专利名称：一种检测组氨酸标签重组蛋白的核酸适配体分子信标探针及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测组氨酸标签重组蛋白的核酸适配体分子信标探针及利用该探针进行组氨酸标签重组蛋白检测的方法。
背景技术：
蛋白表达系统及其重组蛋白已被广泛应用于生命科学的各个学科研究，已经成为生物学有力的研究手段和工具。然而，从原生生物资源中分离和纯化重组蛋白的过程是非常复杂和耗时。为了简化这一过程，多种蛋白质亲和标签，如几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶和多聚组氨酸标签，被广泛用于重组蛋白分离和纯化。其中最常用的是在重组蛋白的N-或C-末端添加六个组氨酸残基的组氨酸标签。·与其它蛋白标签方法相比，组氨酸标签具有以下优点1.分子量小，对目标蛋白功能、结构及活性的干扰作用较小，在后续应用中通常不需移除；2.表达方便，商品化含组氨酸标签的载体可在大肠杆菌、酵母、哺乳动物、昆虫和植物等不同表达系统中表达且纯化条件温和；3.无免疫原性，重组蛋白可以直接用来注射动物制备抗体，不影响免疫学分析；
4.在高浓度尿素或胍等变性条件下，组氨酸标签仍保持结合能力。因此，目前组氨酸标签被广泛用于蛋白表达系统和蛋白质分析。准确定量组氨酸标签重组蛋白将有助于表达载体和表达系统的评估及重组蛋白的应用。目前，检测组氨酸标签蛋白的探针主要有两类抗组氨酸标签抗体和金属离子探针。但是这两类探针在应用上却受到了一定限制。组氨酸标签抗体抗体制备昂贵，检测时需要较长时间且缺乏准确定量能力。与抗体检测探针相比，金属离子探针价格低廉，但同样耗时和缺少准确定量能力。最重要的是，这两种方法都不能直接对细胞裂解物中组氨酸标签蛋白进行检测和定量分析。核酸适配体是一种通过SELEX技术筛选获得的单链核酸。通过折叠成特定的空间三维结构，核酸适配体能高亲和性和高特异性的结合多种目标物，例如金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质和细胞。另外，核酸适配体还具有制备简单、容易修饰和保存时间长等优点。因此核酸适配体被广泛应用于分析化学和生命科学等领域，如抗组氨酸标签核酸适配体 6H5 (5J-GGCTTCAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGT GTACG-3’)被作为一种亲和探针检测与纯化组氨酸标记蛋白。
发明内容
本发明旨在克服现有技术中的不足，提供一种检测组氨酸标签重组蛋白的核酸适配体分子信标探针及利用该探针检测细胞裂解物中含组氨酸标签重组蛋白的直接通用方法。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
所述检测组氨酸标签的核酸适配体分子信标探针包含SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的序列；SEQ ID NO. I所示序列的3’端与SEQ ID NO. 2所示序列的5’端通过PEG36桥联；SEQ ID NO. I所示序列5’端修饰有荧光素FAM ；SEQ ID NO. 2所示序列3’端修饰有淬灭基团Dabcyl。当所述探针未与组氨酸标记蛋白结合时,整个探针为莖环结构。在这结构中，探针中FAM基团的荧光信号被Dabcyl基团猝灭。当所述核酸适配体分子信标探针与含组氨酸标签重组蛋白结合时，探针的茎环结构改变，荧光基团FAM远离猝灭基团Dabcyl，使得FAM基团的荧光信号可以被检测到。基于上述核酸适配体分子信标探针检测细胞裂解物中组氨酸标签重组蛋白的方法，包括如下步骤
(1)制备核酸适配体分子信标探针在ABIDNA synthersizer上合成所述的核酸适配体分子信标探针；
(2)将待测细胞裂解物加入到含有步骤(I)所述核酸适配体分子信标探针的缓冲溶液中，通过检测探针荧光强度的变化检测细胞裂解物中的含组氨酸标签的重组蛋白。
当溶液中没有含组氨酸标签的重组蛋白存在时，核酸适配体分子信标探针为茎环结构，此时FAM基团的荧光信号被Dabcyl基团猝灭；当溶液中存在可以与探针结合的组氨酸标签重组蛋白时，探针茎部会改变物理结构使得荧光基团FAM远离猝灭基团Dabcyl，进而使得荧光信号可以被检测到。下面对本发明的探针及检测方法作进一步的说明
本发明的抗组氨酸标记核酸适配体分子信标探针，是一种可以对多种目标进行识别的 新型分子信标。本发明选用6H5核酸适配体，其可以特异性识别组氨酸标记蛋白，通过对一系列可能的6H5序列长度及短链cDNA的比较最终确定探针结构如下5’ -FAM-CAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGTGTACG - (CH2CH20) 36-CAACCTG-Dabcyl_3，，其中，CAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGTGTACG (SEQ ID NO. I)为核酸适配体6H5，即，组氨酸标签识别序列；核酸片段cDNA CAACCTG (SEQ ID NO. 2)是与核酸适配体6H5中CAGGTTG的互补序列；PEG36为桥联分子；FAM为六羧基荧光素，作为荧光报告基团；Dabcyl作为猝灭基团。其中核酸适配体分子信标探针中双链互补杂交的能力弱于核酸适配体探针与组氨酸标签结合的能力。本发明检测细胞裂解物中组氨酸标记蛋白的方法包括如下步骤
(1)制备核酸适配体分子信标探针在ABIDNA synthersizer上合成所述的核酸适配体分子信标探针；
(2)取纳摩的物质的量的核酸适配体分子信标探针溶于微升结合缓冲溶液中，其最终浓度为25纳摩。取一定量该溶液于95度加热10分钟后，缓慢冷却至室温。于室温由 Fluorolog spectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)记录该探针的突光强度。往已淬火的探针溶液中加入待测细胞裂解物。室温孵育一小时后，于室温由FlUOTOlOgspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)记录探针溶液的突光变化。利用本发明的核酸适配体分子信标探针检测细胞裂解物中组氨酸标记蛋白的原理如下
当溶液中不存在组氨酸标签蛋白质时，核酸适配体分子信标探针的部分碱基(CAGGTTG)与cDNA (CAACCTG)杂交形成双链，整个分子呈一种茎环的结构，在这种茎环结构中，FAM荧光基团和猝灭基团Dabcyl相互靠近，因此FAM基团的光信号被Dabcyl基团猝灭；当溶液中有组氨酸标签蛋白质存在时，核酸适体分子信标探针中整个核酸适体适配体序列参与结合，茎环结构被迫打开，导致荧光基团远离猝灭基团使得荧光信号恢复。本发明具有以下特点
I、探针制备简单，价格低廉。2、能够快速检测并定量分析。3、相较于抗体对蛋白质有更好的亲和能力。4、不需蛋白质标记，可以直接检测细胞裂解液中组氨酸标记蛋白。
图I为核酸适配体分子信标探针的示意图；
图2为核酸适配体分子信标探针对P68蛋白和含组氨酸标签P68重组蛋白的动力学响应 图3为核酸适配体分子信标探针对不同蛋白质的荧光响应图；其中，Ftl代表待检分析物不存在时，探针的荧光强度^代表待检分析物存在时，探针的荧光强度。其中牛血清蛋白质(BSA*)浓度为10微摩，H6多肽浓度为8微摩，其余蛋白浓度均为200纳摩；
图4为核酸适配体分子信标探针对不同浓度组氨标签P78重组蛋白荧光响应图。其中，自下至上浓度分别为0，6.25，13，25，50，100, 200, 400纳摩；内插图为三次重复实验得出的F/匕和his-P78蛋白浓度的线性关系 图5为核酸适配体分子信标探针对20微克含his-p78重组蛋白的大肠杆菌裂解全蛋白的荧光响应图；其中，曲线I为加入裂解全蛋白后核酸适配体分子信标探针荧光光谱图，曲线2为加入裂解全蛋白前核酸适配体分子探针荧光光谱图。
具体实施例方式 实施案例I :核酸适配体分子信标探针制备
一种如图I所示的本发明检测组氨酸标签的核酸适配体分子信标探针，该探针包括核酸适配体分子信标探针和分别连接5端和3端的荧光基团和猝灭基团。核酸适配体分子信标探针包括组氨酸标签识别序列(5，-CAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGTGTACG 3’)、接在3端与核酸适配体部分碱基互补的核酸片段cDNA {CAACCTG)以及连接两个核酸片段的桥联分子PEG36。其中核酸适配体分子信标探针中双链互补杂交的能力弱于核酸适配体与组氨酸标签结合的能力。本实施案例中核酸适配体分子信标探针设计后于ABI DNAsynthersizer 上合成。实施例2 :核酸适配体分子信标探针对组氨酸标记蛋白的动力学响应
取纳摩的物质的量的探针溶于微升结合缓冲溶液中，其最终浓度为25纳摩。取两管200微升该溶液于95度加热10分钟后，缓慢冷却至室温。加入含组氨酸标签P78重组蛋白或P78蛋白，使蛋白最终浓度均为300纳摩。同时由Fluorolog spectrophotometer (JobinYvon Horiba)记录核酸适配体分子探针的突光变化。实验结果如图2所示,在加入最终浓度为300纳摩的组氨酸标签P78蛋白400秒后，核酸适配体分子信标探针荧光急剧增强并随着时间持续增大；而最终浓度为300纳摩的无组氨酸标签P78蛋白几乎不引起分子探针的荧光变化。该实施案例表明本专利提供的核酸适配体分子信标探针能快速并特异性识别组氨酸标签重组蛋白。实施例3 :核酸适配体分子信标探针对多种组氨酸标记蛋白的特异性识别取纳摩的物质的量的探针溶于微升结合缓冲溶液中，其最终浓度为25纳摩。取200微升该溶液于95度加热10分钟后，缓慢冷却至室温。于室温由FlUOTologspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)记录该核酸适配体分子信标探针的突光强度。往200微升已淬火的探针溶液中分别加入含组氨酸标签的P68重组蛋白(终浓度为200纳摩)、含组氨酸标签的P78重组蛋白(终浓度为200纳摩)、含组氨酸标签的GSTZ重组蛋白(终浓度为200纳摩)、组氨酸标签多肽(终浓度为10微摩)、P68蛋白(终浓度为200纳摩)、P78蛋白(终浓度为200纳摩)、牛血清蛋白BSA (最终浓度为200纳摩)和牛血清蛋白BSA* (最终浓度为10微摩)。室温孵育一小时后，于室温由Fluorolog spectrophotometer (JobinYvon Horiba)记录探针溶液的荧光变化。如图3所示，对于组氨酸标签多肽和含组氨酸标签的重组蛋白(his-p68、his-p78和his-GSTZ)具有很强的识别性能力；然而对无组氨酸标签的p68、p78和浓度高达10微摩牛血清蛋白的响应信号非常低。该实施案例说明本专利提供的分子信标核酸适配体分子信标探针能特异性识别与检测含组氨酸标签蛋白。 实施例3 :核酸适配体分子信标探针对不同浓度P78-组氨酸标记蛋白的检测比较 取纳摩尔物质的量的探针溶于微升结合缓冲溶液中，其最终浓度为25纳摩。取
200微升该溶液于95度加热10分钟后，缓慢冷却至室温。于室温由FlUOTologspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)记录该分子信标核酸适配体探针的突光强度。往200微升已淬火的探针溶液中分别加入不同终浓度(6. 25-400纳摩)的含组氨酸标签的p78重组蛋白。室温孵育一小时后，于室温由Fluorolog spectrophotometer (Jobin YvonHoriba)记录探针溶液的荧光变化。如图4所示，不同浓度的含组氨酸标签的P78重组蛋白引起分子探针产生不同程度的荧光强度变化。该探针的检测下限(基于3倍信噪比)可达4.2 nM。该实施案例表明该核酸适配体分子信标探针可以用于检测和量化组氨酸标记蛋白质。。实施案例4 :核酸适配体分子信标探针检测细胞裂解液中的his_P78重组蛋白
取纳摩的物质的量的核酸适配体分子信标探针溶于微升结合缓冲溶液中，其最终浓度为25纳摩。取200微升该溶液于95度加热10分钟后，缓慢冷却至室温。于室温由FlUOTologspectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)记录该核酸适配体分子探针的突光强度。往200微升已淬火的探针溶液中加入20微克含his-p78重组蛋白的大肠杆菌裂解全蛋白。室温孵育一小时后，于室温由 Fluorolog spectrophotometer (Jobin Yvon Horiba)记录探针溶液的荧光变化。如图5所示，20微克含his-p78重组蛋白的大肠杆菌裂解全蛋白导致分子探针明显的荧光强度变化，根据图4中探针荧光强度变化与his-P78重组蛋白浓度线性关系，his-P78重组蛋白在大肠杆菌裂全蛋白中浓度为178. 8纳摩。
权利要求
1.一种检测组氨酸标签的核酸适配体分子信标探针，其特征在于，所述探针包含SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的序列；SEQ ID NO. I所示序列的3’端与SEQ ID NO. 2所示序列的5’端通过PEG36桥联；SEQ ID NO. I所示序列5’端修饰有荧光基团FAM ；SEQ ID NO. 2所示序列3’端修饰有淬灭基团Dabcyl。
2.如权利要求I所述的核酸适配体分子信标探针，其特征在于，当所述核酸适配体分子信标探针未与组氨酸标记蛋白结合时，探针为茎环结构，探针的FAM基团的荧光信号被Dabcyl基团猝灭；当所述核酸适配体分子信标探针与组氨酸标记蛋白结合时，探针的茎环结构改变，荧光基团FAM远离猝灭基团Dabcyl，使得FAM基团的荧光信号恢复。
3.一种基于权利要求I或2所述的核酸适配体分子信标探针检测细胞裂解物中组氨酸标签重组蛋白的方法，包括如下步骤 (1)制备核酸适配体分子信标探针在ABIDNA synthersizer上合成权利要求I所述的核酸适配体分子信标探针； (2)将待测细胞裂解物加入到含有步骤(I)所述探针的缓冲溶液中，通过检测探针荧光强度的变化来检测细胞裂解物中的组氨酸标记蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种检测组氨酸标签的核酸适配体分子信标探针及利用该探针检测细胞裂解物中组氨酸标签重组蛋白的直接通用方法。本发明的核酸适配体探针包含SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列；SEQIDNO.1所示序列的3’端与SEQIDNO.2所示序列的5’端通过PEG36桥联；SEQIDNO.1所示序列5’端修饰有荧光素FAM；SEQIDNO.2所示序列3’端修饰有淬灭基团Dabcy1。利用本发明的核酸适配体分子信标探针，不需蛋白质标记并可快速定量分析细胞裂解液中组氨酸标签重组蛋白质表达，本发明的方法具有普遍、廉价并且可以简单快速定量分析组氨酸标签重组蛋白的优点。
文档编号C12Q1/68GK102719430SQ20121019314
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者丁玎, 张晓兵, 谭晓红, 谭蔚泓 申请人:湖南大学