一种高效转糖基β－半乳糖苷酶基因的制作方法

专利名称：一种高效转糖基β－半乳糖苷酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种β-半乳糖苷酶基因，尤其涉及一种高效转糖基β-半乳糖苷酶基因及其所述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用。
背景技术：
低聚糖是哺乳动物细胞表面糖蛋白和糖脂以及微生物来源的生理活性物质的要素之一，具有强大的生物信息传递等功能。因而，低聚糖用于药物修饰、低聚糖的结构分析以及低聚糖合成技术的发展就引起了人们的极大关注。低聚糖作为一种疗法虽然被科学家公认具有相当大的潜能，但是至今其重要的作用还是没有得到充分的体现。其发展缓慢的原因之一是合成足够于临床使用量的低聚糖非常困难。糖类化合物上多个可反应的羟基使特异性糖苷键的化学法合成步骤繁琐，不适合大规模生产。酶法催化合成低聚糖凭借其简单的步骤、特异的区域选择性和立体选择性，正在成为低聚糖和糖缀合物合成的主流。
有两类酶用于催化糖苷键的合成糖基转移酶和糖苷酶。糖基转移酶已经用于生产某些低聚糖，但酶的较难获得和核苷底物的高成本限制了其广泛应用。而糖苷酶催化的低聚糖及糖苷合成反应途径简单，不需要其它辅助因子，底物通常为价格便宜的单糖和双糖。酶较易获得，性质稳定。但是，糖苷酶所进行的合成反应中，转糖基新生成的低聚糖及糖苷也可以重新被酶作为底物水解，反应处于水解和合成的动态平衡状态，导致转糖基产物的产量一般较低。为了打破这个平衡，科学家进行了不懈的努力。利用酶反应的热力学及动力学原理加大底物浓度、提高反应温度等可以在一定程度上提高糖苷产物的产量(10-40％)；采用高浓度有机溶剂(80-90％，v/v)或两相反应体系，降低水的浓度和活性，促使反应平衡向糖苷合成的方向进行，进一步提高了糖苷产物的产量(40-60％)。但是反应体系中水的有效浓度的维持和低水环境下水的高活性都在一定程度上限制了产物的产量及这些方法的最终应用。
近年来，分子生物学技术的发展和进步大大推动了糖苷酶合成低聚糖领域的研究。1998年，科学家对糖苷酶进行分子改造，在酶催化中心用非亲核氨基酸残基取代亲核催化氨基酸残基，产生了一类新型活性酶，只催化合成反应，因此命名为糖苷合成酶(Glycosynthases)。糖苷合成酶的出现，彻底解决了产物被水解的问题，从根本上提高了糖苷酶的转糖基效率(转糖基效率可达90％以上)。到目前为止，国际上发展的糖苷合成酶共有13种，来源于11种不同的微生物及植物，分别由β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-甘露聚糖苷酶、α-葡萄糖苷酶等改造获得。目前低聚糖合成领域研究的热点就是寻找不同来源的高效转糖基糖苷酶，并获得酶基因，以便在此基础上进行基因改造获得糖苷合成酶。
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一类重要的糖苷水解酶，其水解活性早已为人们熟知和利用，其转糖基活性直到80年代才引起重视，被用于合成低聚半乳糖和半乳糖苷化合物。低聚半乳糖是母乳中的天然组分之一，其最重要最根本的生理功能源于它对双歧杆菌的增殖作用，具有很好的热稳定性和耐酸性，广泛应用于食品制造业和医药行业。目前，低聚半乳糖的工业生产主要通过微生物酶法合成，即通过β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成。我国低聚半乳糖的开发研究还处于起始阶段，自主的微生物酶法工业生产尚属空白，乳品工业中使用的乳糖酶全部依赖进口。因此，获得高效转糖基β-半乳糖苷酶对低聚糖合成及乳品工业的自主发展具有非常重要的意义。然而，转糖基β-半乳糖苷酶遵循构型保持糖苷酶的作用机制，催化可逆反应，产物产率受到一定限制，所以在合成半乳糖苷化合物时存在局限性。这就需要进一步研究酶基因，为分子改造提供基础，以获得β-半乳糖苷合成酶，从根本上提高合成效率。
目前，国外β-半乳糖苷合成酶的研究还只局限于大肠杆菌，该酶特异合成β-1，6键。国内β-半乳糖苷合成酶研究还是空白，细菌转糖基β-半乳糖苷酶基因的研究未见报道。由于不同来源的糖苷酶区域选择性不同，所以寻求不同来源的高效转糖基β-半乳糖苷酶基因，可以为糖苷酶的分子改造提供新的酶源，对高效合成不同键型的半乳糖苷化合物有着重要意义。
经检索，目前国际上没有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)转糖基β-半乳糖苷酶基因的报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种新的高效转糖基β-半乳糖苷酶基因，为β-半乳糖苷合成酶的获得提供新的酶源，并填补国内细菌转糖基β-半乳糖苷酶基因研究的空白。
本发明所涉及的转糖基β-半乳糖苷酶基因来源于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401，特征如下(1)具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全长3090碱基；(2)由于遗传密码的简并性，具有不同于SEQ ID No.1所示核苷酸序列但与SEQID No.1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；(3)该基因编码1029个氨基酸，序列如SEQ ID No.1所示；上述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用，其方法是，将该基因克隆到pET-15b质粒表达载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达重组β-半乳糖苷酶，特征如下(1)上述基因在大肠杆菌中表达的重组酶为四亚基蛋白，聚合体分子量为391kD，单亚基分子量为97.8kD；酶对乳糖的Km值为0.32mmol/L，Vmax为210.70μmol/(L·min)；酶对邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)的Km值接近于0；酶对ONPG适宜反应的温度为30℃～42℃，适宜反应的pH为6.5～10.6；以pH7.0的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液配制的酶溶液在温度35℃条件下，能稳定保存至少2个小时，在25℃能稳定保存至少2个月；酶于4℃保存时，在pH6.5～10.6范围内至少稳定保存24小时；Hg2+、Cu2+、Ag+强烈抑制酶的活性，Co2+、Mg2+、Mn2+、DTT、EDTA、咪唑对酶活性没有抑制作用；(2)上述基因在大肠杆菌中表达的重组酶在水解乳糖的反应体系中具有转糖基活性，反应中有低聚半乳糖生成，含量与日本商品Oligomate 50相当，高达55％左右，并且产物种类有一定差别；酶在以ONPG为糖基供体时，能将半乳糖基转移到多种糖、醇化合物上，如半乳糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、山梨糖、蔗糖、纤维二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇等；其广泛的受糖体底物特异性，可用以合成多种半乳糖苷化合物。
其中，上述重组酶对ONPG的最适反应温度为35℃。
其中，上述重组酶对ONPG的最适反应pH为6.5～9.5。
在上述pH6.5～10.6的缓冲范围中，pH5.5～8.5范围使用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，pH8.7～10.6范围使用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
在上述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用中，将该基因克隆到pET-15b质粒表达载体上，可用于基因改造，即对酶基因进行定点突变，在酶催化中心用非亲核氨基酸残基取代亲核催化氨基酸残基，以获得新的β-半乳糖苷合成酶，彻底去除水解反应，从根本上提高转糖苷效率。


图1为本发明的β-半乳糖苷酶基因表达的重组酶以乳糖为底物的转糖基反应。
其中Lane 1，乳糖与灭活酶液反应；Lane 2,3，乳糖与纯酶反应；Lane 4，Oligomate50。
图2为本发明的β-半乳糖苷酶基因表达的重组酶以ONPG为糖基供体，多种糖、醇化合物为糖基受体的转糖基反应。
图中从左向右显示的糖基受体依次为半乳糖、纤维二糖、肌醇、甘露醇、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、山梨醇、甘露糖。每种受体分子的反应共点4个样，前2个为对照反应在0小时、4小时取样，后2个为转糖基反应在4小时、12小时取样。
图中箭头所示的糖斑点为转糖基生成的半乳糖苷化合物。
具体实施例方式
实施例1 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5基因组DNA的提取将阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401接种于5mLLB培养基中，37℃摇床培养16小时，取1.5mL培养物，12,000转/分离心2分钟，所得沉淀悬于565μL的TE缓冲液中；加入30μL10％(质量体积比)的十二烷基硫酸钠(SDS)和5μL20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时；加入100μL5mol/L NaCl充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育20分钟；然后冰浴30分钟；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v/v)，混匀；12,000转/分离心5分钟，将上清液转入新管中，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀；12,000转/分离心5分钟，将上清转入新管中，加入2倍体积无水乙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来；12,000转/分离心5分钟，DNA沉淀用70％乙醇洗涤2次；真空干燥10分钟，重溶于50μL的TE缓冲液。
上述LB培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 7g/L，pH7.0～7.5，121℃灭菌20分钟；TE缓冲液配方如下10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，调pH为8.0。
CTAB/NaCl溶液配方如下10％(w/v)的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中。
实施例2 E.cloacae B5β-半乳糖苷酶基因的PCR扩增设计引物，引入能插入pET-15b质粒(Novagen)的BamHI酶切位点(pET-15b质粒载体具有N端6His标记，便于表达蛋白的纯化)，序列如下F-B55’-GATCGGATCCGATGCCCAACACTCTATCG-3’R-B55’-GAAGGGATCCTTAAGGGTTCTGCTGCCA-3’以提取的阴沟肠杆菌基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增体系总体积为50μL，含超纯水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl21.5mmol/L，模板DNA100ng，TaKaRa LA Taq 2.5U。PCR扩增条件95℃预变性5分钟；反应28个循环(95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸3分钟)；28个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物约为3.1kb左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，然后回收，所得产物即为E.cloacae B5β-半乳糖苷酶全基因片段。
实施例3 PCR产物的克隆和DNA序列测定将实施例2的PCR回收产物连接到pMD18-T质粒载体上(TA克隆)，转化Escherichia coli Top10感受态细胞，涂布氨苄青霉素平板，用菌落PCR方法筛选重组菌，然后测序，测序由上海博亚生物技术有限公司完成，将测得的序列进行分析，显示有一个开放阅读框架，由3090碱基组成，编码1029个氨基酸，为E.cloacae B5β-半乳糖苷酶全基因序列，如SEQ ID No.1所示。
实施例4 E.cloacae B5β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达将实施例3筛选到的正确重组菌接种于30mL LB氨苄(100μg/mL)培养液，37℃摇床培养，提取重组质粒，加BamHI(TaKaRa)于30℃酶切3小时，进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，回收目的片段，同时采用同样酶切方法处理pET-15b质粒载体，并去磷酸化。将制备好的酶基因片段与pET-15b载体按一定比例混合，采用连接试剂盒(TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0)于16℃连接8小时。然后采用CaCl2转化法转化宿主菌E.coli BL21(DE3)，转化菌液涂布氨苄青霉素平板，37℃过夜培养。提取阳性菌落质粒，BamHI酶切验证，对质粒酶切正确的重组菌进行表达实验，即重组菌经IPTG诱导培养后，离心获得菌细胞，测定菌细胞β-半乳糖苷酶水解活性和转糖基活性，将完全符合要求的重组菌作为菌种保存。同时对正确重组质粒进行测序，测序由上海博亚生物技术有限公司完成，测得的酶基因序列如SEQ ID No.1所示。
上述β-半乳糖苷酶水解活性测定取50mg菌细胞，加2mmol/L的ONPG溶液450μL，40℃反应10分钟，加1mL0.5mol/L的Na2CO3溶液终止反应，12,000转/分离心2分钟，上清液测OD400。酶的活力单位规定以1分钟水解ONPG释放1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)。
上述β-半乳糖苷酶转糖基活性测定方法
取50mg菌细胞，悬浮于50μLpH7.0、50mmol/L的磷酸钾缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。取100μL粗酶液，加入300μLpH7.0磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，于50℃反应4小时，12,000转/分离心5分钟，上清液即含反应产物——低聚半乳糖。
将反应产物进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，确定转糖基活性。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中展层，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色，如果乳糖斑点附近除单糖斑点外生成了新的寡糖斑点，则β-半乳糖苷酶有转糖基活性。
实施例5 E.cloacae B5β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达与纯化将实施例4所保存的E.coli BL21(DE3)重组菌接种于200mL LB氨苄培养液，37℃培养12小时，转接于2L LB氨苄培养液，37℃培养，测定培养液在600nm下的吸光度变化。当吸光值达0.5～0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，再继续培养3～5小时，于12000转/分离心3分钟，获得细胞沉淀，悬浮于80mLpH7.0、50mmol/L的磷酸钾缓冲液。在冰水浴中超声波破碎细胞，破碎液于4℃以12000转/分离心20分钟，所得上清即为粗酶液。
粗酶液用Ni-NTAAgarose(QIAGEN)亲合柱层析除去不带6His标记的杂蛋白，然后用DEAE Sepharose Fast Flow柱层析得到了电泳纯β-半乳糖苷酶。
实施例6 E.cloacae B5重组β-半乳糖苷酶的基本酶学特性(1)酶的分子量酶蛋白分子量的测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。根据样品和标准蛋白的PAGE图，测定样品和标准蛋白的相对迁移值Rf，用标准蛋白的Rf值对分子量的对数作标准曲线。再根据纯酶样品的Rf值，就可求得其分子量。SDS-PAGE采用垂直板式不连续系统电泳方式，电泳分离胶浓度为10％，浓缩胶为4％；Native gradient PAGE(非解离梯度聚丙稀酰胺凝胶电泳)采用5～10％线形梯度垂直板状聚丙烯酰胺凝胶，4℃电泳。
Native gradient PAGE显示酶蛋白的分子量约为391kD，SDS-PAGE显示酶蛋白单亚基分子量约为97.8kD，表明该酶为一个四亚基蛋白。
(2)酶的动力学参数酶的动力学参数的测定采用双倒数法。
将2.5μL纯酶(4.07U/mL)与32.5μL不同浓度(浓度范围0.043～0.34mol/L)的乳糖溶液混合，于50℃反应30分钟，用葡萄糖试剂盒(上海丰汇医学科技有限公司)测定水解的葡萄糖含量，计算水解速率，用双倒数作图法测得酶对乳糖的Km值为0.32mol/L，Vmax为210.70μmol/(L·min)。
将50μL稀释一倍的纯酶与450μL不同浓度的ONPG(浓度范围0.14～1.4mmol/L)混合，于40℃反应3分钟，加1mL0.5mol/L的Na2CO3溶液终止反应，测定OD400，计算水解速率，用双倒数作图法测得酶对ONPG的Km值接近于0，说明该酶对ONPG的亲和力很高。
(3)温度和pH对酶活性的影响在适当的温度范围(25℃～60℃)内，每5℃为一个梯度测定酶在该温度下的相对酶活。结果表明酶适宜反应的温度为30℃～42℃，最适反应温度为35℃。将酶在上述温度梯度下保温2小时后测定相对酶活。结果表明酶在35℃以下比较稳定，45℃以上失活较快，60℃失去所有的酶活。
用不同pH的缓冲液配制酶反应体系，测定相对酶活，结果表明酶适宜反应的pH范围比较广，为pH6.5～10.6，最适反应pH为6.5～9.5；酶在不同pH的缓冲液中4℃保存24小时，测定相对酶活，结果表明酶在pH6.5～10.6范围内稳定。
将pH7.0磷酸钾缓冲液配制的酶溶液置室温保存，测定酶在室温(25℃)的稳定性，结果表明酶在25℃能稳定保存至少2个月。
上述酶活测定方法为50μL稀释一倍的纯酶与450μL2mmol/L的ONPG溶液混合，于40℃反应10分钟，加1mL0.5mol/L的Na2CO3溶液终止反应，测定OD400。
上述不同pH缓冲液分别为醋酸-醋酸钠缓冲液pH3.6～5.0；磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液pH5.5～8.5；甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH8.7～10.6；碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液pH10.0～11.0。
(4)部分金属离子和化合物对酶活性的影响以ONPG为底物，在酶活测定反应体系中分别加入终浓度为1mmol/L的各种金属离子，10mmol/L的SDS、DTT、EDTA、咪唑，测定相对酶活。结果显示，Hg2+、Cu2+、Ag+强烈抑制酶的活性，Zn2+和SDS对酶也有不同程度的失活作用，Co2+、Mg2+、Mn2+、DTT、EDTA、咪唑对酶活性没有抑制作用。
实施例7 E.cloacae B5重组酶以乳糖为底物的转糖基反应将20μL pH7.0磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，与5μL纯酶于50℃反应4小时，100℃煮沸5分钟灭活酶液，然后进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中展层，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色。如图1，乳糖斑点附近除单糖斑点外生成了新的寡糖斑点，是转糖基生成的低聚糖半乳糖，通过高效液相色谱分析(High Performance LiquidChromatography，HPLC)和薄层扫描分析，其含量与日本商品Oligomate 50相当，高达55％左右，并且种类有一定差别。
上述HPLC分析所用设备及条件岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A示差检测器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流动相为三蒸水，流速为0.2mL/min，柱温80℃；结果分析软件为Class-VP6.0。样品用0.2μm滤膜过滤后，稀释成5％(w/v)的糖溶液，进样分析。
上述薄层扫描分析所用设备及条件岛津(SHIMADZU)CS-9301双波长飞点薄层扫描仪，检测波长为550nm。对上述薄层层析板进行扫描分析。
实施例8 E.cloacae B5重组酶广泛的受糖体底物特异性重组酶具有广泛的受糖体底物特异性，能以ONPG为糖基供体，将半乳糖基转移到多种糖、醇化合物上，如半乳糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、山梨糖、山梨醇、肌醇、甘露醇等。
20μL 50mmol/L pH7.0磷酸钾缓冲液配制的100mmol/L糖或醇受体溶液、5μL100mmol/L ONPG和5μL纯酶，于50℃进行反应，分别在4小时、12小时取样。同时做对照实验，不加糖基供体ONPG，0小时、4小时取样。然后进行TLC分析，如图2所示，ONPG为糖基供体时，原有的糖受体(醇因不能显色除外)和水解产生的半乳糖斑点以下出现了新的糖斑点，是转糖基生成的半乳糖苷化合物，反应时间越长，产物生成量越大。在对照实验中，未生成新的糖斑点，说明上述受体分子不能在酶的作用下发生自转。重组酶广泛的受糖体底物特性，可用以合成多种半乳糖苷化合物。
序 列 表SEQ ID No.1<110>山东大学<120>一种高效转糖基β-半乳糖苷酶基因<141>2005-9-26<211>3090<212>DNA<213>阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)<221>阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401转糖基β-半乳糖苷酶基因<222>(1)...(3090)<400>
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1.一种高效转糖基β-半乳糖苷酶基因，具有如下特征(1)具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全长3090碱基；(2)由于遗传密码的简并性，具有不同于SEQ ID No.1所示核苷酸序列但与SEQID No.1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；(3)该基因编码1029个氨基酸，序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用，其特征是，将所述基因克隆到pET-15b质粒表达载体上，在大肠杆菌中表达重组β-半乳糖苷酶；其中上述基因在大肠杆菌中表达的重组酶为四亚基蛋白，聚合体分子量为391kD，单亚基分子量为97.8kD；酶对乳糖的Km值为0.32mmol/L，Vmax为210.70μmol/(L·min)；酶对邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)的Km值接近于0；酶对ONPG适宜反应的温度为30～42℃，适宜反应的pH为6.5～10.6；以pH7.0的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液配制的酶溶液在温度35℃条件下，能稳定保存至少2个小时，在25℃能稳定保存至少2个月；酶于4℃保存时，在pH 6.5～10.6范围内至少稳定保存24小时；Hg2+、Cu2+、Ag+强烈抑制酶的活性，Co2+、Mg2+、Mn2+、DTT、EDTA、咪唑对酶活性没有抑制作用；酶在水解乳糖的反应体系中具有转糖基活性，反应中有低聚半乳糖生成，产率达55％；酶在以ONPG为糖基供体时，能将半乳糖基转移到多种糖、醇化合物上。
3.如权利要求2所述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用，其特征是，所述酶对ONPG的最适反应温度为35℃。
4.如权利要求2所述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用，其特征是，所述酶对ONPG的最适反应pH为6.5～9.5。
5.如权利要求2或4所述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用，其特征是，在所述pH 6.5～10.6的缓冲范围中，pH5.5～8.5范围使用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，pH8.7～10.6范围使用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
6.如权利要求2所述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用，其特征是，所述糖、醇化合物是指半乳糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、山梨糖、蔗糖、纤维二糖、山梨醇、肌醇、甘露醇。
7.如权利要求2或6所述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用，其特征是，所述酶具有广泛的受糖体底物特异性，经酶将半乳糖基转移到所述糖、醇化合物上，可用以合成多种半乳糖苷化合物。
8.权利要求1所述高效转糖基β-半乳糖苷酶基因的应用，其特征是，将所述基因克隆到pET-15b质粒表达载体上，可用于基因改造，即对酶基因进行定点突变，在酶催化中心用非亲核氨基酸残基取代亲核催化氨基酸残基，以获得新的β-半乳糖苷合成酶。
全文摘要
本发明公开了一种高效转糖基β－半乳糖苷酶基因，所述基因由阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401基因组DNA借助PCR扩增获得。该基因核苷酸序列全长3090碱基，编码1029个氨基酸。由该基因表达的重组酶特征为酶为四亚基蛋白，聚合体分子量为391kD，单亚基分子量为97.8kD；酶对乳糖的K
文档编号C12P19/00GK1786170SQ20051004489
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月11日 优先权日2005年10月11日
发明者肖敏, 卢丽丽 申请人:山东大学