专利名称：一种生物反应器大规模培养的方法
技术领域：
本发明属于兽医生物技术领域，更具体涉及ー种重组H5N1禽流感病毒5代以内快速适应MDCK细胞培养的方法，适应病毒株在生物反应器大規模培养。
背景技术：
H5N1 高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HP-AIV)在世界范围内广泛存在，不仅可以感染禽类，而且可以跨越种间屏障感染多种哺乳动物，尤其是可以直接感染人，并导致死亡，严重的危害了养禽业和人类的健康，因此禽流感的防制是非常重要的。全群扑杀和生物安全防护是及时扑灭和控制高致病性禽流感(HPAI)的主要措施，而疫苗接种是防控禽流感最有效和最经济的方法。过去50年来，一直通过鸡胚培养生产流感疫苗。由于流感疫苗的生产需要使用大量鸡胚，且生产周期长，易污染，不易于控制，生产效率较低。自从1996年以来，哺乳动物细胞已经发展到能够自由扩大培养并且用于エ业化生产，而禽流感疫苗也可以通过动物细胞大規模培养制备。生物反应器能够有效地增加单位体积细胞培养的密度，从而为病毒性疫苗大規模生产奠定坚实的基础。目前我国禽流感H5N1商品疫苗主要是通过流感病毒反向遗传学操作技术构建的重组疫苗株。但是以MDCK细胞增殖重组H5N1禽流感疫苗株存在很多困难1、病毒从鸡胚到细胞两种不同的培养基质转换需要适应过程；2、因转瓶培养细胞量的限制，H5N1禽流感病毒HA效价不会高于29，不能满足疫苗制备的要求；3、重组H5N1禽流感病毒HA自切割位点一般被去除，在病毒的吸附过程中必须更换添加TPCK-胰酶的无血清培养基，其エ艺复杂。因此，研发新的生产エ艺，使H5亚型禽流感病毒快速在MDCK细胞上适应，从方瓶、转瓶快速放大到操作简单的固定床篮式搅拌系统生物反应器，大規模生产重组H5亚型禽流感病毒是非常必要的。中国专利号02112013. 7的发明专利说明书公开了ー种利用Fibra-CeTMDisks为载体大规模连续生产病毒疫苗的方法，虽然该エ艺适合于狂犬疫苗、出血热、こ脑、小儿脊髓灰质炎病毒，但是却不适合需要传代适应的流感病毒。中国专利号201010596058. 9的发明专利说明书公开了利用Cytodexl为载体在生物反应器培养MDCK细胞增殖H9N2型禽流感病毒。中国专利号201010159741.6的发明专利说明书公开了生物反应器培养MDCK细胞全悬浮培养エ艺，以及增殖H9N2病毒制备疫苗的エ艺。中国专利号201010282155. O的发明专利说明书公开了利用Cytodexl为载体在生物反应器培养MDCK或者细胞增殖エ业化生产动物流感病毒。以上文献资料都有不同程度的涉及禽流感病毒的生产エ艺方法。但是，对重组H5N1禽流病毒在MDCK细胞的快速适应以及利用聚酯片为载体在固定床篮式搅拌系统反应器的生产エ艺并未涉及
发明内容
本发明目的是在于提供了ー种生物反应器大規模培养的方法，方法易行，操作简便，适应后病毒HA效价>27;该病毒从方瓶、转瓶培养エ艺快速转换到操作简单的固定床篮式搅拌系统反应器的大規模培养，其HA效价可以达到211，解决了目前重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞上培养病毒滴度不能满足疫苗生产的难题。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案ー种生物反应器大規模培养的方法(一种重组H5N1型禽流感病毒在MDCK细胞上的快速适应方法和该适应病毒的生物反应器大規模培养エ艺)，其步骤是(I)重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞(见遗传资源表)上的快速适应，所述的步骤(I)病毒36. 5-37. 5°C吸附I 一 2小时，去除病毒液，病毒稀释液清洗MDCK细胞2 — 4次后更换细胞维持液，取血凝效价>24且病毒稀释倍数最高的病毒液或者致细胞最晚产生病变的最高稀释倍数病毒作为种子病毒继续适应；病毒在5代以内适应MDCK细胞，且病毒血凝效价>27。
(2)经过步骤(I)适应MDCK细胞内増殖的重组H5亚型禽流感病毒作为反应器大规模培养的种子病毒，所述的步骤(2)种子病毒代次> F6 ;血凝效价> 28 ；EID50 ^ 107 5。所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液为含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml 高糖 DMEM。(3)以聚酯片为载体培养MDCK细胞，所述的步骤(3)以聚酯片为载体，反应器为篮式固定床，30-50g/L载体投放量，每克载体投放O. 5-4. 5*107个细胞；完全培养基为含8-10% (体积比)新生牛血清DMEM ;细胞20分钟内贴壁，此阶段搅拌转速45r/min，DO为60%,温度为36 — 38°C，pH为7. 0-7. 3，通气量为O. ISLPM ;细胞培养阶段依据细胞耗氧，搅拌转速控制50-120r/ml，通气量O. 1-0. 5SLPM，pH7. 2，反应器中糖浓度I. 8-2. 2g/L，调整灌流速度为5-40ml/min;细胞培养50-70小时生长至平台期，此时平均每200g载体上的细胞糖耗为I. 7-2. 5g/h (具体见附图I)。(4)上述步骤(3)培养的MDCK细胞接种病毒，所述的步骤(4)反应器培养MDCK细胞接种病毒吋，PBS清洗细胞2 — 4次，病毒稀释液清洗细胞I 一 2次，病毒接种MOI为O. 01-0. 00001 ;病毒吸附过程中TPCK-胰酶浓度I. 0-1. 5ug/ml，温度36. 5-37. 5°C，搅拌转速40-60r/min，D0为60%，pH为7. 6，病毒吸附2小时；病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33-35°C，搅拌转速60-120r/min，通气量为O. 2-0. 6SLPM, 4-6小时后更换细胞维持液。(5) MDCK细胞维持和病毒増殖，所述的步骤(5)病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33-35 °C，搅拌转速60-120r/min，通气量为O. 2-0. 6SLPM, 4-6小时后更换细胞维持液；灌流培养速度为10-50ml/min，糖浓度保持2. 0-2. 8g/L。所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液为含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM。(6)监测血凝效价收获病毒，所述的步骤(6)病毒血凝效价最高为211，可以收获7. 5-9个反应器培养体积病毒液,其中4. 5-5个反应器培养体积病毒液血凝效价大于29 ;另外3-4个反应器培养体积病毒液血凝效价27Λ本发明提供最系统的重组Η5Ν1禽流感病毒的生物反应器大規模培养，该方法从重组Η5Ν1禽流感病毒在细胞适应到反应器规模培养具有以下优点和效果①与传统的Η5Ν1流感病毒在MDCK细胞上方法相比较，本发明提供以六孔板梯度适应方法操作简单，工作量小；病毒在5代以内能够适应MDCK细胞并且稳定的増殖，其HA效价大于27 ;该方法易于标准化，适用于所有的H5亚型流感病毒。②本发明提供的聚酯片为载体，运用固定床生物反应器大規模培养MDCK细胞，增殖H5亚型流感病毒，只需要每克载体投放O. 5-4. 5*107个细胞，细胞增殖增殖快速，接毒エ艺简单，易于エ业化大規模 操作。③本发明提供的方法病毒效价高、产量大，可以提供4. 5-5个反应器培养体积的病毒液，其血凝效价大于29 ;该病毒免疫原性好，抗体水平維持时间长，在该病毒液制备疫苗免疫SPF鸡后14天HI效价即可达到25 5，28天可以达到28 5。第11周时抗体仍在27以上。
图I为ー种反应器中MDCK细胞耗糖曲线示意图。为200克片状载体投放时，MDCK细胞每小时的糖耗曲线表。24_32小时，MDCK细胞糖耗低，并且增长缓慢，表明此阶段为细胞生长的延迟期；35 — 58细胞糖耗值剧增，代表细胞进入指数增长期，60-70小时细胞糖耗进入相对稳定，表明细胞生长进入平台期。图2为ー种反应器生产重组流感病毒液HA效价变化曲线示意图。200克片状载体投放，细胞进入平台期以O. 001-0. 0001接种重组H5亚型禽流感病毒后，以I %鸡红细胞检测病毒HA血凝效价变化表明病毒在28小时检测到HA效价，48小时效价达到最闻211。
具体实施例方式实施例I :重组H5N1禽流感病毒毒株rC4/Wl株快速适应MDCK细胞rC4/Wl株(见遗传资源表)该病毒是全禽源性H5亚型禽流感病毒，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为=CCTCC NO :V201029，其快速适应MDCK细胞步骤如下I)取I个MDCK细胞长成致密单层的T75细胞瓶，细胞消化后平均铺入3个6孔细胞培养板。2)将鸡胚尿囊液毒液以10倍倍比稀释至10_6。3)取10-3、10-4、10-5、10-6各稀释度毒液200111，并用细胞维持液补充至31111，分别加入长满MDCK细胞单层的6孔板中，每个稀释浓度做ー个重复，取200ul稀释液用细胞维持液补充至3ml，加入长满MDCK细胞单层的作为阴性对照。4)在37°C条件下，病毒吸附I. 5小时后去除病毒液，以病毒稀释液清洗MDCK细胞3次后，每孔加入细胞维持液3ml，24小时后每6个小时观测细胞病变，测HA效价，48小时后每3个小时观测细胞病变，测HA效价，接毒84小时后6孔板于一 80°C冻融一次，均未检测到HA效价，但是10_3、10_4分别在36-48小时和55 — 65小时出现了典型流感病毒导致脱落型的细胞病变。5)以65小时收获的Kr4稀释度病毒为H)代继续在MDCK细胞上适应培养。6)取FO代病毒重复步骤1、2，取10'10'10'10'按照步骤3、4操作，在48小时10_2接种孔MDCK细胞出现病变，在60小时10_3、10_4稀释度接种孔出现明显的病变，测HA效价发现10_3稀释度效价最高可以达到27_8，其他的稀释度液均达到26左右(见表I )，以60小时收获的10_4病毒为Fl代病毒，按照步骤3、4操作继续在MDCK细胞上适应培养。7)按照上述方法连续传至F4代，接种10_4、10_5稀释度病毒的MDCK细胞在36 —52小时出现典型病变，HA效价>27。表I :rC4/Wl株R)_F4代在MDCK细胞适应增殖表
权利要求
1.ー种生物反应器大規模培养的方法，其步骤是 (1)重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞上适应，所述的病毒36.5-37. 5°C吸附I 一 2小吋，去除病毒液，病毒稀释液清洗MDCK细胞2 — 4次后更换细胞维持液，取血凝效价>24病毒稀释倍数的病毒液或者致细胞产生病变的稀释倍数病毒作为种子病毒继续适应；病毒在5代以内适应MDCK细胞，病毒血凝效价>27 ； (2)步骤I适应病毒株作为反应器大規模培养病毒种子批制备，所述的种子批病毒代次≥F6 ;血凝效价≥28 ；EID50≥107 5，所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶L 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液为含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM ； (3)以聚酯片为载体培养MDCK细胞，所述的以聚酯片为载体，反应器为篮式固定床，30-50g /L载体投放量，每克载体投放O. 5-4. 5*107个细胞；培养基为含8-10%新生牛血清DMEM ;细胞20分钟内贴壁，阶段搅拌转速45r/min，DO为60%，温度为36 — 38°C，Ph为.7. 0-7. 3，通气量为O. ISLPM ;细胞培养阶段依据细胞耗氧，搅拌转速控制50_120r/ml，通气量O. 1-0. 5 SLPM，Ph7. 2，反应器中糖浓度I. 8-2. 2g/L，调整灌流速度为5_40ml/min ;细胞培养50-70小时生长至平台期，平均每200g载体上的细胞糖耗为I. 7-2. 5g/h ； (4)步骤3培养的MDCK细胞接种病毒，所述的反应器培养MDCK细胞接种病毒吋，PBS清洗细胞2 — 4次，病毒稀释液清洗细胞I 一 2次，病毒接种MOI为O. 01-0. 00001 ;病毒吸附过程中TPCK-胰酶浓度I. 0-1. 5ug/ml，温度36. 5-37. 5°C，搅拌转速40_60r/min，DO为60%，Ph为7. 6，病毒吸附2小时；病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33-35°C，搅拌转速60-120r/min，通气量为O. 2-0. 6SLPM, 4-6小时后更换细胞维持液； (5)MDCK细胞维持和病毒増殖，所述的步骤5病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33-35°C，搅拌转速60-120r/min，通气量为O. 2-0. 6SLPM, 4-6小时后更换细胞维持液；灌流培养速度为10-50ml/min，糖浓度保持2. 0-2. 8g/L，所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液为含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM ； (6)监测血凝效价收获病毒，所述的病毒血凝效价最高为211，收获7.5-9个反应器培养体积病毒液，其中4. 5-5个反应器培养体积病毒液血凝效价大于29 ;另外3-4个反应器培养体积病毒液血凝效价27_8。
全文摘要
本发明一种生物反应器大规模培养的方法,其步骤:(1)重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞上适应；(2)病毒株作为反应器大规模培养病毒种子批制备，种子批病毒代次≥F6；血凝效价≥28；EID50≥107.5；(3)以聚酯片为载体培养MDCK细胞，以聚酯片为载体，反应器为篮式固定床，每克载体投放细胞；培养基为新生牛血清DMEM；(4)培养的MDCK细胞接种病毒，病毒稀释液清洗细胞，病毒接种；吸附后更换细胞维持液；(5)MDCK细胞维持和病毒增殖，搅拌，更换细胞维持液；(6)监测血凝效价收获病毒，收获反应器培养体积病毒液。方法易行，操作简便，适应后病毒HA效价>27，解决了目前重组H5亚型禽流感病毒在MDCK细胞上培养病毒滴度不能满足疫苗生产的难题。
文档编号C12R1/93GK102732487SQ20121019336
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者周明光, 左静, 徐玲莉, 徐高原, 李俊平, 李国红, 洪灯, 涂加刚, 蒋桃珍, 邸海波, 金梅林, 陈焕春, 韦大坤 申请人:中国兽医药品监察所, 华中农业大学, 武汉科前动物生物制品有限责任公司