反转录反应液及制备cDNA的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体的，本发明设及一种反转录反应液及一种制备 CDNA的方法。
【背景技术】
[0002] 基因表达与调控的分析与检测是现代分子生物学和医学研究领域中的重要课题。 近年来随着基因表达调控分析检测技术的发展，相关的检测技术也越来越多，比如:原位杂 交、Northern杂交、RNA酶保护实验、基因忍片分析、实时定量PCR分析W及反转录PCR分析 (RT-PCR)等。其中的RT-PCR分析由于操作简单，检测mRNA水平灵敏，被认为是检测基因表达 的主要手段之一。RT-PCR是一种将反转录（Reverse Transcription ; RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的检测技术。其中的RT(反转录)反应是RT-PCR技术的关键，它是WmRNA为模板，在反转录酶的作用下合成与模板mRNA互补的DNA即 cDNA的过程。
[0003] CDNA的合成和克隆技术已经成为当今分子生物学研究的重要手段。合成CDNA第一 链的方法离不开依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶）的作用。目前非常常用且已经商品化的反 转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶和鼠白血病病毒(匪LV)反转录酶运两种。通常 情况下，RT反应过程由3个步骤组成:首先通过高溫将RNA模板的二级结构打开;其次通过反 转录酶催化反转录反应;最后通过高溫对反转录酶进行灭活，W保证后续PCR过程的顺利进 行。
[0004] 然而，如何进一步提高CDNA的合成效率仍有待进一步开发。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0006] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0007] 反转录常规的操作流程需要3个不同的反应溫度，且反应体系配制过程复杂，容易 出错，另外，整个操作过程需要近2个小时的操作和反应时间，耗时费力。所W，常规的反转 录反应，不但会给实验操作者带来不便，而且越来越不能满足基因分析的高速、高通量的需 求。
[0008] 目前一些商品化试剂盒中不乏反应快速和操作简便的产品，但是反应效果一般， 重复性不好，很难得到推广。
[0009] 基于上述问题，在本发明中，发明人提出了一种操作简便，反应快速的反转录反应 液，W此反转录反应液对RNA样品进行反转录处理所需时间仅为15分钟，反转录反应效果 佳，重复性好。
[0010] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种反转录反应液。根据本发明的实施例，所 述反转录反应液包括:0.1~0.3摩尔/升=径甲基氨基甲烧;30~50毫摩尔/升硫酸锭;6~ 10毫摩尔/升氯化儀;0.2~0.4摩尔/升氯化钢;2~4毫摩尔/升二硫苏糖醇；100~300毫摩 尔/升海藻糖;O. OOl %~0.005 % (质量体积比）明胶；I~3毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸;脱 氧核巧立憐酸各1~3毫摩尔/升;5~20微摩尔/升的Oligo-化5引物；10~30微摩尔/升的随 机引物;25~75个单位/微升的鼠白血病病毒(匪LV)反转录酶;1.5~2.1个单位/微升的RNA 酶抑制剂;0.5%~1% (体积比）甘油；W及余量的水。根据本发明的实施例，利用本发明所 提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性 局。
[0011]根据本发明的实施例，上述反转录反应液还可W具有下列附加技术特征之一：
[001 ^ 根据本发明的实施例，所述反转录反应液的抑为8.0~8.8。抑为8.0~8.別寸，MMLV 反转录酶利用RNA模板合成CDNA时活性高、效率高。根据本发明的实施例，优选反转录反应 液的抑为8.3，最大限度的发挥了匪LV反转录酶利用RNA模板合成CDNA的活性，因此，利用本 发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度进一步提高、反应效果和可重复 性进一步提局。
[0013] 根据本发明的实施例，所述氯化钢的用量是0.3摩尔/升，所述硫酸锭的用量是40 毫摩尔/升，所述二硫苏糖醇的用量是3毫摩尔/升，所述乙二醇双四乙酸的用量是1.6毫摩 尔/升，所述明胶的用量是0.002% (质量体积比），所述甘油的用量是1%(体积比）。在上述 氯化钢、硫酸锭、二硫苏糖醇、乙二醇双四乙酸、明胶和甘油的用量下，利用本发明实施例的 反转录反应液进行反转录，反转录反应速度、反应效果和可重复性的到更进一步显著提高。
[0014] 在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的反转录反应液在RNA样本的反转 录处理中的用途。根据本发明的实施例，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反 转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。
[0015] 在本发明的第S方面，本发明提出了一种制备CDNA的方法。根据本发明的实施例， 包括:利用前面所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，W便获得所述cDNA。根据 本发明的实施例，本发明提出的制备CDNA的方法具有和本发明提出的反转录反应液相同的 效果和优点，即本发明提出的反转录反应快速、效果好、可重复性高。
[0016] 根据本发明的实施例，上述制备CDNA的方法还可W具有下列附加技术特征之一：
[0017] 根据本发明的实施例，所述反转录处理是在42摄氏度的条件下进行15分钟。常规 反转录处理所需时间是60~65分钟，本发明所提出的制备CDNA的方法是15分钟，反应快速。
[0018] 根据本发明的实施例，所述反转录处理进一步包括：（1)将所述RNA样品、水和所述 反转录反应液混合，W便获得反应混合物，其中，基于50纳克~2微克的所述RNA样本，所述 反转录反应液的用量为5微升，所述水的用量用于将所述反应混合物的体积调剂至20微升； W及（2)将步骤（1)所得反应混合液进行所述反转录处理，W便获得所述cDNA。根据本发明 的实施例，本发明所提出的制备CDNA的方法具有反应快速、反应效果好、可重复性高的特 点。
[0019] 根据本发明的实施例，所述水是去离子水。去离子水可防止RNase对RNA的降解、防 止水中离子对反应体系的干扰W及避免非特异性产物的生成。因此，反转录处理过程中使 用去离子水进一步提高了本发明提出的制备CDNA方法的稳定性和可重复性。
[0020] 根据本发明的实施例，所述混合是在4摄氏度下进行的。在4摄氏度下进行混合处 理，保证了 RNA样品的稳定和反应体系中反转录酶的稳定。因此，混合处理在4摄氏度下进行 保证了本发明所提出的制备CDNA的方法的稳定性和可靠性进一步提高。
【附图说明】
[0021] 图1是根据本发明实施例1的通过本发明提出的制备cDNA的方法制备的cDNA进行 巧光定量PCR的检测图；
[0022] 图2是根据本发明实施例1的通过常规反转录方法制备的CDNA进行巧光定量PCR的 检测图；W及
[0023] 图3是根据本发明实施例2的通过本发明提出的制备CDNA的方法和常规反转录方 法制备的CDNA分别进行PCR检测，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的电泳结果图。
【具体实施方式】
[0024] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。
[0025] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0026] 反转录常规的操作流程需要3个不同的反应溫度，且反应体系配制过程复杂，整个 操作过程需要近2个小时的操作和反应时间，耗时费力;并且目前一些商品化试剂盒反应效 果一般，重复性不好。
[0027] 基于上述问题，在本发明中，发明人提出了一种操作简便，反应快速的反转录反应 液，W此反转录反应液对RNA样品进行反转录处理所需时间仅为15分钟，反转录反应效果 佳，重复性好。
[00%]反转录反应液
[0029] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种反转录反应液。根据本发明的实施例，所 述反转录反应液包括:0.1~0.3摩尔/升=径甲基氨基甲烧;30~50毫摩尔/升硫酸锭;6~ 10毫摩尔/升氯化儀;0.2~0.4摩尔/升氯化钢;2~4毫摩尔/升二硫苏糖醇；100~300毫摩 尔/升海藻糖;0.0 Ol %~0.005 % (质量体积比）明胶；1~3毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸;脱 氧核巧立憐酸各1~3毫摩尔/升;5~20微摩尔/升的Oligo-化5引物；10~30微摩尔/升的随 机引物;25~75个单位/微升的鼠白血病病毒(匪LV)反转录酶;1.5~2.1个单位/微升的RNA 酶抑制剂;0.5%~1 % (体积比)甘油；W及余量的水。
[0030] 发明人发现，反转录反应液中加入100~300毫摩尔/升海藻糖、0.5%~1 % (体积 比）甘油和0.001%~0.005% (质量体积比）明胶，可W很好地保护反转录酶、RNase抑制剂 和超纯dNTPs的作用，使得反转录反应液在-20°C条件下冻存6个月，且反复冻融30次的情况 下依然具有高活性。同时，发明人惊奇地发现，反转录反应液中加入30~50毫摩尔/升硫酸 锭和0.2~0.4摩尔/升氯化钢，锭根离子和钢离子的配比，保证了反转录引物与模板RNA的 特异且快速的结合。反转录反应液中加入2~4毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)，起到了增加反 转录酶反应速率的作用。最后，发明人惊奇地发现，反转录反应液中加入1~3毫摩尔/升的 乙二醇双四乙酸化GTA)，则起到了对反应液中儀离子进行自动调节的作用，使得反应液中 儀离子的浓度可W在反转录的不同反应阶段时刻保持在最优水平，W促进反转录反应的快 速进行。
[0031] 根据本发明的实施例，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反 应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。
[0032] 根据本发明的实施例，所述反转录反应液的pH为8.0~8.8 dpH为8.0~8.別寸MMLV 反转录酶利用RNA模板合成CDNA时活性高、效率高。根据本发明的实施例，本发明所提出的 反转录反应液的pH为8.3时，最大限度的发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成CDNA的活 性，因此，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应快速、反应效果好、可 重复性高。
[0033] 根据本发明的具体实施例，氯化钢的用量为0.3摩尔/升，硫酸锭的用量为40毫摩 尔/升，二硫苏糖醇的用量为3毫摩尔/升，乙二醇双四乙酸的用量为1.6毫摩尔/升，明胶的 用量为0.002% (质量体积比），甘油的用量为1 % (体积比）。在上述氯化钢、硫酸锭、二硫苏 糖醇、乙二醇双四乙酸、明胶和甘油的用量下，利用本发明实施例的反转录反应液进行反转 录，反转录反应速度、反应效果和可重复性得到更进一步显著提高。
[0034] 制备cDNA的方法
[0035] 在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备CDNA的方法。根据本发明的实施例， 包括:利用前面所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，W便获得所述cDNA。根据 本发明的实施例，所述反转录处理是在42摄氏度的条件下进行15分钟。本发明所提出的制 备cDNA的方法化=步反应为一步反应，将近两个小时的反应时间缩短为15分钟。此方法与 常规方法相比，不但省去了起初的RNA模板的预变性过程和组后的反转录酶变性过程，而且 节省了至少70%的反转录时间。大大节省了实验操作者的操作时间。根据本发明的实施例， 本发明提出的制