引物如沈Q ID NO: 1所示，
[0093] 沈Q ID N0:1 5'-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3'，
[0094] 下游引物如沈Q ID NO :2所示，
[00巧]沈Q ID N0:2 日，-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3，。
[0096] 巧光定量PCR的检测体系为：10微升2 X SuperReal PreMix(含SY服）、0.4微升50 X ROX Reference Dye、l微升内参基因的上游引物巧微摩尔/升）、1微升内参基因的下游引物 (5微摩尔/升）、2微升CDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
[0097] 阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在:将模板CDNA更换为去 离子水。
[0098] 试剂全部加好后，瞬时离屯、，将所有试剂收集到管底。
[0099] cDNA模板为S种不同锭钢离子配伍试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释 得到。浓度为:1〇纳克/微升。
[0100] 本实施例中巧光定量PCR实验使用ABI 750(Fast定量PCR仪进行。具体的巧光定量 PCR的反应程序如下：
[0101] 预变性条件为:95摄氏度15分钟;PCR循环程序为:95摄氏度10秒，60摄氏度30秒， 循环40次;最后将反应体系冷却至室溫(25摄氏度）。
[0102] S、检测结果：
[0103] S种不同锭、钢离子配方的反转录反应液制备的CDNA进行巧光定量PCR检测，具体 的CT值(每个反应管内的巧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表3所示：
[0104] 表3 「rn AC 1
[0106] 阴性对照的CT值为37.96。
[0107] 通过上表数据可知，5号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定4 X反转录反应液的 最适锭、钢离子配方为:40毫摩尔/升硫酸锭【(NH4)2S化】和0.3摩尔/升氯化钢(NaCl)。
[010引实施例3
[0109] 利用四种不同反转录促进剂(DTT/EGTA)添加量的4X反转录反应液进行人类RNA 的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定4 X反转录反应液的最适反转录促进剂添加 量。
[0110] -、人RNA的反转录：
[0111] 1、在冰上进行如下操作:在200微升的离屯、管中配制反转录反应体系，加入的组分 包括:4X反转录反应液(5微升）、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
[0112] 其中不同反转录促进剂添加量的4X反转录反应液中除DTT和EGTAW外的配方相 同，具体为:0.2摩尔/升；径甲基氨基甲烧(Tris)、40毫摩尔/升硫酸锭【(NH4)2S04】、8毫摩 尔/升氯化儀(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钢(化Cl)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002%明胶、4种 超纯脱氧核巧S憐酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Ol igo-dTis引物、20微摩尔/升 的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制 剂(RNasin)、l%甘油、调节反转录反应液的pH值为8.3,并最终用去离子水定容至1毫升。而 不同反转录促进剂的添加量如表4所示：
[011引 表4
[0114]
[0115] 2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离屯、，并将上述反应液于42度下解育 15分钟。此时反转录反应完成。将得到的CDNA置于冰上备用。
[0116] 3、将上述所得人cDNA进行巧光定量检测。
[0117]二、对反转录所得cDNA进行巧光定量检测：
[0118] 对通过上述四种不同试剂所获得CNDA分别进行巧光定量检测。
[0119] W实施例2中四种反转录试剂反转录得到的CDNA为模板，分别用相同的内参基因 的引物进行检巧U，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技（北京）有限公司的SwerReal PreMix(SYBR Green)巧光定量检测试剂盒。
[0120] 其中内参基因（扩增片段大小12化P)引物序列为：
[0121] 上游引物如沈Q ID NO: 1所示，
[0122] SEQ ID N0:1 5'-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3'，
[0123] 下游引物如沈Q ID NO:2所示，
[0124] 沈Q ID N0:2 日'-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3'。
[01巧]巧光定量PCR的检测体系为：10微升2 X SuperReal PreMix(含SY服）、0.4微升50 X ROX Reference Dye、l微升内参基因的上游引物巧微摩尔/升）、1微升内参基因的下游引物 (5微摩尔/升）、2微升CDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
[0126] 阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在:将模板CDNA更换为去 离子水。
[0127] 试剂全部加好后，瞬时离屯、，将所有试剂收集到管底。
[01%] CDNA模板为四种不同反转录促进剂添加量试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子 水稀释得到。浓度为:10纳克/微升。
[0129] 本实施例中巧光定量PCR实验使用ABI 750(Fast定量PCR仪进行。具体的巧光定量 PCR的反应程序如下：
[0130] 预变性条件为:95摄氏度15分钟;PCR循环程序为:95摄氏度10秒，60摄氏度30秒， 循环40次;最后将反应体系冷却至室溫(25摄氏度）。
[01川立、检测结果：
[0132] 四种不同反转录促进剂添加量试剂制备的CDNA进行巧光定量PCR检测，具体的CT 值(每个反应管内的巧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表5所示：
[0133] 表5 「A^O >1 1
[01巧]阴性对照的CT值为38.66。
[0136] 通过上表数据可知，10号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定4 X反转录反应液 中添加反转录促进剂是有作用的且最适添加量为:3毫摩尔/升二硫苏糖醇化TT)和1.6毫摩 尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基酸）四乙酸化GTA)。
[0137] 实施例4
[0138] 对两种添加与不添加稳定剂(海藻糖/明胶/甘油）的4X反转录反应液进行反复冻 融30次处理及-20°C冻存6个月处理，并进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测 来验证有无稳定剂对4 X反转录反应液稳定性的影响。
[0139] -、人RNA的反转录：
[0140] 1、在冰上进行如下操作:在200微升的离屯、管中配制反转录反应体系，加入的组分 包括:4X反转录反应液(5微升）、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
[0141] 其中两种是否添加稳定剂的4X反转录反应液中除稳定剂W外的配方相同，具体 为:0.2摩尔/升S径甲基氨基甲烧(化13)、40毫摩尔/升硫酸锭【(畑4佔〇4】、8毫摩尔/升氯 化儀(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钢(化Cl)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、1.6毫摩尔/升的乙 二醇双(2-氨基乙基酸）四乙酸化GTA)、4种超纯脱氧核巧S憐酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10 微摩尔/升的Oligo-化5引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升 LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、调节反转录反应液的pH值为8.3，并 最终用去离子水定容至1毫升。而稳定剂的加入与否及加入量如表6所示：
[0142] 表6
[0143]
[0144] 另外，对两种添加与不添加稳定剂的4X反转录反应液的稳定性检测处理如表7所 示：
[0145] 表7 [01461
[0147] 2、将步骤1的6种反转录反应体系彻底混匀，简短离屯、，并将上述反应液于42度下 解育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的CDNA置于冰上备用。
[0148] 3、将上述所得人CDNA进行巧光定量检测。
[0149] 二、对反转录所得CDNA进行巧光定量检测：
[0150] 对通过上述巧巾不同试剂所获得CNDA分别进行巧光定量检测。
[0151] W实施例2中6种反转录反应液反转录得到的CDNA为模板，分别用相同的内参基因 的引物进行检巧U，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技（北京）有限公司的SwerReal PreMix(SYBR Green)巧光定量检测试剂盒。
[0152] 其中内参基因（扩增片段大小12化P)引物序列为：
[0153] 上游引物如沈Q ID NO: 1所示，
[0154] 沈Q ID N0:1 5'-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3'，
[0155] 下游引物如沈Q ID NO :2所示，
[0156] 沈Q ID N0:2 日'-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3'。
[0157] 巧光定量PCR的检测体系为：10微升2 X SuperReal PreMix(含SY服）、0.4微升50 X ROX Reference Dye、l微升内参基因的上游引物巧微摩尔/升）、1微升内参基因的下游引物 (5微摩尔/升）、2微升CDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
[0158] 阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在:将模板CDNA更换为去 离子水。
[0159] 试剂全部加好后，瞬时离屯、，将所有试剂收集到管底。
[0160] CDNA模板为6种不同处理试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度 为:10纳克/微升。
[0161] 本实施例中巧光定量PCR实验使用ABI 750(Fast定量PCR仪进行。具体的巧光定量 PCR的反应程序如下：
[0162] 预变性条件为:95摄氏度15分钟;PCR循环程序为:95摄氏度10秒，60摄氏度30秒， 循环40次;最后将反应体系冷却至室溫(25摄氏度）。
[0163] S、检测结果：
[0164] 6种不同处理试剂制备的CDNA进行巧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内 的巧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表8所示：
[01化]表8 [0166]
[0167] 阴性对照的CT值为38.66。
[0168] 通过上表数据可知，11号试剂经稳定性检测处理后，反转录效果与未处理相比下 降很大；而12号试剂处理与否其反转录效果基本不变。因此，通过本实施例可知，对于本发 明所述4 X反转录反应液而言，添加稳定剂是必须的，且稳定剂的最适添加量为：100毫摩 尔/升海藻糖、0.002 % (质量体积比）的明胶和1 % (体积体积比）的甘油。
[0169] 实施例5
[0170] 分别用本发明方法与常规反转录方法进行人RNA的反转录，然后对反转录所得 cDNA进行巧光定量检测。
[0171] -、人RNA反转录：
[0172] 1、本发明方法进行人RNA的反转录：
[0173] (1)在冰上进行如下操作:在200微升的离屯、管中配制反转录反应体系