专利名称：一种用于外周血中循环癌细胞的特异性捕获的装置及方法
技术领域：
本发明涉及细胞特异性捕获装置及方法，尤其涉及一种基于方形毛细管通道和核酸适配体的细胞亲和色谱对外周血中循环肝癌细胞进行捕获的装置及方法。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的一种主要疾病，其致死的主要原因是具有侵袭能力的肿瘤细胞转移其它组织器官。目前肿瘤转移理论认为，肿瘤细胞需要先从原发病灶脱离并进入血液或淋巴循环，才能在远处形成转移灶。同时研究表明循环肿瘤细胞数目与预后有着非常密切的关联。因此对外周血中循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)的检测和分析有助于肿瘤的早期诊断、术后监测、疗效评估，为发展个体化治疗提供新的依据。 然而，CTC在外周血中细胞数目稀少，一般在IO6 — IO7个细胞中仅含有一个CTC。另外CTC缺少有别于其它血细胞的特异性标志物；而且不同组织学类型和分子表型的肿瘤表达不同的标志物。这些问题使得CTC检测和分析面临这重大挑战。目前，CTC检测和分析方法主要有基于细胞形态学或细胞免疫学的细胞计数法、流式细胞术、镭射扫描细胞计数器和光导纤维阵列扫描技术等。这些方法在临床应用上取得不同程度的进展。但是分析仪器昂贵、样品细胞需要预处理和较长的分析时间，以及特异性抗体的缺失等问题使得这些方法无法满足CTC便捷、快速和高特异性和高灵敏的分析要求。核酸适配体是通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)获得的，能通过折叠成特定空间结构特异性结合小分子，蛋白质乃至细胞的单链DNA或RNA。与和抗体相比，核酸适配体具有获取迅速、稳定、可再生、易于合成和修饰等优点。目前识别活肿瘤细胞的核酸适体已经广泛用于淋巴瘤、肝癌和肺癌等多种肿瘤细胞分型、富集和检测。2009年，W. Tan小组和U. Dharmasiri小组分别报道了基于核酸适配体的微流体通道细胞捕获技术(Y.Xuj J. A. Phillips, J. Yanj Q. Li，Z. H. Fan and W. Tan, Analytical chemistry,2009，81，7436-7442. ) (J. A. Phillips, Y. Xuj Z. Xiaj Z. H. Fan and W. Tan,Analytical chemistry, 2009，81，1033-1039. ) (U. Dharmasiri，S. Balamurugan，A.A. Adams, P. I. Okagbare，A. Obubuafo and S. A. Soper, Electrophoresis, 2009，30，3289-3300.)。这些研究给发展核酸适体探针识别和捕获CTC技术提供了基础。
发明内容
本发明旨在克服现有技术中的不足，提供一种便捷、快速和通用性的细胞特异性捕获装置及方法。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
所述用于细胞特异性捕获的装置包括注射器1，通过Teflon细管2与注射器I连通的方形毛细管3 ;所述方形毛细管3内壁通过生物素-亲和素体系修饰有核酸适配体。所述基于上述装置特异性捕获外周血中循环癌细胞的方法，包括如下步骤
(I)合成特异性识别靶细胞的核酸适配体探针；(2)核酸适配体探针的固定清洗方形毛细管；用注射器将含5mg/mL亲和素的D-PBS导入已处理的方形毛细管中，孵育5 15min ;用D-PBS洗涤方形毛细管，去除过量亲和素；将合成好的核酸适配体探针注入方形毛细管，培养Imin后用D-PBS洗涤方形毛细管，去除游离的或未特异性吸附在方形毛细管壁的核酸适配体探针；
(3)靶细胞的捕获将含有靶细胞的细胞悬浊液加入开有小口的平皿中，并将平皿置于磁力搅拌器上搅拌；将吸附有核酸适配体探针的方形毛细管插入平皿的小口中，抽动注射器，使含有靶细胞的悬液缓慢通过方形毛细管；用D-PBS洗涤方形毛细管，去除未与核酸适配体探针特异性结合的细胞；
(4)被捕获细胞的洗涤和浓度测定将空气导入方形毛细管，使被捕获的癌细胞洗脱并用D-PBS收集；用血细胞计数器测定所得溶液中被捕获细胞的数目。其中，所述核酸适配体探针从5端至3端由三部分组成，分别为肿瘤细胞识别序列、降低空间位阻的Tltl序列和生物素
其中，所述的靶细胞为肝癌细胞或肺癌细胞。下面对本发明做进一步说明
所述用于细胞特异性捕获的装置包括注射器1，通过Teflon细管2与注射器I连通的方形毛细管3，具体制作方法如下截取一段8cm的方形毛细管，用乙醇清洗以去除残余碎片。然后用一 2cm Teflon细管(聚四氟乙烯，PTFE)将该方形毛细管和一支500uL U-100胰岛素注射器连接，500 uL U-100胰岛素注射器作为核酸适体探针固定的载体和流体通道的方形毛细管。所述基于上述装置特异性捕获外周血中循环癌细胞的方法，包括如下步骤
(1)合成特异性识别靶癌细胞的核酸适配体探针，其中，特异性识别癌细胞的核酸适配体探针使用DNA/RNA合成仪合成，核酸适配体探针从5端至3端由三部分组成，分别为肿瘤细胞识别序列、降低空间位阻的Tltl序列和生物素；DNA纯化通过HPLC实现；DNA浓度通过紫外-可见光谱仪测定；
(2)核酸适配体探针的固定用50uL IM NaOH清洗和活化方形毛细管，再用50 uL去离子水洗涤后用注射器将50 uL含5 mg/mL亲和素的D-PBS导入已处理的方形毛细管中，孵育15分钟；用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管，去除过量亲和素；将10 uL合成好的核酸适配体探针注入方形毛细管，培养Imin后用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管，去除游离的或未特异性吸附在方形毛细管壁的核酸适配体探针；
(3)癌细胞的捕获为避免细胞沉降，将ImL含有癌细胞的细胞悬浊液加入开有小口的平皿中，并将平皿置于磁力搅拌器上搅拌；将吸附有核酸适配体探针的方形毛细管插入平皿的小口中，抽动注射器，使含有癌细胞的悬液缓慢通过方形毛细管；整个过程持续IOmin,用不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管，去除未与核酸适配体探针特异性结合的细胞；
(4)被捕获细胞的洗涤和浓度测定将空气导入方形毛细管，使被捕获的癌细胞洗脱并用10 uL不含亲和素的D-PBS收集；用血细胞计数器测定所得溶液中癌细胞的数目。其中，所述的癌细胞为肝癌细胞或肺癌细胞。与传统微通道相比，本发明的装置中方形毛细管在亲和细胞分离中具有以下优
占-
^ \\\ (I)表面容易修饰捕获探针。(2)可以通过并联或串联的方式进行多目标物结合，为同时捕获多种肿瘤细胞提供了可能。(3)在同一直径下，方形毛细管比圆形毛细管拥有更大的表面积和容积，可以在表面修饰更多的捕获探针，实现更大的液体通量。(4)能显著减少光散射和扭曲变形，提高信背比。采用本发明的细胞捕获装置及方法，使细胞捕获更加灵敏、便捷和快速；本发明的核酸适配体固定一次性完成，可以实现对目标癌细胞高选择性和高特异性的捕获，并提供了一种简便易行的洗脱方法，本发明所述捕获方法，无需复杂的表面修饰过程，成本低廉且耗时少，操作简单，具有极为广泛的应用前景；本发明的装置不仅适用于对外周血中循环癌细胞的特异性捕获，还适用于从含有复杂细胞成分的样本(全血样本或组织样本)中通过一次样本进样进行特异性靶细胞捕获。
图I为本发明用于细胞特异性捕获的装置的结构示意 图2为图I所示装置在捕获细胞时方形毛细管的透视放大图。图中1、注射器；2、Teflon细管；3、方形毛细管；6、亲和素；7、生物素-适配体复合物；8、靶细胞。
具体实施例方式 实施例I
如图I和图2所示，所述用于细胞特异性捕获的装置包括注射器1，通过Teflon细管2与注射器I连通的方形毛细管3 ;所述方形毛细管3内壁吸附有亲和素6和生物素-适配体复合物7。实施例2 :外周血中循环肝癌细胞的特异性捕获方法 (I) DNA序列LI的合成
核酸适配体探针LI (斜体部分为识别肝癌细胞的核酸序列，3’末端修饰生物素)
5，-AGTCCATTTTATTCCTGAATATTTGTTAACCTCAr^CTTTTTTTTTT-3J -biotin用于捕获肝癌细胞的DNA序列LI使用ABI3400 DNA/RNA合成仪合成。合成原料购自Glen Research (Sterling, VA)。DNA 纯化通过 ProStar HPLC (Varian)实现。DNA 浓度通过Cary Bio-300紫外-可见光谱仪(Varian)测定。(2) DNA序列LI在捕获装置上的固定
用50 uL IM NaOH清洗和活化方形毛细管；用50 uL去离子水洗涤5次后用注射器将50 uL含5 mg/mL亲和素的D-PBS导入已处理的方形毛细管中，孵育15分钟；用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管，去除过量亲和素；将10 uL浓度为50Um的核酸适配体探针LI注入方形毛细管，培养Imin后用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管3次，去除游离的或未特异性吸附在方形毛细管壁的核酸适配体探针LI。(3)目标肝癌细胞的捕获
为避免细胞沉降，将I mL含有肝癌细胞的悬浊液加入平皿并置于磁力搅拌器上搅拌。将毛细管插入平皿后，缓慢使抽动注射器，使含细胞溶液缓慢通过方形毛细管。整个过程持续IOmin后，用50 uL D-PBS洗涤三次，移除非特异性吸附的细胞。
为避免细胞沉降，将I mL含有癌细胞的细胞悬浊液加入开有小口的平皿中，并将平皿置于磁力搅拌器上搅拌；将吸附有核酸适配体探针LI的方形毛细管插入平皿的小口中，抽动注射器，使含有癌细胞的悬液缓慢通过方形毛细管；整个过程持续lOmin，用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管3次，去除未被特异性吸附的细胞。(4)目标肝癌细胞的洗涤和浓度测定
将空气导入毛细管，将捕获的细胞被洗脱并用10 uL不含亲和素的D-PBS收集，用血细胞计数器测定所得溶液中细胞的数目。
实施例3 :外周血中循环小细胞肺癌细胞(SCLC)的特异性捕获方法 (I) DNA序列L2的合成
核酸适配体探针L2 (斜体部分为识别小肺癌细胞的核酸序列，3’末端修饰生物素)
5’ -GTGGATTGTTGTGTTCTGTTGGTTTTTGTGTTGTGTmmm- ,9 -biotin ；
用于捕获小肺癌细胞的DNA序列L2使用ABI3400 DNA/RNA合成仪合成。合成原料购自 Glen Research (Sterling, VA)。DNA 纯化通过 ProStar HPLC (Varian)实现。DNA 浓度通过Cary Bio-300紫外-可见光谱仪(Varian)测定。(2) DNA序列L2在捕获装置上的固定
用50 uL IM NaOH清洗和活化方形毛细管；用50 uL去离子水洗涤5次后用注射器将50 uL含5 mg/mL亲和素的D-PBS导入已处理的方形毛细管中，孵育15分钟；用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管，去除过量亲和素；将10 uL浓度为50Um的核酸适配体探针L2注入方形毛细管，培养Imin后用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管3次，去除游离的或未特异性吸附在方形毛细管壁的核酸适配体探针L2。(3)目标小肺癌细胞的捕获
为避免细胞沉降，将I mL含有目标小肺癌细胞的细胞悬浊液加入平皿并置于磁力搅拌器上搅拌。将毛细管插入平皿后，缓慢使抽动注射器，使含细胞溶液缓慢通过方形毛细管。整个过程持续IOmin后，用50 uL D-PBS洗涤三次，移除非特异性吸附的细胞。为避免细胞沉降，将I mL含有小肺癌细胞的细胞悬浊液加入开有小口的平皿中，并将平皿置于磁力搅拌器上搅拌；将吸附有核酸适配体探针L2的方形毛细管插入平皿的小口中，抽动注射器，使含有癌细胞的悬液缓慢通过方形毛细管；整个过程持续lOmin，用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管3次，去除未被特异性吸附的细胞。(4)目标小肺癌细胞的洗涤和浓度测定
将空气导入毛细管，将捕获的细胞被洗脱并用10 uL不含亲和素的D-PBS收集，用血细胞计数器测定所得溶液中细胞的数目。实施例4 :外周血中循环非小细胞肺癌细胞(NSCLC)的特异性捕获方法
(I)DNA序列L3的合成
核酸适配体探针L3 (斜体部分为识别非小肺癌细胞的核酸序列，3’末端修饰生物素) 5，-CGAACAGGTGGGTGGGTTGGGTGGArr^rrCi TTTTTTTTTT-3J -biotin ；
用于捕获非小肺癌细胞的DNA序列L3使用ABI3400 DNA/RNA合成仪合成。合成原料购自 Glen Research (Sterling, VA)。DNA 纯化通过 ProStar HPLC (Varian)实现。DNA浓度通过Cary Bio-300紫外-可见光谱仪(Varian)测定。
(2) DNA序列L3在捕获装置上的固定
用50 uL IM Na OH清洗和活化方形毛细管；用50 uL去离子水洗涤5次后用注射器将50 uL含5 mg/mL亲和素的D-PBS导入已处理的方形毛细管中，孵育15分钟；用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管，去除过量亲和素；将10 uL浓度为50Um的核酸适配体探针L3注入方形毛细管，培养Imin后用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管3次，去除游离的或未特异性吸附在方形毛细管壁的核酸适配体探针L3。(3)目标小非肺癌细胞的捕获
为避免细胞沉降，将I mL含有目标非小肺癌细胞的细胞悬浊液加入平皿并置于磁力搅拌器上搅拌。将毛细管插入平皿后，缓慢使抽动注射器，使含细胞溶液缓慢通过方形毛细管。整个过程持续IOmin后，用50 uL D-PBS洗涤三次，移除非特异性吸附的细胞。为避免细胞沉降，将I mL含有非小肺癌细胞的细胞悬浊液加入开有小口的平皿中，并将平皿置于磁力搅拌器上搅拌；将吸附有核酸适配体探针L3的方形毛细管插入平皿的小口中，抽动注射器，使含有癌细胞的悬液缓慢通过方形毛细管；整个过程持续lOmin，用50 uL不含亲和素的D-PBS洗涤方形毛细管3次，去除未被特异性吸附的细胞。(4)目标非小肺癌细胞的洗涤和浓度测定
将空气导入毛细管，将捕获的细胞被洗脱并用10 uL不含亲和素的D-PBS收集，用血细胞计数器测定所得溶液中细胞的数目。
权利要求
1.一种用于外周血中循环癌细胞的特异性捕获的装置，其特征在于，所述装置包括注射器(1)，通过Teflon细管(2)与注射器(I)连通的方形毛细管(3)。
2.如权利要求I所述的装置，其特征在于，所述方形毛细管(3)内壁通过生物素-亲和素体系修饰有核酸适配体。
3.一种基于权利要求I或2所述的装置特异性捕获外周血中循环癌细胞的方法，包括如下步骤 (1)合成特异性识别靶细胞的核酸适配体探针； (2)核酸适配体探针的固定清洗方形毛细管；用注射器将含5mg/mL亲和素的D-PBS导入已处理的方形毛细管中，孵育5 15min ;用D-PBS洗涤方形毛细管，去除过量亲和素；将合成好的核酸适配体探针注入方形毛细管，培养Imin后用D-PBS洗涤方形毛细管，去除游离的或未特异性吸附在方形毛细管壁的核酸适配体探针； (3)靶细胞的捕获将含有靶细胞的细胞悬浊液加入开有小口的平皿中，并将平皿置于磁力搅拌器上搅拌；将吸附有核酸适配体探针的方形毛细管插入平皿的小口中，抽动注射器，使含有靶细胞的悬液缓慢通过方形毛细管；用D-PBS洗涤方形毛细管，去除未与核酸适配体探针特异性结合的细胞； (4)被捕获细胞的洗涤和浓度测定将空气导入方形毛细管，使被捕获的癌细胞洗脱并用D-PBS收集；测定所得溶液中被捕获细胞的数目。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核酸适配体探针从5端至3端由三部分组成，分别为肿瘤细胞识别序列、降低空间位阻的Tltl序列和生物素。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的靶细胞为肝癌细胞或肺癌细胞。
6.如权利要求I所述的装置在从含有复杂细胞成分的样本中通过一次样本进样进行特异性靶细胞捕获中的应用；其中所述的含有复杂细胞成分的样本是全血样本或组织样本。
全文摘要
本发明公开了一种高选择性，高灵敏度，具有普适性的细胞特异性捕获装置及方法，本发明的核酸适配体固定一次性完成，可以实现对目标癌细胞高选择性和高特异性的捕获，并提供了一种简便易行的洗脱方法。本发明所述捕获方法，无需复杂的表面修饰过程，成本低廉且耗时少，操作简单，具有极为广泛的应用前景。
文档编号C12N5/09GK102719353SQ20121019314
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者吕一帆, 蒋健晖, 谭蔚泓, 陈卓 申请人:湖南大学