专利名称：松材线虫lamp特异性检测方法
技术领域：
本发明适用于松材线虫检测，属于植物检疫、森林保护领域，与分子检测技术相关。
二.
背景技术：
由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus),危害引起的松树萎蔫病(Pine wooddisease)是林业上特大的毁灭性病害，是国际公认的最重要的植物检疫性有害生物，也是我国对外公布的植物检疫性线虫，仅我国就有15个省、直辖市、自治区的186个县级行政区发生该病害，年均发病面积达10万公顷，造成的直接和间接经济损失高达数百亿元人民币。松材线虫隶 属滑刃目(Aphelenchida Siddiqi, 1980),伞滑刃亚科(Bursarphelenchinae Parmaonov, 1964),伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus Fuchs, 1937)。目前伞滑刃线虫属现有95个种，按形态学特征及遗传亲缘关系可分为14个组和I个未分组线虫。线虫的传统鉴定方法主要其形态学特征并结合雌雄成虫的测计值，需要工作人员丰富的工作经验及掌握大量的文献，尤其是近年来松材线虫近似种数量不断增加，给准确鉴定线虫带来不少困难，而目前具有这类鉴定能力的专家数量不能满足检疫工作及林业保护所需。随着分子生物学技术进步，松材线虫的分子检测技术也越来越多，Guiran等(1985)，胡凯基等(1995)等研究了松材线虫的同工酶的检测方法，蒋丽琴(2006)制备了松材线虫的抗体，这些方法在一定程度上，使得松材线虫鉴定更快，更准确，但需要大量的线虫，不同来源的松材线虫群体存在着差异，导致结果常出现部分偏差。随着PCR(PolymeraseChain Reaction,聚合酶链式反应)技术的推广，PCR-RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism,限制性片段长度多态性)，种特异性PCR，多重PCR (multiplex-PCR),实时荧光PCR，基因芯片技术等大量的基于PCR扩增的松材线虫检测技术不断出现，但是这些基于PCR的检测技术都需要PCR仪，实时荧光PCR仪等昂贵设备，难于用于现场检疫，也难以在一些基层林业管理部门推广。近年 HRCA (Hyper-branched Rolling Cycle Amplification,超分枝滚环扩增技术)(刘倩，2009)等一些基于恒温扩增原理的分子检测技术应用于松材线虫检测中，但因为步骤复杂，也仅在实验室应用中。
三.
发明内容
本发明目的是提供一种松材线虫环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification)快速检测方法。运用环介导等温扩增技术检测松材线虫的方法，能够提高检测效率和检测的准确度，本发明针对松材线虫核糖体DNA的ITS2区8个区域设计I组引物(含6条特异引物)，具有特异性高、快速、检测下限低等优点。检测时间只需20-30分钟。此外，该检测方法简单，所需设备简易，因此还可用于野外检测及一线口岸现场检疫。四.技术方案
(I)松材线虫DNA提取:取线虫，置于PCR管中，液氮放置2分钟，加入Iml蛋白酶K (lmg/ml), 65°C 15分钟，95°C以上水处理10分钟，所得即为线虫DNA提取液；(2)松材线虫LAMP检测特异引物:Bx-1F3:5/ -GCAGAAACGCCGACTTGT-3'Bx-1B3:5/ -GCGCCGTTGAAACAACATC-3'Bx-1FIP:5' -CCGCGTAAAACAGATGGTGCCTAGTTTCTGCACGTTGTGACA-3'Bx-1BIP:5' -TCTACGCACTGTTTGTCCGTGCACCAAACGGTTTAGCCGC-3/Bx-1LPF:5/ -TTGCGCGAACAATGCGA-3'Bx-1LPR:5/ -CTTCGTGCTCGATTGTCGT-3;；(3)松材线虫浊度观察检测反应体系:PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20 μ 1:
DNA提取液I μ
2x反应缓冲液10 μ
Bx-1F35 pmol
Bx-1B35 pmol
Bx-1FIP40 pmol
Bx-1BIP40 pmol
Bx-1LPF20 pmol
Bx-1LPR20 pmol
As'/DNA 聚合綠 1.0 μ ;(4)松材线虫荧光观察检测反应体系:
PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20 μ 1:DNA提取液2 μ
2χ反应缓冲液ΙΟμΙ
Bx-1 F35 pmol
Bx-1B35 pmol
Bx-1FIP40 pmol
Bx-1BIP40 pmol
Bx-1 LPF20 pmol
Bx-1LPR20 pmol
Λ7 DNA 聚合酶1.0 μ
4弓黄绿素1.0 μ ;(5 )松材线虫LAMP检测反应程序65 °C条件下，反应30分钟后，观察反应管中反应液浊度或颜色。(6 )松材线虫LAMP检测结果判定松材线虫浊度观察检测反应体系反应30分钟后，观察反应管中反应液浊度，其中反应液出现浑浊，为阳性扩增，该样品检测松材线虫结果为阳性，对照阴性为澄清，无浑浊(见图1)。松材线虫荧光观察检测反应体系反应30分钟后，观察反应管中反应液颜色变化，其中反应液为绿色，为阳性扩增，该样品检测松材线虫结果为阳性，对照阴性为橙红色(见图2)。
五.
图1为松材线虫浊度观察检测反应:1，2:松材线虫检测样，3:拟松材线虫检测结果，4:空白对照。图2为松材线虫荧光观察检测反应:1，2:松材线虫检测样，3:拟松材线虫检测结
果，4:空白对照。
六.
具体实施例方式(I)测试样本DNA提取:搜集自国内外不同地区来源的由中国检验检疫科学研究院植物线虫检疫实验室保存的松材线虫 11 个群体(B101，B102, B104, B105, B108, B109, Bill, B112, B115, B116,B17K)，其他线虫群体 12 个(B201，Bm2, B302, B401, B501, B601, B701, B801, B901, BxxOl,Ahb, D34, Rsl),以及灰葡萄孢菌株I份，健康黑松样品I份，松墨天牛I份。线虫DNA提取:线虫置于PCR管中，液氮放置2分钟，加入Iml蛋白酶K( lmg/ml)，65°C 15分钟，95°C以上水处理10分钟，所得即为线虫DNA提取液；灰葡萄孢及黑松使用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA。
松墨天牛DNA提取按Qiagen公司DNEasy Blood and Tissue Kit方法提取。(2)松材线虫LAMP检测特异引物:下列引物由Invitrogen生物技术公司(北京)合成。Bx-1F3:5/ -GCAGAAACGCCGACTTGT-3'Bx-1B3:5/ -GCGCCGTTGAAACAACATC-3' Bx-1FIP:5' -CCGCGTAAAACAGATGGTGCCTAGTTTCTGCACGTTGTGACA-3'Bx-1BIP:5/ -TCTACGCACTGTTTGTCCGTGCACCAAACGGTTTAGCCGC-3'Bx-1LPF:5/ -TTGCGCGAACAATGCGA-3'Bx-1LPR:5/ -CTTCGTGCTCGATTGTCGT-3'上述引物均根据反应体系需要用灭菌去离子水溶解成适宜浓度。(3)松材线虫浊度观察检测反应体系:PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20 μ 1:
DNA提取液2 μ
2X反应缓冲液10 μ
Bx-1F35 pmol
Bx-1B3SpmoI
Bx-1FIP40 pmol
Bx-1BIP40 pmol
Bx-1LPF20 pmol
Bx-1LPR20 pmol
Av/DNA 聚合酶1.0 μ 其中2X反应缓冲液的成分为:`
Tris-HCI (pH8.8) 40mM
KCl20 mM
MgSOsJ16mM
(NH4)2SO420mM
Tween-200.2%
Betaine1.6M
dNTPs2.8 mM eack(4)松材线虫荧光观察检测反应体系:PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20 μ 1:2x反应缓冲液IO μ
Bx-1F35 pmol
Bx-1B35 pmol
Be-1FIP40 pmol
Bx-1BIP40 pmol
Bx-1LPF20 pmol
Bx-1LPR20 pmol
ΛΜ DNA 聚合酶1.0 μ
钙黃绿素LO μ 其中2XReaction buffer 的成分如(3)。(5 )松材线虫LAMP检测反应程序:按照上述体系混好，于65°C条件下，温育30分钟。(6 )松材线虫LAMP检测结果判定:
松材线虫浊度观察检测反应体系反应30分钟后，观察反应管中反应液浊度，其中反应液出现浑浊，为阳性扩增，该样品检测松材线虫结果为阳性，对照阴性为澄清，无浑浊(见图1)。松材线虫荧光观察检测反应体系反应30分钟后,观察反应管中反应液颜色变化，其中反应液为绿色，为阳性扩增，该样品检测松材线虫结果为阳性，对照阴性为橙红色(见图2)。
权利要求
1.一组松材线虫LAMP检测用特异引物，其特征在于，其核苷酸序列为:Bx-1F3:5/ -GCAGAAACGCCGACTTGT-3'Bx-1B3:5/ -GCGCCGTTGAAACAACATC-3'Bx-1FIP:5/ -CCGCGTAAAACAGATGGTGCCTAGTTTCTGCACGTTGTGACA-3'Bx-1BIP:5/ -TCTACGCACTGTTTGTCCGTGCACCAAACGGTTTAGCCGC-3/Bx-1LPF:5/ -TTGCGCGAACAATGCGA-3' Bx-1LPR:5/ -CTTCGTGCTCGATTGTCGT-3;。
2.一种检测松材线虫的浊度观察检测方法:其特征在于，其以总DNA为模板，利用权利要求I所述的引物组合进行LAMP扩增，反应30分钟后观察反应液颜色变化。
3.—种检测松材线虫的荧光观察检测方法:其以总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行LAMP扩增，反应30分钟后观察反应液颜色变化。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述松材线虫浊度观察检测方法检测30分钟后，阳性检测结果为反应液为浑浊，而阴性结果为澄清。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述松材线虫荧光观察检测方法检测30分钟后，阳性检测结果为反应液为绿色，而阴性结果为橙红色。
6.一种试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1所述的引物。
全文摘要
本发明涉及松材线虫检测，属于植物检疫、森林保护领域。本发明根据松材线虫及其近似种核酸序列差异，选取了松材线虫与其近似种线虫8个特异区域，设计了1组特异引物(6条)。同时，本发明提供了一组检测松材线虫的LAMP引物序列，还进一步提供了检测松材线虫的检测方法。本发明的引物特异性强，灵敏度高，检测方法快速简单，准确性高，为进境木质包装松材线虫检疫及松材线虫萎蔫病罹病松木监测提供了有效的技术保证。
文档编号C12N15/11GK103173530SQ20121019490
公开日2013年6月26日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者葛建军, 熊玉芬, 王旭 申请人:中国检验检疫科学研究院