEQ ID NO: 3)P 2 : 5 ， - ^gaaccaccaccaccgctaccgccaccgcc
GTAGGGGGCCGAGGTGTTCT-3’ (SEQ ID NO:4)p 3 : 5 ， - Iggcggtggcggtagcggtggtggtggttct
CCCACTGACCTGCGATTCAC-3’ (SEQ ID NO:5)P4 :5，-AGACTGCAGGTCGAC AAC( Tl' TTATGTGGAAGGAACATCCAAGAT-3，(SEQ IDNO: 6)Pl引物5’端引入NdeI酶切位点(下划线且斜体部分)，P2引物5’端引入柔性肽GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: I) cDNA的互补序列(加框部分)，以含有人ICAM_lcDNA序列的质粒(购自Origene)为模板，扩增人ICAM-I胞外第I、II结构域。P3引物5’端引入柔性肽GGGGSGGGGS的cDNA序列(加框部分)，P4引物5’端引入Hind III酶切位点(下划线且斜体部分)，以美国专利第5198423号中构建的含有人FN三个关键结构域的质粒pCH102为模板，扩增人FN的细胞结合域、肝磷脂域和CS-I区域的基因序列。所得两段基因序列分别以ICAM和FN命名。第一步PCR :按照常规PCR方法分别扩增两段目的基因，100 U I PCR反应体系，各组分如表I所示表I
模板质粒IuL
PCR 缓冲液(10 X )IOy L
dNTP (2. 5mmol/y L)8y L
MgCl2 (25mmol/uL)8 u L
权利要求
1.一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前用含有有效量的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶的步骤，和在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体的步骤；其中所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-I功能结构域和人纤连蛋白功能结构域融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-I功能结构域包含人细胞间粘附分子-I胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-I结构域，所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。
2.根据权利要求I所述的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，在所述包被液中所述融合蛋白浓度为10-15ii g/ml，所述人CD3单克隆抗体的浓度为4-7 ii g/ml，在所述细胞培养液中所述人⑶3单克隆抗体的浓度为50-100ng/ml。
3.根据权利要求I所述的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白中人细胞间粘附分子-I功能结构域与人纤连蛋白功能结构域是通过柔性肽连接。
4.根据权利要求3所述的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述柔性肽氨基酸序列为SEQ ID NO: I。
5.根据权利要求3所述的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的DNA序列为SEQ ID NO: 2。
6.根据权利要求3所述的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建所述融合蛋白中人细胞间粘附分子-I功能结构域的引物为正向引物Pl :5’ -CATCATCATCATCATCATATGCAGACATCTGTGTCCCC-3’ (SEQ ID NO:3)，反向引物 P2 :5’ -AGAACCACCACCACCGCTACCGCCACCGCCGTAGGGGGCCGAGGTGITCT-3’ (SEQID NO:4); 构建所述融合蛋白中人纤连蛋白功能结构域的引物为正向引物 P3 :5’ -GGCGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGTGGITCTCCCACTGACCTGCGAITCAC-3’ (SEQID NO:5), 反向引物 P4 :5’ -AGACTGCAGGTCGACAAGCTITTATGTGGAAGGAACATCCAAGAT-3’ (SEQ IDNO:6)。
7.根据权利要求I所述的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白是在大肠杆菌中表达。
8.根据权利要求7所述的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白的表达载体为pColdll，并在15-20°C诱导表达。
全文摘要
一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括在人CIK细胞的前体细胞培养前用含有有效量的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶的步骤，和在所述人CIK细胞的诱导及培养全过程中在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体的步骤；其中所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-1功能结构域和人纤连蛋白功能结构域融合蛋白，所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。本发明的制备方法显著增加了外周血单个核细胞体外扩增效率及CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例，增强了CIK细胞的杀瘤活性，从而提高了细胞免疫治疗的效果。
文档编号C12N5/0786GK102732481SQ201210194280
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者李志惠 申请人:李志惠, 郑意端