专利名称：用于检测水仙花叶病毒和水仙黄条病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种用于检测水仙花叶病毒和水仙黄条病毒的试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，专用于水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的检测，不仅适用于ロ岸检验检疫部门对水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的快速检测，还可应用于农业部门对水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的实时监测和预警预报。
背景技术：
水仙花叶病韋(Narcissusmosaic virus, NMV)、水仙黄条病韋(Narcissusyellow stripe virus, NYSV)是危害水仙的两种主要病毒。其中水仙花叶病毒(NMV)属于线性病毒科(Flexiviridae)、马铃薯X病毒属(Potexvirus)成员，病毒粒体为线条状，大小约550nmX 13nm。NMV基因组为正义单链RNA，基因组全长为6955个核苷酸。NMV已报道的自然寄主为水仙，主要通过汁液接触传播。该病毒侵染水仙后，在发病初期植株叶片或花梗有不规则的褪绿斑，到生长后期，病情加重，花叶症状明显，并扩展为较大的斑块，发病严重时，甚至出现叶片扭曲、黄化，矮小畸形等症状。NMV主要分布在荷兰、英国和中国等国家。水仙黄条病毒(NYSV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，病毒粒体为弯曲线状，粒子大小为755nmX 12nm。NYSV基因组为正义单链RNA，全序列长为9650个核苷酸，该病毒主要通过蚜虫介体以非持久性方式传播。NYSV自然寄主局限于石蒜科的水仙、长寿花等几种植物。NYSV侵染水仙引起的典型症状为沿叶脉产生褪绿黄色条斑、系统花叶。NYSV可导致水仙病叶表面凸起、粗糙，花梗产生褪绿斑，病株花朵着色不均，形成花碎色，使其失去商品价值，最后导致鳞茎变小、植株矮化，直至提前枯萎。NYSV目前分布于欧洲、北美洲、澳洲及亚洲，包括英国、荷兰、立陶宛、美国、新西兰及中国。水仙花叶病毒(NMV)、水仙黄条病毒(NYSV)对水仙的产量和品质能够造成不同程度的影响，据统计，NYSV造成的产量损失平均为15. 2%，如果与其他病毒复合感染损失则可达30%。由于水仙花叶病毒(NMV)、水仙黄条病毒(NYSV)均可通过带病植株及种球进行远距离传播，因此加强NMV、NYSV检测技术的研究，建立快速、准确和灵敏的检测方法对于预防两种病毒的发生和扩散，保护水仙生产安全，具有极其重要的意义。利用生物学方法测定水仙花叶病毒(NMV)、水仙黄条病毒(NYSV)，尽管操作简单，但检测周期长，需要有固定的温室或网室，且结果易受人为及其他因素的影响；与生物学检测方法相比，血清学方法检测NMV、NYSV具有快速、灵敏和特异性强的优点，但不足的是需要使用特异性强、稳定性好的抗血清，导致检测成本増加。目前已报道的NMV、NYSV血清学检测方法主要是采用间接酶联免疫吸附测定方法(Clark等，Australasian PlantPathology, 2000, 29 :227 229)。电镜鉴定NMV、NYSV虽然直观，但该方法使用前提是需要昂贵的电镜设备和专门的操作人员，具有较大局限性，不适于普及推广。近年来，基于核酸水平的分子检测方法越来越多的应用到植物病毒检测领域，该方法与生物学測定、血清学检测和电镜鉴定等传统植物病毒检测方法相比，具有检测速度更快、准确性更好、灵敏度更高和特异性更强的优点。但到目前为止，关于水仙花叶病毒(NMV)、水仙黄条病毒(NYSV)分子检测方法的报道甚少，至今尚未见专门应用于两种病毒快速检测的分子检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种用于检测水仙花叶病毒和水仙黄条病毒的试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对进出境水仙及田间水仙上水仙花叶病毒、水仙黄条病毒进行快速、准确的检疫鉴定，满足ロ岸检验检疫和农业生产的需要。本发明技术方案如下(一)ー种用于检测水仙花叶病毒和水仙黄条病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括
I) PCR Buffer : IOX ;2) Mgcl2 25mmol/L ；3) dNTPs 10mmol/L ；4)反转录酶5U/μ L ;5)8應酶抑制因子4(^/^し；6 ) Taq DNA 聚合酶5U/ μ L ;7)试剂A :10 μ mol/L,内含上游引物NMV_f和下游引物NMV_r，其中上游引物NMV-f的序列为5’ -ACTCAGTCGCACCCGCTATG-3’，下游引物NMV_r的序列为5’ -GTGCTTCAATGGCGTACATGG-3’ ；8 )试剂B : 10 μ mol/L,内含上游引物NYSV-f和下游引物NYSV-r，其中上游引物NYSV-f的序列为5’ -GAAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3，，下游引物NYSV-r的序列为5’ -CACGCCTAGAAGGTTGTGCAT-3’ ；9)水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的阳性对照样品；10) RNase-free ddH20。(ニ)上述水仙花叶病毒和水仙黄条病毒试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤I)在PCR管中加入待测样品总 RNA2 μ LUOXPCR Buffer 2· 5 μ L、浓度为 25mmol/L MgCl25yL、浓度为 10mmol/L dNTPs 2. 5 μ L、浓度为 5U/μ L 反转录酶0. 5 μ L、浓度为 40U/μ L RNA酶抑制因子0. 5 μ L、浓度为5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L、浓度为10 μ mol/L的试剂A或试剂B 2 μ L、RNase-free ddH20 9. 5 μ L，使反应总体积为25 μ L ;混合后的反应液，先42° C反转录30min，接着94°C预变性3min，然后94°C变性45s、55°C退火50s、72°C延伸60s，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束；2)PCR反应结束后，取PCR产物10μ L用浓度为I. 5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化こ锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有水仙花叶病毒样品的电泳检测结果为在483bp处出现明亮的DNA条带，含有水仙黄条病毒样品的电泳检测结果为在751bp处出现明亮的DNA条带。本发明根据水仙花叶病毒、水仙黄条病毒基因序列设计特异性引物，经过反复实验筛选，确定了适合于水仙花叶病毒、水仙黄条病毒检测的上游引物和下游引物，再通过优化确定了最佳反应体系和反应程序，能够快速、准确、灵敏的检测水仙花叶病毒、水仙黄条病毒。较之现有技术而言，本发明所提供的用于检测水仙花叶病毒和水仙黄条病毒的试剂盒及其检测方法有益效果在于1)检测时间快本发明可以对水仙的种球、叶片、花等各个部位直接进行检測，无需将水仙栽培后取其叶片检测，整个检测过程仅需5-6小时；2)特异性强、灵敏度高本发明不仅可以将水仙花叶病毒、水仙黄条病毒与其他病毒进行特异性区分，而且可以对水仙样品中低含量的水仙花叶病毒、水仙黄条病毒进行准确鉴定；3)检测试剂盒制作方法简单、易于规模化生产，使用经济，具有很好的实际应用价值。
图I为实施例2的水仙花叶病毒检测結果。其中I :阳性对照；2_3 :携帯有水仙花叶病毒的样品。图2为实施例2的水仙黄条病毒检测結果。其中I :阳性对照；2_3 :携帯有水仙黄条病毒的样品。 图3为实施例3的水仙花叶病毒特异性验证結果。其中I :阳性对照；2 :水仙花叶病毒(NMV)样品；3 :水仙黄条病毒(NYSV)样品；4 :水仙迟季黄化病毒(NLSYV)样品；5 :水仙潜隐病毒(NLV)样品；6 :南芥菜花叶病毒(ArMV)样品。图4为实施例3的水仙黄条病毒异性验证結果。其中I :阳性对照；2 :水仙黄条病毒(NYSV)样品；3 :水仙花叶病毒(NMV)样品；4 :水仙迟季黄化病毒(NLSYV)样品；5 :水仙潜隐病毒(NLV)样品；6 :南芥菜花叶病毒(ArMV)样品。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进ー步说明。实施例I :水仙花叶病毒和水仙黄条病毒试剂盒的配置(10次检测量)1)PCR Buffer :10X，1 管(30yL);2) Mgcl2 :25mmol/L, I 管(60 μ L);3) dNTPs :10mmol/L，I 管(30μ L);4)反转录酶5υ/μ L, I 管(5μ L);5) RNA 酶抑制因子:40U/yL，l 管(5yL)；6) Taq DNA 聚合酶5U/yL，l 管(5yL);7)试剂A : 10 μ mol/L,内含上游引物NMV_f和下游引物NMV_r，其中上游引物NMV-f的序列为5’ -ACTCAGTCGCACCCGCTATG-3’，下游引物NMV_r的序列为5，-GTGCTTCAATGGCGTACATGG-3，，I 管(30 μ L);8 )试剂B : 10 μ mol/L,内含上游引物NYSV-f和下游引物NYSV-r，其中上游引物NYSV-f的序列为5’ -GAAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3，，下游引物NYSV-r的序列为5，-CACGCCTAGAAGGTTGTGCAT-3，，I 管(30 μ L);9)水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的阳性对照样品，2管(每管20μ L);10) RNase-free ddH20,1 管(lmL)。实施例2 :水仙花叶病毒和水仙黄条病毒试剂盒的检测方法上述水仙花叶病毒和水仙黄条病毒试剂盒的检测方法，包括以下步骤I)在PCR管中加入待测样品总 RNA2 μ LUOXPCR Buffer 2· 5μ L、浓度为 25mmol/L MgCl25yL、浓度为 lOmmol/L dNTPs 2. 5 μ L、浓度为 5U/μ L 反转录酶0. 5 μ L、浓度为 40U/μ L RNA酶抑制因子O. 5 μ L、浓度为5U/ μ L Taq DNA聚合酶O. 5 μ L、浓度为10 μ mol/L的试剂A或试剂B 2 μ L、RNase-free ddH20 9. 5 μ L，使反应总体积为25 μ L ;混合后的反应液，先42° C反转录30min，接着94°C预变性3min，然后94°C变性45s、55°C退火50s、72°C延伸60s，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束；2) PCR反应结束后，取PCR产物10 μ L用浓度为I. 5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化こ锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验結果；含有水仙花叶病毒样品的电泳检测结果为在483bp处出现明亮的DNA条带(图1)，含有水仙黄条病毒样品的电泳检测结果为在751bp处出现明亮的DNA条带(图2)，否则无。
实施例3 :水仙花叶病毒和水仙黄条病毒试剂盒的特异性验证I)水仙样品总RNA的提取分别以携带有水仙花叶病毒(NMV)、水仙黄条病毒(NYSV)、水仙潜隐病韋(Narcissus latent virus, NLV)、水仙迟李黄化病韋(Narcissuslate season yellows virus,NLSYV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)的水仙样品为材料，各取0. Ig置于研钵中，加入ImL PBST缓冲液研磨，4°C，IOOOOg离心5min，取上清并将上清液迅速转移至灭菌的I. 5mL离心管中，加入ImL TrizoL试剂，剧烈振荡后，室温静置5min ;4°C，12000g离心lOmin，取上清；加入氯仿300 μ L，剧烈震荡15s，室温静置5min，4°C，12000g离心15min，取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，4°C，12000g离心lOmin，弃上清；加入ImL 75%的こ醇洗涤沉淀2次，每次4° C，7500g离心3min,弃上清；RNA沉淀干燥后,用20 μ L RNase-free ddH20溶解；2)在PCR管中加入待测样品总 RNA2 μ LU0XPCR Buffer 2· 5μ L、浓度为 25mmol/L MgCl25yL、浓度为 10mmol/L dNTPs 2. 5 μ L、浓度为 5U/μ L 反转录酶0. 5 μ L、浓度为 40U/μ L RNA酶抑制因子0. 5 μ L、浓度为5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L、浓度为10 μ mol/L的试剂A或试剂B 2 μ L、RNase-free ddH20 9. 5 μ L，使反应总体积为25 μ L ;混合后的反应液，先42° C反转录30min，接着94°C预变性3min，然后94°C变性45s、55°C退火50s、72°C延伸60s，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束；3) PCR反应结束后，取PCR产物10 μ L用浓度为I. 5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化こ锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果(图3和图4)。从图3和图4可见，仅水仙花叶病毒、水仙黄条病毒分别在483bp、751bp处出现明亮的DNA条带，其他病毒样品均无，说明本发明试剂盒具有良好的特异性。实施例4 :进境水仙上水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的检测随机选取我国ロ岸截获的荷兰、英国水仙2批，每批样品15份，采用实施例3方法提取样品总RNA后进行检測，同时用IndirectELISA方法进行验证。从表I可见，从进境水仙样品中检出水仙花叶病毒(NMV) 5份，检出率为16. 7% ;水仙黄条病毒(NYSV) 23份，检出率为76. 7% ;上述结果与Indirect ELISA检测结果完全相符。表I进境水仙样品的检测结果
权利要求
1.ー种用于检测水仙花叶病毒和水仙黄条病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括I) PCR Buffer :10X ；2) Mgcl2 :25mmol/L ；3) dNTPs 10mmol/L ；4)反转录酶5U/y L ； 5)RNA 酶抑制因子40U/yL ;6)Taq DNA 聚合酶5U/yL;7)试剂 A:10 μ mol/L,内含上游引物NMV-f和下游引物NMV_r，其中上游引物NMV_f的序列为5’ -ACTCAGTCGCACCCGCTATG-3’，下游引物 NMV_r 的序列为 5’ -GTGCTTCAATGGCGTACATGG-3 ’ ；8)试剂B :10 μ mol/L,内含上游引物NYSV-f和下游引物NYSV_r，其中上游引物NYSV-f的序列为5’ -GAAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3，，下游引物NYSV-r的序列为5’ -CACGCCTAGAAGGTTGTGCAT-3’ ；9)水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的阳性对照样品；10)RNase-free ddH20。
2.利用权利要求I所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 1)在PCR管中加入待测样品总RNA2μ LUOXPCR Buffer 2. 5 μ L、浓度为25mmol/LMgCl25y L、浓度为 lOmmol/L dNTPs 2. 5 μ L、浓度为 5U/μ L 反转录酶 0. 5 μ L、浓度为 40U/μ L RNA酶抑制因子O. 5 μ L、浓度为5U/μ LTaq DNA聚合酶O. 5 μ L、浓度为10 μ mol/L的试剂A或试剂B 2 μ L、RNase-free ddH20 9. 5 μ L，使反应总体积为25 μ L ;混合后的反应液，先42° C反转录30min，接着94°C预变性3min，然后94°C变性45s、55°C退火50s、72°C延伸60s，如此共35个循环，最后一个循环结束后72°C继续延伸lOmin，反应结束； 2)PCR反应结束后，取PCR产物10 μ L用浓度为I. 5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化こ锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有水仙花叶病毒样品的电泳检测结果为在483bp处出现明亮的DNA条带，含有水仙黄条病毒样品的电泳检测结果为在751bp处出现明亮的DNA条带。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测水仙花叶病毒和水仙黄条病毒的试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括PCR Buffer、Mgcl2、dNTPs、反转录酶、RNA酶抑制因子、Taq DNA聚合酶、试剂A、试剂B、阳性对照和RNase-free ddH2O。本发明根据水仙花叶病毒、水仙黄条病毒基因序列设计特异性引物，利用一步法反转录聚合酶链式反应技术对水仙花叶病毒、水仙黄条病毒进行检测，不仅试剂盒制作方法简便，而且具有快速、准确、灵敏度高、特异性强的优点，可有效应用于口岸进出境水仙上水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的快速检疫，也可用于农业生产上水仙花叶病毒、水仙黄条病毒的检测诊断、疫情监控及预警预报，应用前景广泛。
文档编号C12Q1/68GK102690896SQ20121019510
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年5月16日
发明者林双庆, 沈建国, 蔡伟, 高芳銮 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心