一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于细胞培养技术领域，具体地说，是一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]裸驢鼠(Heterocephalusglaber ,Naked mole-rat)是一种极具研究价值的新型实验动物，它具有耐低氧、抗衰老和抗肿瘤等诸多奇特的生物学特性，在老年病学、肿瘤学、免疫学等医学和生命科学研究领域中发挥着重大作用，具有不可替代的地位。尤其是在耐低氧研究方面，为缺氧相关的心血管疾病等研究提供了理想的研究载体和科研工具。心肌细胞是心脏的基本组成单位，是进行生理、药理、病理、毒理及能量代谢等方面研究的主要细胞来源，同时也是心肌组织工程种子细胞的主要来源之一。目前，由于裸鼹鼠动物来源珍贵、稀有，且生物学特性独特，国内尚无针对裸鼹鼠心肌细胞培养方法的研究，这极大地影响和限制了新型实验动物裸鼹鼠在生命科学研究尤其是在心血管疾病研究中的推广应用。因此，亟需开展培养裸鼹鼠心肌细胞的相关技术研究。
[0003]中国专利文献CN104087550A公开了一种大鼠心肌细胞的培养方法，其特征在于，其包括如下步骤:(I)将大鼠心肌组织浸于消化酶混合液中进行分次消化至心肌组织松软后弃去消化液，然后加入DMEM培养基，吹打松软的心肌组织，取上清进行离心收获细胞沉淀，所述的消化酶混合液包括0.7?1.0g/L胰蛋白酶和0.5?0.8g/L II型胶原酶；(2)以DMEM培养基重悬步骤(I)所得的细胞沉淀，将细胞悬液过180?220目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁2?3次，每次40?50分钟；(3)取差速贴壁后培养瓶中的细胞悬液，将心肌细胞以1.5?2.5 X 15个/mL的密度接种于培养容器中，接种后将培养容器置于培养箱中培养;其中，步骤(I)和(2)中所述的DMEM培养基为含8?12 % FBS的DMEM培养基，所述的百分比为体积百分比。优选步骤(I)消化在温度为36.5?37.5°C的环境中进行，步骤(2)FBS的浓度为10%，所述细胞悬液过200目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁，差速贴壁的次数为2次，所述差速贴壁的时间为每次45分钟。优选步骤(3)中，培养的条件为将培养容器置于37°C、CO2浓度为50mL/L的培养箱中培养。
[0004]但是关于一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法目前还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法。该培养方法中，裸鼹鼠的心肌细胞分离、纯化操作步骤简单，细胞贴壁快、存活率高，细胞培养体系稳定性好，是一种较为理想的裸鼹鼠原代心肌细胞培养方法，基本可以满足医学、生物学、药学和生命科学各研究领域对裸鼹鼠心肌细胞相关实验研究的要求，适宜在一般实验室进行推广应用。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法，包括以下步骤:
[0007](A)向裸鼹鼠心肌组织中加入胰蛋白酶进行消化1-2次，弃去上清液；
[0008](B)在步骤(A)中所得的细胞沉淀中，加入混合消化液，轻轻吹打心肌组织悬液进行消化后，静置；
[0009](C)收集步骤(B)中的上清液，用200目细胞筛过滤后，立即加入等量终止液终止消化，并于冷冻离心机中4°C、1000rpm、离心5min;
[0010](D)步骤(C)中所得的细胞沉淀，依次重复操作步骤B、步骤C两次以上(尽量通过过滤筛筛选消化充分的组织悬液)；
[0011](E)收集所有细胞于同一离心管中，用适量终止液重悬细胞，并于冷冻离心机中40C、lOOOrpm、离心5min，弃去上清液，于细胞沉淀中加入适量终止液重悬细胞，再次于冷冻离心机中4°C、lOOOrpm、离心5min，弃去上清液，于细胞沉淀中加入适量终止液重悬、混勾细胞；
[0012](F)将步骤(E)中所得细胞悬液接种于培养容器中，置于培养箱内培养，通过差速贴壁法分离心脏成纤维细胞与心肌细胞；
[0013](G)收集步骤(F)中未贴壁的心肌细胞悬液，于冷冻离心机中4°C、lOOOrpm、离心5min，所得细胞沉淀用培养基混悬后，置于培养箱内培养。
[0014]其中，步骤(A)所述的裸鼹鼠优选裸鼹鼠乳鼠(以下简称乳鼠)，所述的乳鼠选择1-3日龄的新生乳鼠，出生日龄越小越好，并且动物雌雄不限。
[0015]步骤(A)所述的裸鼹鼠心肌组织可通过以下步骤制备得到:
[0016](I)取新生裸鼹鼠乳鼠，用75%酒精消毒后，移入超净工作台内；
[0017](2)将乳鼠仰卧位放置，用眼科剪于靠近乳鼠剑突稍偏左上方向，剪开胸腔部位皮肤，剪断胸骨和肋骨，心脏自然跃出；
[0018](3)用另一眼科剪剪取心尖组织后，置于4°C预冷的D-hank’s溶液中，充分洗涤3次，洗净组织中残留的积血；
[0019](4)将心尖组织移入青霉素小瓶内，用眼科剪将其剪成约ImmX ImmX Imm大小的心肌组织块。所述的青霉素小瓶，首次使用前，先用强酸氧化剂洗液(12%重铬酸钾(K2Cr2O7)的浓硫酸(浓H2SO4)混合液)浸泡过夜，然后自来水冲洗15-20遍，每遍都要把瓶内壁的水尽力甩出去，烘干后，再用双蒸水冲洗3遍，最后锡箔纸封口，180°C灭菌2h后烘干备用。
[0020]其中，步骤(A)所述的胰蛋白酶浓度为0.08% (w/v)，采用0.25%(w/v)胰蛋白酶和D-hank’s溶液按照体积比1:2混合均匀配制而成。本发明中胰蛋白酶的用量需依据待消化的心肌组织的量进行确定，原则上需要完全浸没心肌组织并有适量多余。胰蛋白酶浓度过高，容易引起消化过度而导致损伤组织，后续细胞培养中，细胞贴壁数量少，功能性细胞数量也会减少，具体可参照对比例I。
[0021]步骤(A)中消化次数不宜超过2次，否则可能消化过度容易损伤心肌组织;每次消化时间5?1min，优选8min ；消化的温度35?37°C，优选35°C。
[0022]其中，步骤(B)中混合消化液为0.125% (w/v)胰蛋白酶和0.3%(w/v) Π型胶原酶按照体积比2:1混合均匀配制而成，混合消化液中胰蛋白酶终浓度为0.08% (w/v)，Π型胶原酶终浓度为0.1 % (w/V)。步骤(B)中每次消化时间5?1min，优选8min ；消化的温度35?37°C，优选35°C ο与现有技术中混合消化液浓度的对比试验参见对比例2。
[0023]其中，步骤(C)和步骤(E)所述的终止液为含8?12% (v/v)胎牛血清(FetalBovine Serum，FBS)的DMEM培养基，优选含8?12%(v/v)胎牛血清的DMEM低糖培养基。用DMEM低糖培养基，细胞状态会更好，且生长速度更佳，而DMEM高糖培养基的培养效果则差一些。与采用DMEM高糖培养基的对比试验参见对比例3。所述的DMEM低糖培养基中葡萄糖浓度为1000ml/L，DMEM高糖培养基中葡萄糖浓度为4500ml/L。
[0024]其中，步骤(D)所述的重复操作次数需依据待消化的心肌组织的量进行确定，分次消化直至心肌组织松软，完全看不见组织呈颗粒状，重复消化次数为6?10次，优选8次。
[0025]其中，步骤(F)所述的差速贴壁法细胞培养时间为60?90min，优选70min。利用差速贴壁法进行纯化细胞，其基本原理是利用成纤维细胞比心肌细胞更容易贴附于培养皿表面的特性，将细胞悬液预接种于培养瓶孵育，这样，绝大多数成纤维细胞均已贴壁，剩余在悬液中的主要就是心肌细胞(刘嘉祺，孙云云.乳鼠心肌细胞原代培养方法[J].微量元素与健康研究，2012,29(4):7-9.)。培养60?90min后，容易贴壁的是心脏成纤维细胞，没有贴壁的多为心肌细胞，在细胞悬液中收集后，用于后续细胞的培养;而贴壁的心脏成纤维细胞被丢弃处理。
[0026]所述的步骤(F)和步骤(G)中培养箱的环境温度为35?37°C，02体积浓度为5%、C02体积浓度为5%。
[0027]普通实验动物细胞培养温度一般在37°C左右，而本发明经过摸索发现，裸鼹鼠所有细胞消化和培养温度设定在35-37°C较佳，优选35°C，过高或过低则细胞不易增殖，或延缓细胞生长周期。对比试验参见对比例4。
[0028]培养箱⑶2浓度与其他动物是一样的，不同之处在于通过三气培养箱控制了O2浓度，O2浓度设置在体积浓度为5%，这对其他动物来讲，已经是低氧环境，因为大气的氧气体积浓度约为20%，一般动物细胞的培养环境氧气浓度也约为20%。对比试验参见对比例5。
[0029]其中，步骤(G)所述的培养基为含8?12%(V/V)FBS、1%(V/V)青、链霉素双抗抗菌液、0.1mmoI/L 5-Brdu(5-Bromo-2_deoxyUridine)的DMEM低糖培养基。用DMEM低糖培养基，细胞状态会更好，且生长速度更佳，而DMEM高糖培养基的培养效果则差一些。与采用DMEM高糖培养基的对比试验参见对比例3。
[0030]心肌细胞是一种功能性细胞，具有自发搏动的特征，以此判定是否为心肌细胞，但是这一步骤中，仍可能残存心脏成纤维细胞，只是数量大大减少，故而在培养液中加入抑制心脏成纤维细胞生长的5-Brdu，以达到给心肌细胞提供最好的培养体液环境。
[0031]本发明所用试剂和耗材均可市售获得。