专利名称：一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法
技术领域：
一种分析白酒发酵体系中群落结构的方法，本发明涉及使用现代分子生物学技术一聚合酶链式反应-变形梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)克服传统微生物分离方法的缺陷，定性并半定量分析中国白酒群体微生物的发酵体系中群体的结构组成及其动态演变规律，属于微生物生态技术领域。
背景技术：
中国白酒生产是一个开放的固态发酵过程，可以说白酒的生产实际上包含了一个庞大的微生物区系的复杂代谢过程，受环境的影响较大。随着环境条件的改变，微生物区系也会发生改变，并对白酒的风味口感产生影响。大曲和酒醅是白酒生产中重要的微生物载体，其中是主要的细菌。卞應分Bacillus属的菌种都能合成淀粉酶、蛋白酶,且对白酒生产中的不利环境条件具有较高的抵抗力，自始至终存在于白酒酿造过程中。因此，Bacillus是白酒发酵体系中重要的产酶菌和生香细菌，Bacillus群体的结构成为中国白酒研究的热点。目前国内学者主要通过筛选、培养方法来分离、分析白酒发酵体系中的Bacillus。从白酒发酵体系中分离得到的BaciIlus主要有枯草芽孢杆菌iBaciIus sub ti7i5·)、环状芽抱杆菌iBaciIlus circulans )、巨大芽抱杆菌iBaciIlus maga teri )、腊状芽抱杆菌iBaciIlus cereus)、地衣芽抱杆菌QBaciIlus Iicheniformis)和解淀粉芽抱杆菌QBaci Ilus amyloli quefaci ens )等。有研究学者发现在酱香型白酒发酵过程中，某些
B.Iicheniformis是产生酱香风味的重要功能微生物,还发现某些是酱香型高温大曲中生成酸性蛋白酶的主要菌种。而汉在大曲细菌中数量较多，是形成酒体芳香类物质的重要菌源。白酒酿造体系中形成了特殊结构和特殊功能的群体。但传统的微生物研究方法具有较大的局限性，存在操作繁琐，菌落形态、生化特性相像导致难以准确鉴定，结果准确性及可靠性差，易遗漏某些培养条件苛刻的菌种等缺点。近年来，系统生物学提出了一个观点，即复杂体系中群体微生物的组成及比例都会影响体系的功能。由于分离培养方法会改变原始菌群的构成，无法分析微生物之间以及微生物与环境之间的相互关系，所以不适于白酒酿造过程的实时监测。分子生态学方法在白酒的研究中开始得到应用。DGGE技术是由Fisher和Lerman在1979年率先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术，其基本原理是由于双链DNA在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同长度的DNA片段能够被区分开来(迁移行为决定于其分子大小和电荷)，但同样长度的DNA片段因在胶中迁移行为一样而无法区分开来。因此在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度，不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下解链，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最后停滞在其相应的变性剂梯度位置，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。DGGE由于能有效分析复杂体系中微生物群落结构组成，而越来越受到重视。如今，由于DGGE具有能检测到难以培养或不能培养的微生物、检测速度快、重现性强、结果准确可靠、方便易操作等优点，被广泛应用于多个微生态系统领域的研究中，包括土壤、海洋湖泊、人体和动物肠道、发酵食品等等，是研究复杂体系中微生物群落结构组成以及菌群多样性动态变化分析主要的分子生物学方法之一。由于PCR扩增的偏好性，用细菌16S rDNA V3区的通用引物分析白酒大曲和酒醅，往往会低估的多样性。为针对研究的群体结构，用选择16S rDNA V9区基因作为DGGE的靶基因。为降低PCR扩增的偏好性、提高扩增的特异性，采用巢式PCR获得特异性片段。巢式PCR基本原理是利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，第一对引物(外引物)用以产生扩增产物。第二对引物称为巢式引物，它们结合在第一次PCR产物的内部，使第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。由于巢式PCR有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性， 因而巢式PCR特异性强、准确度高、可靠性闻。应用巢式PCR-DGGE分析中国白酒发酵体系中的菌群多样性具有明显的优势，其操作简便、检测速度快、重复性好、结果准确可靠，直接鉴定到种水平，而且能检测到难以培养或不能培养的运用此方法半定量分析白酒实际发酵体系中Bacillus的群落结构组成及其比例，对准确把握白酒发酵过程中种属以及动态演变规律，深入了解白酒生产过程中与特殊风味物质、重要酶类物质相关的关键微生物的变化规律与产品质量及成分组成之间的相关关系，指导生产工艺的改进具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明旨在针对现有的传统微生物分离方法的缺陷，公开一种运用巢式PCR结合变性梯度凝胶电泳的方法来半定量分析白酒发酵体系中的结构组成及其比例。本发明采用的技术，具有快速、简便、准确度高、特异性强的优点。为确定白酒发酵体系中Bacillus群落结构组成以及白酒发酵过程中菌群动态演变规律提供了快速检测方法，结合实验室培养条件下单菌种的特性分析，可判断其在白酒酿造过程中的功能以及贡献程度，所以为白酒中功能微生物的研究提供了参考依据。本发明的技术方案利用珠磨法提取大曲或酒醅样品基因组，巢式PCR两轮扩增Bacillus特异性DNA片段，DGGE电泳分离不同种属的对应的DNA片段，切胶回收优势微生物对应的条带，再次PCR扩增及连接T载体和阳性克隆的挑选，DGGE电泳重新比对后，进行测序鉴定切胶条带对应的微生物信息，最后利用quantity one软件将DGGE图谱条带亮度进行数字化处理，计算出某种沒电总、饱Bacillus菌群中所占有的比例。用变性梯度凝胶电泳定性并半定量分析白酒发酵体系中群落结构的方法，包括以下步骤
(a)选择实验的大曲或酒醅样品，对样品进行预处理，并用珠磨法提取样品中微生物的总基因组DNA ；
ih、麵BaciIIus的16S rRNA V9区基因作为DGGE的靶基因设计两对引物，并在第二轮PCR的正向引物的5’端加上GC发夹结构；
巢式PCR所用的第一轮专一性引物为 pl-F :5，-CGATGCGTAGCCGACCTGAG-3，，pl-R :5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ；
第二現钦对Bacillus 16S rDNA V9区的引物为 p2-F :5，-ATGGCTGTCGTCAGCT-3，，
p2-R:5’ -CGCCCGCCGC GCGGCGGGCG GGGCGGGGGC ACGGGCGGTG TGTAC-3’ ；
(c)以步骤(a)中的基因组为模板进行PCR扩增；
(d)将PCR产物在最适条件下进行DGGE电泳分析；
Ce)染色后与已知的Maker比对，确定具有相同电泳迁移率的DNA条带相应的种属，将未知的优势条带切胶回收；
(f )回收的DNA条带重新PCR扩增、连接T载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布于加有一定浓度Amp的LB平板，挑选阳性克隆子；
(g)对阳性克隆子的菌落PCR产物，再次进行DGGE比对、验证；
(h)将与回收DNA条带具有相同电泳迁移率的PCR产物进行测序，测序结果在GenBank数据库中blast比对分析；
(i)采用quantityone软件将DGGE图谱条带亮度进行数字化处理,即将每条条带的亮度转化为峰面积，将所有条带的峰面积加和代表菌群总数，某种相应的DNA条带的峰面积在所有条带峰面积之中所占比重,即为这种在总的菌群中所占的比例。步骤(a)中的样品可为任意香型、地区采集的中国白酒大曲或酒醅样品，样品多点取样、混合后进行预处理。步骤(d)中电泳仪器为Dcode基因突变检测系统，电泳条件为电压100V，60°C下电泳200min，变性梯度为33%_43%。步骤(e)中染色方法为使用SYBR green染色三次,每次15min ;未知条带切胶回收的方法为优势条带切割后置于灭过菌的I. 5mL离心管中，加入适量灭菌超纯水清洗，然后加入60μ 灭菌超纯水并于4°C冰箱静置过夜。步骤(f)中PCR扩增采用的引物与步骤(b)中的引物相同。步骤(g)中菌落PCR的引物与与步骤(b)中的引物相同，并且是将阳性克隆子菌落PCR产物与步骤(c)中的样品PCR产物进行重新DGGE电泳比对。本发明的有益效果本发明可广泛应用于白酒酿造过程，包括制曲、堆积或发酵过程中菌群变化规律，及比较不同工艺(香型)或产地的白酒大曲或酒醅中Bacillus群落结构组成的差异，为功能的分离提供参考依据。
图 I 为实施例 I 中汉 amyloli quefaci ens > B. oleronius^B. firmus 和汉 cereus 电泳成像结果。
图2为实施例I中汉subtilis'B. Ii cheni formi s取B. magaterium电泳成像结果。
图3为实施例2白酒酒醅电泳成像结果。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合实例进一步阐明本发明的内容。实施例I
洛BaciIIus oleronius (CICIMB1592)、Β· amyloliquefaciens (CICC20164)、Β· firmus (CICIMB1543)、B. cereus (CICIMB1809)、B. subtil is (CICIMB1585)、B. Iicheniformis(CICIMB1540)热B. imgaterium (CICIMB1691)接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，于37°C200转/min振荡培养过夜。将菌体培养液离心收集菌体，用无菌水重悬菌体后，珠磨仪破碎微生物细胞(以最大速度击打4min)，12，OOOXg离心IOmin收集上清；加入与上清液等体积的酚和氯仿有机试剂(等体积)混匀，12，OOOXg离心IOmin收集上清；加入2倍体积冰乙醇于_20°C沉淀2h以上，12，000 X g离心IOmin弃上清；用70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥，最后用30μ 超纯水(电阻率18. 2ΜΩ )溶解沉淀。提取得到的样品中微生物总基因组DNA作为模板，用巢式PCR方法扩增特异性片段。巢式PCR第一轮PCR所用的引物为pl-F :5’ -CGATGCGTA GCCGACCTGAG-3’，pl-R :5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。第一轮PCR反应体系为25μ ，包括12·5μ 2XTaq PCR MasterMix酶，每种引物O. 5PL(25pmol)，10. 5μ 的灭菌超纯水，DNA模板用量约为10ng。第一轮PCR反应程序 为95°C预变性5min后进入25个循环，95°C lmin ；68°C 90s ；72°C 2min，最后72°C延伸IOmin0 PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将第一轮PCR产物稀释100倍，取WL为第二轮PCR的模板。第二轮PCR所用的引物为 p2-F :5，-ATGGC TGTCGTCAGCT-3，，
p2-R:5’ -CGCCCGCCGC GCGGCGGGCG GGGCGGGGGC ACGGGCGGTG TGTAC-3’。第二轮PCR反应体系与第一轮相同。第二轮PCR反应条件为94°C预变性4min后进入 25 个循环，94°C lmin ；65°C lmin ；72°C lmin，最后 72°C延伸 lOmin。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。DGGE条件为丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性范围为33%_43%( 100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)，DGGE电压为100V，电泳温度为60°C，电泳时间为200min。PCR上样量约为200ng。电泳结束后用SYBR green (30mLTAE缓冲液中加入3μ SYBR green)染色3次，每次15min。通过凝胶成像系统来观察实验结果。实验结果见附图
I和附图2，其中附图 I 中泳道 1_4 分别为汉 amyloli quefaci ens > B. oleronius ^B. firmus 和汉 cereus,附图 2 中泳道 1-3 分别为汉 subtilis、B. Ii cheni formi s 热 B. magaterium。在 DGGE 图谱中Bacillus菌种各自形成了特异性的DNA条带，并获得了很好的分离效果。以其作为标准菌株，与大曲或酒醅样品同时进行电泳分析，可快速鉴定出与标准菌株具有相同电泳迁移率的DNA条带的微生物种属信息。实施例2
采集山西某清香型白酒厂的白酒酒醅，取发酵0d、15d以及30d的酒醅样品。样品预处理时，加入 30mL PBS 缓冲液(57. 7mmol/L Na2HPO4,42. 3mmol/L NaH2PO4),涡旋振荡 5min,200g离心5min弃去沉淀，再9000g离心5min收集菌体。用PBS缓冲液重悬菌体后，珠磨仪破碎微生物细胞(以最大速度击打4min)，12，000 Xg离心IOmin收集上清；加入与上清液等体积的酚和氯仿(等体积)有机试剂混匀，12，OOOXg离心IOmin收集上清；加入2倍体积冰乙醇于-20°C沉淀2h以上，12，000 Xg离心IOmin弃上清；用70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥，最后用30μ 超纯水(电阻率18. 2ΜΩ )溶解沉淀。提取得到的样品中微生物总基因组DNA作为模板，用巢式PCR方法扩增特异性片段。巢式PCR第一轮PCR所用的引物pl-F :5，-CGATGCGTAGCCGACCTGAG-3，，pl-R :5’ -AAGG AGGTGATCCAGCCGCA-3’。第一轮PCR反应体系为25μ ，包括12·5μ 2XTaq PCR MasterMix酶，每种引物O. 5PL(25pmol)，10. 5μ 的灭菌超纯水，DNA模板用量约为10ng。第一轮PCR反应程序为95°C预变性5min后进入25个循环，95°C lmin ；68°C 90s ；72°C 2min，最后72°C延伸IOmin0 PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将第一轮PCR产物稀释100倍，取WL为第二轮PCR的模板。第二轮PCR所用的引物为 p2-F:5， -ATGGCTGTCGTCAGCT-3，，
p2-R:5’ -CGCCCGC CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGC GGTGTGTAC-3’。第二轮PCR反应体系与第一轮相同。第二轮PCR反应条件为94°C预变性4min后进入25个循环，94°C lmin ；65°Clmin ；72°C lmin，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。DGGE条件为丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性范围为33%_43%( 100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)，DGGE电压为100V，电泳温度为60°C，电泳时间为200min。PCR上样量约为200ng。电泳结束后用SYBR green (30mLTAE缓冲液中加入3μ SYBR green)染色3次，每次15min。通过凝胶成像系统来观察实验结果。实验结果见附图3。泳道I为发酵Od样品，泳道2为发酵15d样品，泳道3为发酵30d样品。将染色后的凝胶，置于紫外灯下，将未知条带切割后置于灭过菌的I. 5mL离心管中，编号，加入适量灭菌超纯水清洗后加入60 μ L的灭菌超纯水并于4°C冰箱静置过夜。取适量储存样品液作为模板用p2-F/p2-R进行PCR扩增，将PCR产物用试剂盒切胶回收。根据切胶回收的DNA片段琼脂糖凝胶电泳条带的亮度，在离心管中加入适量比例的回收的DNA与T载体，再加入5 μ L solution I，最后加灭菌超纯水补充成10 μ L的反应混合液，稍微震荡混匀。放置于金属浴中，16°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于加有一定浓度的Amp LB平板，进行蓝白斑筛选，37°C培养过夜，挑取白色的阳性克隆子进行菌落PCR0将菌落PCR产物进行DGGE分析，同时根据切胶的对应条带选取样品作为参照比对阳性克隆子PCR产物的相对位置，淘汰假阳性克隆子。将阳性克隆子送往上海生工测序，测序结果在GenBank数据库中进行blast比对分析。比对结果如表I所示。表I阳性克隆子的比对结果
序号鉴定结果登陆号—
1B, cimiiiamJN644554.1
2BJirmusHQ903397.1
3B, amyhliqiiefac isnsGU339230.1
4B. Iichsnifoi^nisFK397495J
采用quantity one软件将DGGE图谱条带亮度进行数字化处理,具体步骤如下a)在DGGE图谱上，除去泳道背景，确认并标记各个DNA条带；b)将标记好的所有条带分类，即把在DGGE图谱中泳动速率一致的条带归为一类，并手工调整、比对条带；c)将各个条带的亮度(光密度值)转化为峰面积，将峰面积数据输出；d)将所有条带的峰面积加和代表Bacillus菌群总数,用代表某种的条带峰面积比上所有条带的峰面积和，即可计算出这种feci77心在JMh Bacillus菌群中所占的比例。以附图2中的泳道2—发酵15d的样品为例，分析发酵酒醅样品中某种Bacillus在总Bacillus菌群中所占比例。表2 DGGE图谱中发酵15d样品中主要DNA条带信息 _
权利要求
1.用变性梯度凝胶电泳定性并半定量分析白酒发酵体系中群落结构的方法，其特征在于包括以下步骤 (a)选择实验的大曲或酒醅样品，对样品进行预处理，并用珠磨法提取样品中微生物的总基因组DNA ； ih、麵BaciIIus的16S rRNA V9区基因作为DGGE的靶基因设计两对引物，并在第二轮PCR的正向引物的5’端加上GC发夹结构； 巢式PCR所用的第一轮专一性引物为 pl-F :5，-CGATGCGTAGCCGACCTGAG-3，， pl-R :5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ； 第二現钦对Bacillus 16S rDNA V9区的引物为 p2-F :5，-ATGGCTGTCGTCAGCT-3，，p2-R:5’ -CGCCCGCCGC GCGGCGGGCG GGGCGGGGGC ACGGGCGGTG TGTAC-3’ ； (c)以步骤(a)中的基因组为模板进行PCR扩增； Cd)将PCR产物在最适条件下进行DGGE电泳分析； Ce)染色后与已知的Maker比对，确定具有相同电泳迁移率的DNA条带相应的种属，将未知的优势条带切胶回收； (f )回收的DNA条带重新PCR扩增、连接T载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布于加有一定浓度Amp的LB平板，挑选阳性克隆子； (g)对阳性克隆子的菌落PCR产物，再次进行DGGE比对、验证； (h)将与回收DNA条带具有相同电泳迁移率的PCR产物进行测序，测序结果在GenBank数据库中blast比对分析； (i)采用quantityone软件将DGGE图谱条带亮度进行数字化处理,即将每条条带的亮度转化为峰面积，将所有条带的峰面积加和代表菌群总数，某种相应的DNA条带的峰面积在所有条带峰面积之中所占比重,即为这种在总的菌群中所占的比例。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于其中步骤(a)中的样品可为任意香型、地区采集的中国白酒大曲或酒醅样品，样品多点取样、混合后进行预处理。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于其中步骤(d)中电泳仪器为Dcode基因突变检测系统，电泳条件为电压100V，60°C下电泳200min，变性梯度为33%_43%。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于其中步骤(e)中染色方法为使用SYBRgreen染色三次,每次15min ;未知条带切胶回收的方法为优势条带切割后置于灭过菌的I. 5mL离心管中，加入适量灭菌超纯水清洗，然后加入60μ 灭菌超纯水并于4°C冰箱静置过夜。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于其中步骤(f)中PCR扩增采用的引物与步骤(b)中的引物相同。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于其中步骤(g)中菌落PCR的引物与与步骤(b)中的引物相同，并且是将阳性克隆子菌落PCR产物与步骤(c)中的样品PCR产物进行重新DGGE电泳比对。
全文摘要
一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法，属于微生物生态技术领域。本发明用巢式聚合酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)的方法半定量分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的多样性。采用珠磨法提取大曲或酒醅样品中总基因组DNA，巢式PCR两步扩增Bacillus特异性片段，DGGE电泳分析，利用标准菌株确定DNA条带相应的微生物种属，未知条带切胶回收后重新PCR、连接T载体并克隆、再次DGGE电泳，阳性克隆测序并在GenBank数据库中blast比对获取微生物信息，最后利用quantityone软件数字化处理DGGE图谱，根据条带亮度计算出不同Bacillus菌种在总Bacillus菌群中的比例。本发明具有简便、特异性强、重复性好的优点，为进一步探究Bacillus在白酒生产中的重要作用奠定了基础。
文档编号C12Q1/68GK102719541SQ20121019363
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者吴莉莉, 徐岩, 王海燕 申请人:江南大学