褐色橘蚜基因功能验证的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及昆虫的生长发育调控和基因工程领域，特别涉及一种褐色橘蚜基因功 能验证的方法。
【背景技术】
[0002] 褐色橘姐(Toxoptera citricida)是一种世界性的柑橘害虫，同时是柑橘衰退病 病毒的主要传播媒介，对柑橘产量和品质影响较大，目前化学防治仍是控制褐色橘蚜的重 要措施。化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗药性。
[0003] RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指 在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是 通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定 基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。同时，在农业害虫基 因功能的研究中，通过微量注射以及饲喂含有dsRNA的人工饲料是目前用于导入dsRNA最主 要的两种方法。然而，相比于一般昆虫个体更小的褐色橘蚜，如果想用微量注射的方法导入 dsRNA难度较大，目前还没有对褐色橘蚜导入dsRNA方面的报道。为了满足方便地研究褐色 橘蚜基因功能的需要，特别是为探索新的褐色橘蚜控制的有效方法，需要更好的褐色橘蚜 dsRNA导入的研究。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于克服已有技术的缺陷，提供一种褐色橘蚜基因功 能验证的方法。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] -种褐色橘蚜基因功能验证的方法，包括如下步骤：
[0007] 1)准备目的基因 dsRNA溶液:根据要抑制的目的基因合成相应的dsRNA溶液；
[0008] 2)将步骤1)中的dsRNA溶液导入褐色橘蚜，操作方法包括如下步骤：
[0009] a、取离心管，将离心管的底部剪去使得底部敞口，另取PCR管将管底剪掉使得底部 敞口，将PCR管的管底与离心管管盖的内壁粘在一起，使得PCR管套在离心管内；
[0010] b、在PCR管中注入步骤1)制得的dsRNA溶液，将离心管管底朝上地竖立放置；
[0011] c、取新鲜的柑橘嫩梢，插入PCR管中；
[0012] d、将褐色橘蚜挑入离心管中，用纱网盖住离心管的管底，防止褐色橘蚜逃出离心 管，然后将离心管放入培养箱中培养48_72h。
[0013] 3)培养结束后，收集褐色橘蚜虫体提取RNA，检测步骤1中的目的基因的表达情况。
[0014] 作为优选地，所述的纱网为80目纱网。
[0015] 作为优选地，所述的离心管为50mL离心管，所述的PCR管为250μ1 PCR管;步骤2)中 所述步骤d中，每个离心管中的褐色橘蚜头数为20 - 30头。
[0016] 作为优选地，步骤2)中所述步骤d中，培养箱中的培养条件为25 ± 1°C、湿度75 土 5%、光照：黑暗为 12-14h:10-12h。
[0017] 作为优选地，步骤3)中所述检测目的基因的表达情况的方法为：收集褐色橘蚜虫 体提取RNA，反转录得到相应的cDNA，然后以cDNA为模板利用qRT-PCR技术检测目的基因的 相对表达量验证抑制情况。
[0018] 上述技术方案中，步骤1)中所述目的基因为褐色橘姐ABCG4基因，按照如下步骤制 备该基因的dsRNA溶液：
[0019] 1)提取褐色橘蚜的总RNA，反转录为cDNA，再以该cDNA为模板，利用上下游引物T7-ABCG4-S1和T7-ABCG4-A1进行PCR扩增，所述引物序列为：
[0020] T7-ABCG4-S1：
[0021 ] TAATACGACTCACTATAGGGATGGGAAGTGTTTAACATG；
[0022] T7-ABCG4-A1：
[0023] TAATACGACTCACTATAGGGACATGCCAAATCTATTCCA。
[0024] 2)将步骤1中的PCR产物回收纯化之后作为合成dsRNA的转录模板，合成纯化得到 褐色橘姐ABCG4基因的dsRNA溶液。
[0025]上述技术方案中，步骤1)中所述目的基因为几丁质合成酶基因，按照如下步骤制 备该基因的dsRNA溶液：
[0026] 1)提取褐色橘蚜的总RNA，反转录为cDNA，再以该cDNA为模板，利用上下游引物T7- CHS-S1和T7-CHS-A1进行PCR扩增，所述引物序列为：
[0027] T7-CHS-S1：
[0028] TAATACGACTCACTATAGGGAGACGTAAAAACTGAAGAC；
[0029] T7-CHS-A1：
[0030] TAATACGACTCACTATAGGGCGTCCATGAAAATGTGAGT。
[0031] 2)将步骤1中的PCR产物回收纯化之后作为合成dsRNA的转录模板，合成纯化得到 褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA溶液。
[0032]本发明的有益效果是:本发明方法设计新颖、操作简单、基因沉默效率高，基因干 扰后有明显表型变化，研究应用成本低，解决了褐色橘蚜目前没有有效的dsRNA导入方法的 问题，能够稳定而且有效地对褐色橘蚜进行RNA干扰，通过RNA干扰之后观察其表型，可以对 褐色橘蚜目标基因所预测功能进行验证，探索研究新的害虫控制方法。本发明方法适用范 围广，只需要根据不同目标基因设计特异性引物得到不同基因的dsRNA，均可以通过本发明 方法将相应的dsRNA导入褐色橘蚜，该方法还可广泛应用于与褐色橘蚜个体类似大小的其 他蚜虫。
【附图说明】
[0033]图1为本发明的饲喂dsRNA的装置。
[0034] 图2为褐色橘蚜饲喂ABCG4基因的dsRNA后的ABCG4基因相对表达量，其中GFP表示 对照组，dsABCG4表示实验组。
[0035] 图3为褐色橘蚜饲喂ABCG4基因的dsRNA后表型表现图；其中1为对照组的正常褐色 橘蚜，2为实验组的翅发育不正常的褐色橘蚜。
[0036] 图4为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的CHS基因相对表达量，其中roS表示对照 组，dsTCiCHS表示实验组。
[0037]图5为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的累积蜕皮率，其中PBS表示对照组， dsTCiCHS表示实验组。
[0038] 图6为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的累积死亡率，其中PBS表示对照组， dsTCiCHS表示实验组。
[0039]图7为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后表型表现图；其中1为实验组的不能正常蜕 皮死亡的褐色橘蚜，2为对照组的能够正常蜕皮的褐色橘蚜。
【具体实施方式】
[0040]本发明实施例所用化学试剂来源如下：
[0041 ] RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN公司，德国）
[0042] PrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本）
[0043] 胶回收纯化试剂盒(Takara公司，日本）
[0044] Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0045] Perfect real time RT reagent(Takara公司，日本）
[0046] G〇Taq_?qPCR Master Mix(Promega公司，美国）
[0047] TranscriptAid Enzyme Mix(Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0048] ATP/CTP/GTP/uTP Mix(Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0049] PrimeScriptRT Enzyme Mix I (Thermo fisher Scientific 公司，美国）
[0050] Oligo dT Primer(The;rmo fisher Scientific公司，美国）
[0051] Random 6 mers(Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0052] 实施例一、褐色橘姐ABCG4基因功能验证
[0053]针对褐色橘姐ABCG4基因功能验证的方法，按照如下步骤操作：
[0054] 一、dsRNA 的合成：
[0055] 1)根据转录组数据中的褐色橘姐ABCG4(ABC转运蛋白）基因的cDNA序列（西南大学 昆虫学与害虫控制重点实验室提供），设计含有T7启动子的ABCG4基因特异性引物，合成引 物，上下游引物序列分别为：
[0056] T7-ABCG4-S1：
[0057] TAATACGACTCACTATAGGGATGGGAAGTGTTTAACATG；
[0058] T7-ABCG4-A1：
[0059] TAATACGACTCACTATAGGGACATGCCAAATCTATTCCA。
[0060] 2)利用RNA提取试剂盒RNeasy Plus Micro Kit按照使用说明提取褐色橘蚜的总 RNA，然后利用反转录试剂盒Perfect real time RT reagent按照使用说明将lyg总RNA反 转录成为cDNA，反转录体系为20μ1，其中包括：total RNA ΙμL(约lyg)，5XPrimeScript Buffer 4μ1,PrimeScriptRT Enzyme Mix I ΙμL,Oligo dT Primer(50yM)ΙμL,Random 6 mers(100yM)lyl，RNase Free ddH2〇 12μ1。
[0061 ] 3)对步骤2)得到的cDNA进行PCR扩增，反应条件为：95°C预变性3min;95°C变性 30s、60°C退火10s、72°C延伸2min，共35个循环；72°C条件下延伸10min;PCR反应体系共25μ 1，包括：浓度为lOOOng/μΙ的cDNA模板Ο . 5μ1，浓度为Ο . 15-0.25μΜ的上、下游引物（T7-ABCG4-S1、T7-ABCG4-A1)各lyl，PrimeSTAR Max Premix 12·5μ1 以及去核酸酶水ΙΟμΙ。
[0062] 4)将步骤3)中的PCR产物用胶回收纯化试剂盒按照说明书纯化回收之后作为合成 dsRNA的转录模板，用体外合成RNA试剂盒Transcript Aid T7 High Yield Transcription K i t按照使用说明转录合成并纯化得到褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA溶液，将dsRNA溶液浓度 稀释到200-300ngAU dsRNA合成反应体系为20μ1，其中包括：cDNA模板4μ1 (约lyg)、5 X TranscrptAid Reaction Buffer4yl、浓度为 100mM的ATP/CTP/GTP/MTP Mix 8μ1、 TranscriptAid Enzyme Mix2yl和DEPC-treated water 2μ1;反应条件为：37°C孵育4h。
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