专利名称：氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及-构建方法。
-株氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其
背景技术：
木糖醇为天然的五碳糖醇，是重要的功能性食品添加剂之一。木糖醇的甜度是蔗 糖的1.05倍，热量与蔗糖相当，其代谢不需要胰岛素，可替代蔗糖作为糖尿病患者食用的 甜味剂。木糖醇不被细菌发酵，用在口香糖中作为甜味剂，具有维持口腔酸碱平衡、预防龋 齿的功能。有研究表明，木糖醇可阻止细菌与人体细胞的结合，预防呼吸道感染；木糖醇还 有促进肠道对钙质的吸收，减少骨质流失，维持正常骨密度以及降低肝脏转氨酶等作用。随 着人们对健康重视程度的增加，木糖醇的需求量将会越来越高。目前木糖醇生产方法主要为化学法即采用玉米芯、甘蔗渣等富含聚戊糖(含36 40%的多缩戊糖)的原料，经酸水解成含木糖的糖液，然后经中和、脱色、离子交换、结晶等 复杂的净化过程从水解液中分离纯化出木糖，接着化学加氢使木糖生成木糖醇。化学法制 备木糖醇存在两大共同问题(1)资源和环境污染问题严重。研究表明生产1吨木糖醇，会 产生6吨酸性玉米芯残渣，而处理这些残渣则需要2吨煤。由于环保问题难以解决，2005年， 全球最大的食品添加剂公司_丹尼斯克关闭了一条1万吨/年木糖醇的生产线。(2)原料 价格走高，并存在潜在的原料短缺风险。由于近年来我国玉米芯大量用于生产木糖醇、糠醛 和食用菌，原料问题已经凸现，这样导致木糖醇的生产成本增加。为了解决木糖醇生产中的资源和环境问题，许多人致力于开发一种采用来源广 泛、价格低廉的淀粉或葡萄糖为原料来生产木糖醇。如Onishi和Suzuki报道了一种从 葡萄糖出发制备木糖醇的方法，首先通过高渗酵母D. hansenii将葡萄糖转化为D-阿拉 伯糖醇(D-arabitol, D-ara)，然后在Acetobacter suboxydans的作用下氧化为D-木酮 糖，最后D-木酮糖在酵母C. guilliermondii作用下还原为木糖醇。如日本味之素株式会 社Suzuki等选育到一株将阿拉伯糖醇一步高效生物转化为木糖醇的氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter oxydans)，将木糖醇生物合成路线简化为两菌两步法，第一步利用酵母菌 发酵葡萄糖高效制备D-阿拉伯糖醇，第二步由该菌高效转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇，工 艺路线如下步氧化葡萄糖酸杆菌催化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的合成途径如下 以上这些方法所提及的生产菌中主产物的转化率较低，满足不了工业化生产的要 求。我们也开发了 一种两步法生物转化葡萄糖制备木糖醇的工艺，即第一 步利用Kodamaea ohmeri NH-9发酵葡萄糖高效制备D-阿拉伯糖醇，第二步由 Gluconobacteroxydans NH-IO (CGMCC No. 2709)转化 D-阿拉伯糖醇产木糖醇。在我 们前期工作中发现CGMCC No. 2709中存在两种D-阿拉伯糖醇脱氢酶(D-Arabitol dehydrogenase, ArDH)，即膜结合PQQ-依赖型D-阿拉伯糖醇脱氢酶(Membrane-bound PQQ-dependent D-arabito 1 dehydrogenase, m-ArDH)和可溶性 NADP-依赖型 D-阿拉伯糖醇 脱S酶(SolubleNADP-d印endent D-arabito 1 dehydrogenase, s-ArDH)。由于 s-ArDH 的 存在，在还原过程中，S-ArDH可将D-木酮糖(D-xylulose)还原为D-阿拉伯糖醇，这不仅 影响木糖醇的产率，而且不利于下游产品的分离。此外，该菌中的木糖醇脱氢酶(Xylitol dehydrogenase, XDH)活力相对较低，成为生物法转化葡萄糖产木糖醇工艺的瓶颈。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株高产木糖醇的氧化葡萄糖酸杆菌 基因工程菌。本发明还要解决的技术问题是提供上述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方 法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，该细菌是缺失NADP-阿拉伯糖醇脱氢酶 (s-ArDH)基因的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，以下简称S-ArDH缺失菌。上述s-ArDH缺失菌的构建方法，包括如下步骤(1)引物设计根据 GenBank 公布的 Gluconobacter oxydans 621H 基因 s-ardh 序列为基础设计 两对特异引物，引物如下所示S-ardh L-fwd :5’ ~TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC~3‘ EcoR I，s-ardh L-rev :5，-CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3’ Xho I，s-ardh R-fwd 5' -AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3’ Xho I，s-ardh R-rev :5’ ~ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG~3' EcoR I。s-ardh L-fwd和s-ardh R_rev引物两端加同样的限制性酶切位点EcoR I及保护 碱基。s-ardh L-rev和s-ardh R_fwd引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I，下划线部 分均为酶切位点。(2) s-ardh L、s-ardh R 基因的克隆通过PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，分别扩增s-ardhL 和 s_ardh R 各 800bp 左右序列。s-ardh L基因克隆的方法为采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基 因组DNA为模板，用引物s-ardh L-fwd、s-ardh L-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为 IOXPCRbuffer 5 μ L，Mg2+2 μ L, dNTP 5 μ L，弓丨物 s-ardh L-fwd 禾口 s-ardh L-rev 各 2 μ L， exTaq DNApolymerase 1 μ L，基因组模板1 μ L，力Π ddH20至反应总体积为50 μ L ；PCR程序 为94°C预变性2min ；94°C变性30s, 60. 5°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延长 lOmin，以双蒸水为阴性对照。s-ardh R基因克隆的方法为采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基 因组DNA为模板，用引物s-ardh R-fwd、s-ardh R-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为 IOXPCRbuffer 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 5 μ L，引物 s-ardh R-fwd 禾口 s-ardh R-rev 各 2 μ L， exTaq DNApolymerase 1 μ L，基因组模板1 μ L，力Π ddH20至反应总体积为50 μ L ；PCR程序 为94°C预变性2min ；94°C变性30s，61°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延长 lOmin，以双蒸水为阴性对照。(3)抗性片段Km的获得根据GenBank公布的卡纳霉素抗性基因Km序列，设计一对特异性引物km-fwd和 km-rev,以pET28a(+)质粒为模板扩增Km的完整⑶s，引物如下km-fwd :5，-GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3' Xho I，km-rev :5，-CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3' Xho I，km-fwd和km-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I及保护碱基，下划线部 分均为酶切位点，扩增出900bp左右序列。 Km的获得方法为采用PCR技术，以pET28a⑴质粒为模板，用引物km-fwd、 km-rev 进行 PCR 扩增；PCR 反应条件为10 X PCR buffer 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 5 μ L，引物 km-fwd 禾口 km-rev 各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L,基因组模板 1 μ L，力口 ddH20 至反 应总体积为50 μ L ；PCR程序为:94°C预变性2min ；94°C变性30s，61. 5°C退火30s，72°C延伸 lmin，循环30次；72°C延长lOmin，以双蒸水为阴性对照。将s-ardh L、s-ardh R和Km分别胶回收纯化备用。(4) pMD18-KR 的构建将纯化的s-ardh R和Km片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为1700bp左右的 片段KR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km抗性平板 筛选获得含目标基因的重组质粒PMD18-KR。片段KR的基因克隆方法为采用PCR技术，以s-ardh R和Km片段为模板，用引物 km-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增；PCR反应分两步扩增；第一步体系如下10X PCR buffer 2. 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 2 μ L, s-ardh R 片段 和Km片段各2 μ L，exTaq DNA polymerase 0. 5 μ L,加ddH20至反应总体积为25 μ L ；扩增 程序如下95°C预变性4min ；94°C变性55s，65°C退火40s，72°C延伸lmin，循环5次；72°C 延长2min ；第二步在第一步PCR 产物中加入10 X PCR buffer 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 4yL，3| 物 km_fwd禾口弓I物 s_ardh R_rev各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L，力口 ddH20至反应总体 积为50 μ L ；扩增程序如下:95°C预变性4min ；94°C变性50s，60°C退火40s，72°C延伸lmin,循环30次；72°C延长IOmin。(5)pMD18-LKR 的构建将s-ardh L和KR片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为2500bp左右的片段 LKR,与pMD18-T载体连接，转化至感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km的LB平板筛 选获得含目标基因的重组质粒PMD18-LKR。片段LKR的基因克隆方法为采用PCR技术，以s-ardh L和KR片段为模板，用引 物s-ardh L-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增，PCR反应分两步扩增；第一步体系如下10X PCR buffer 2. 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 2 μ L, s-ardh L 片段 和KR片段各2 μ L，exTaq DNA polymerase 0. 5 μ L,加ddH20至反应总体积为25 μ L ；扩增 程序如下95°C预变性4min ；94°C变性55s，65°C退火40s，72°C延伸lmin，循环5次；72°C 延长2min ；第二步在第一步PCR 产物中加入10 X PCR buffer 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 4yL，弓丨 物 s-ardh L-fwd 禾口弓|物 s-ardh R-rev 各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L，力口 ddH20 至 反应总体积为50 μ L ；扩增程序如下95°C预变性4min ；94°C变性50s，59°C退火40s, 72°C 延伸lmin，循环30次；72°C延长IOmin0(6) s-ardh 基因敲除载体 pSUP202-s_ardh: :Km 的构建将重组质粒pMD18-LKR用EcoR I酶切；载体pSUP202用EcoR I酶切后用CIAP 去磷酸化；将酶切后的LKR片段和去磷酸化后的载体pSUP202用T4连接酶连接，转化至 感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km的LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒 pSUP202-s-ardh::Km。(7) s-ardh 基因敲除突变体 G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18 的获得将含敲除突变载体pSUP202-S-ardh: :Km的Ε. coli JM109作为供体菌用于三亲接 合，受体菌为G. oxydans ；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入G. oxydans,将含 Km基因的目标基因片段整合到G. oxydans的染色体上，通过Cefotaxim^Km来筛选三亲接
口丁 ο三亲接合敲除方法为分别将供体菌E. coli JM109/pSUP202-s-ardh: :Km、帮助菌 JM109/pRK2013接种在加有25 μ g/mL卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌G. oxydans 接种在G-Ara培养15 20h，A660值为0. 6 1. 0时进行接合实验；按受体亲本菌帮助 菌供体菌=3 1 3的菌液体积比收集菌体，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基 上，倒置30°C培养过夜；用G. oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应 的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加 入5 μ g/mL头孢噻肟酸和25 μ g/mL卡纳霉素的G-Ara平板上，培养2 4天，长出接合子 进行PCR验证。一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于该细菌是缺失S-ArDH基因，且在 S-ArDH基因的位置上用XDH基因增强的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，以 下简称XDH基因增强菌。上述XDH基因增强菌的构建方法，包括如下步骤步骤(1) (7)同S-ArDH缺失菌的构建方法；(8)引物设计
根据GenBank公布的Gluconobacter oxydans 621H基因xdh序列为基础设计两 对特异引物，引物如下所示xdh-fwd :5，-AGGCTCGAGTCGAAGAAGTTTAAG-3’ Xho I，xdh-rev :5，-ATTCTCGAGTCAACCGCCAGCAAT-3’ Xho I。xdh-fwd和xdh-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I，下划线部分均为酶 切位点。(9) xdh基因的克隆通过PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，扩增800bp左 右xdh序列。xdh基因克隆的方法为采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组 DNA为模板，用引物xdh-fwd、xdh-rev进行PCR扩增，PCR反应条件为10XPCR buffer 5μ L,Mg2+2y L,dNTP 5 μ L，弓 |物 xdh-fwd禾口 xdh—rev各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L, 基因组模板1 μ L，加ddH20至反应总体积为50 μ L ；PCR程序为94°C预变性2min ；94°C变性 30s, 53. 6°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循环 30 次；72°C延长 lOmin。(10) xdh 基因增强载体 pSUP202_s-ardh: :xdh 的构建将含目标基因的质粒pMD18-xdh用Xho I酶切，胶回收目的片段；载体 pSUP202-s-ardh: :Km用Xho I酶切后用CIAP去磷酸化；将酶切后的目的片段和去磷酸化 后的载体用T4连接酶连接，转化至感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km抗性平板筛 选获得含目标基因的重组质粒pSUP202-s-ardh: :xdh ；(ll)xdh基因增强突变体G. oxydans s-ardh: :xdh NSAX31的获得将含敲除 突变载体pSUP202-s-ardh: xdh的Ε. coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为 G. oxydanss-ardh: :Km mutant NSA18 ；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入 G. oxydansNSA18，将含xdh基因的目标基因片段整合到G. oxydans NSA18的染色体上；通过 Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。三亲接合增强的方法为将供体菌E. coli JM109/pSUP202-s-ardh: :xdh、帮助菌 JM109/pRK2013分别接种在加有100 μ g/mL氨苄青霉素和25 μ g/mL卡纳霉素的LB培养基 中培养过夜，受体菌G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18接种在G-Ara培养 15 20h，A66tl 值为0. 6 1. O时进行接合实验；按受体亲本菌帮助菌供体菌=3:1:3的菌液体积 比收集菌体，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30°C培养过夜；用G. oxydans 具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌 体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入5 μ g/mL头孢噻肟酸的G-Ara平板 上，培养2 4天，长出接合子进行PCR验证。有益效果本发明与现有技术相比具有如下优点1、本发明成功获得s-ardh基因敲除菌株。s-ardh基因敲除载体 pSUP202-s-ardh: :Km在帮助菌pRK2013的帮助下进入CGMCC No. 2709菌体内，通过同源重 组替换掉s-ardh基因，经基因水平筛选和鉴定，成功得到缺失s-ardh基因的G. oxydans菌 株，即G. oxydanss-ardh Km NSA18菌株。该菌株可以阻断D-木酮糖生成D-阿拉伯糖醇的 途径，提高木糖醇产率，进而从根本上解决木糖醇生产过程中D-阿拉伯糖醇伴生的问题。2、本发明成功获得xdh基因增强菌株。xdh基因增强载体pSUP202-s_ardh: :xdh在帮助菌PRK2013的帮助下进入CGMCC No. 2709 NSA18菌体内，通过同源重组替换掉km基 因，经基因水平筛选和鉴定，成功得到xdh增强的CGMCC No. 2709菌株，即CGMCC No. 2709 s-ardh::xdh NSAX31菌株。该菌株可以用于阻断D-木酮糖生成D-阿拉伯糖醇的途径并加 强木糖醇脱氢酶活力，在解决木糖醇生产过程中D-阿拉伯糖醇伴生的问题的同时，极大的 提高了木糖醇产率，进而从根本达到木糖醇产品质量和深度开发的目的。
图1为G. oxydans s-ardh: :Km NSA18菌株构建图谱。基因敲除质粒 pSUP202-s-ardh: :Km与G. oxydans染色体通过同源重组，获得缺失s_ardh基因的 G. oxydans s-ardh: :Km NSA18 染色体。图2为G. oxydans s-ardh: :xdh NSAX31菌株构建图谱。基因敲除质粒 pSUP202-s-ardh: :xdh 与 G. oxydans s-ardh: :Km NSA18 染色体通过同源重组，获得 xdh 基 因增强的 G. oxydans s-ardh: :xdh NSAX31 染色体。图 3 为 CGMCCNo. 2709 基因组 DNA 为模板 PCR 扩增约 800bp 的 s_ardh L 和 s_ardhR 基因。泳道M:DL15000 Marker ；泳道1、2分别为s-ardh L和s-ardh R基因片段。图 4 为以 pET28 (a+)为模板PCR扩增约 900bp 的 Km基因。泳道M DL15000 Marker ； 泳道1为Km基因片段。图5为重叠PCR扩增约1700bp的KR片段。泳道M :DL2000 Marker ；泳道1 :KR基 因片段。图 6 重叠 PCR 扩增约 2500bp 的 LKR 片段。泳道 M :DL2000 Marker ；泳道 1、2 =LKR
基因片段。图 7 为 pSUP202-s-ardh: :Km 的酶切验证图谱。泳道 M :DL15000Marker ；泳道 1、2 分别为 pSUP202-s-ardh: :Km EcoR I 单切和 EcoR I & Xho I 双切。图8为PCR鉴定s-ardh敲除突变体。泳道M :DL2000 Marker ；泳道1为引物 s-ardhL-fwd和km_rev的产物，泳道2为引物km-fwd和km_rev的产物。图9为以CGMCC No. 2709基因组DNA为模板PCR扩增约800bp的xdh基因。泳道 M :DL2000 Marker ；泳道1为xdh基因片段。图 10 为 pSUP202-s-ardh: :xdh 的酶切验证图谱。泳道 M 为 DL15000 Marker ；泳 道 1、2 为 pSUP202-s-ardh: :xdh 质粒 EcoR I 单切。图11为PCR鉴定xdh增强突变体。泳道M为DL15000 Marker ；泳道1为引物 s-ardhL-fwd 和 s-ardh R-rev 的产物；泳道 2 为引物 s-ardh L-fwd 和 xdh_rev 的产物；泳 道3为引物xdh-fwd和s-ardh R-rev的产物。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。以下实施例所使用的氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌 NH-10 (Gluconobacter oxydans NH-10)，其菌种保藏编号 CGMCC No. 2709。实施例1 :NADP-阿拉伯糖醇脱氢酶基因的敲除载体的构建。
(1)获取s-ardh基因上游s-ardh L和下游s-ardh R及Km基因。
以GenBank公布的Gluconobacter oxydans 621H基因s-ardh序列为基础设计两
s-ardh L-fwd 5' -TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC-3‘ EcoR I， s-ardh L-rev :5’ -CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3，Xho I， s-ardh R-fwd 5' -AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3' Xho I， s-ardh R-rev 5' -ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG-3， EcoR I。
对引物
s-ardh L-fwd和s_ardh R_rev引物两端加同样的限制性酶切位点EcoR I及保护 碱基。s-ardh L-rev和s-ardh R_fwd引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I，下划线部 分均为酶切位点。通过PCR技术，以CGMCC No. 2709基因组DNA为模板，以s-ardh L-fwd和 s-ardhL-rev、s-ardh R-fwd和s-ardh R-rev为引物分别扩增得到s-ardh基因5，端上游 和3，端下游s-ardh L和s-ardh R各800bp左右序列。s-ardh L 基因的 PCR 反应条件为10 X PCR buffer 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 5 μ L，弓丨 物 s-ardh L-fwd禾口 s—ardh L_rev各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L，基因组模板 1 μ L， 加ddH20至反应总体积为50 μ L ；PCR反应在PCR仪上进行，PCR程序为94°C预变性2min ； 94°C变性30s，60. 5°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延长lOmin，以双蒸水为阴 性对照。(图3)。s-ardh R 基因的 PCR 反应条件为10 X PCR buffer 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 5 μ L，弓丨 物 s-ardh R-fwd禾口 s-ardh R-rev各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L，基因组模板 1 μ L， 加ddH20至反应总体积为50 μ L ；PCR反应在PCR仪上进行，PCR程序为94°C预变性2min ； 94°C变性30s，61 °C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延长lOmin，以双蒸水为阴性 对照。(图3)。根据GenBank公布的卡纳霉素抗性基因Km序列，设计一对特异性引物km-fwd和 km-rev,以pET28a(+)质粒为模板扩增Km的完整CDs km-fwd :5’ -GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3’ Xho I，km-rev :5，-CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3' Xho I，km-fwd和km-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I及保护碱基，下划线部 分均为酶切位点，扩增出900bp左右序列。采用PCR技术，以pET28a(+)质粒为模板，用引物km-fwd、km-rev进行PCR扩增， PCR 反应条件为10XPCR buffer 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 5 μ L，弓丨物 km-fwd 禾口 km-rev 各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L，基因组模板 1 μ L，力Π ddH20 至反应总体积为 50 μ L ；PCR 反应在PCR仪上进行，PCR程序为94°C预变性2min ；94°C变性30s, 61. 5°C退火30s, 72°C 延伸lmin，循环30次；72°C延长lOmin，以双蒸水为阴性对照(图4)。m s-ardh L-fwd 禾口 s_ardh L-rev > s-ardh R-fwd 禾口 s_ardh R-rev > km-fwd 禾口 km-rev三对引物扩增获得相应大小的目的条带分别胶回收纯化备用。(2)pMD18_KR 的构建。将纯化的s-ardh R和Km片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为1700bp左右的片段KR，即以s-ardh R和Km片段为模板，用引物km-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩 增，PCR反应分两步扩增，第一步体系如下10 X PCR buffer 2. 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP2 μ L, s-ardh R片段和Km片段各2 μ L，exTaq DNA polymerase 0. 5 μ L，加ddH20至反应总体积为 25 μ L0扩增程序如下:95°C预变性4min ；94°C变性55s，65°C退火40s，72°C延伸lmin，循环 5次；72°C延长2min。第二步在第一步反应基础上再加入10XPCR buffer 5μ L,Mg2+2y L, dNTP 4μ L，弓I物 km_fwd 禾口弓I物 s_ardh R_rev 各 2 μ L，exTaq DNA polymerase lyL，力口 ddH20至反应总体积为50 μ L。扩增程序如下95°C预变性4min ；94°C变性50s，60°C退火 40s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延长lOmin。胶回收纯化1700bp KR片段(图5)，取 KR片段 4· 5μ L 与 pMD18-T 0. 5 μ L 和 solution I 5 μ L—同加入一个印 pendorf 管，混勻 后，16°C连接3h，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于含Amp和Km抗性平板上过夜培养， 挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I和Xho I酶切，37°C水浴2h，琼脂糖凝胶 电泳鉴定，可以看到SOObp和900bp条带各一条出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得 重组质粒PMD18-KR。(3)pMDI8-LKR 的构建将s-ardh L和KR片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为2500bp左右的片段 LKR，即以s-ardh L和KR片段为模板，用引物s-ardh L-fwd、s_ardh R-rev进行重叠PCR扩 增，PCR反应分两步扩增，第一步体系如下10 X PCR buffer 2. 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 2 μ L, s-ardh L片段和KR片段各2 μ L，exTaq DNA polymerase 0. 5 μ L，加ddH20至反应总体积为 25 μ L0扩增程序如下:95°C预变性4min ；94°C变性55s，65°C退火40s，72°C延伸lmin，循环 5次；72°C延长2min。第二步在第一步反应基础上再加入10XPCRbuffer 5μ L,Mg2+2y L, dNTP 4 μ L，弓I物 s-ardh L—fwd禾口弓|物 s—ardh R-rev # 2 μ L, exTaqDNA polymerase 1 μ L, 加ddH20至反应总体积为50 μ L。扩增程序如下95°C预变性4min ；94°C变性50s，59°C退火 40s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延长lOmin。胶回收纯化2500bp LKR片段(图6)，取 LKR 片段 4. 5 μ L 与 pMD18-T 0. 5 μ L 和 solution 15 μ L —同加入一个印pendorf 管，混勻 后，16°C连接3h，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于含Amp和Km抗性平板上过夜培养， 挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I单酶切，37°C水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴 定，可以看到2500bp条带出现，将酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重组质粒pMDIS-LKR。(4) S-ardh 基因敲除载体 pSUP202-s_ardh: :Km 的构建将重组质粒pMD18-LKR用EcoR I酶切；载体pSUP202用EcoR I酶切后用碱性磷酸 酶CIAP去磷酸化；分别取LKR片段和载体pSUP202酶切产物各4yL，与T4 DNA连接buffer 和T4 DNA连接酶各IyL同时加入一个印pendorf管，混勻后，16°C连接过夜，转化E. coli JM109感受态细胞，在加有适量Amp和Km平板上挑选重组子，菌体电泳挑选条带滞后菌株， 再通过EcoR I单酶切和EcoR I & Xho I双酶切验证(图7)。酶切结果表明EcoR I单 酶切重组质粒能够切下约2. 5kb大小片段，EcoR I & Xho I双酶切质粒能切下约900bp和 SOObp大小的片段，与预期结果相符，说明已经将LKR片段连接到了 pSUP202载体上，命名为 pSUP202-s-ardh::Km。实施例2 s-ardh基因敲除突变体的获得将含敲除突变载体pSUP202-s_ardh Km的Ε. coli JM109作为供体菌用于 三亲接合，受体菌为CGMCC No.2709。敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入CGMCCNo. 2709，将含Km基因的目标基因片段整合到G.oxydans NH-IO的染色体上。通过 Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。分别将供体菌E. coli JM109/pSUP202-s-ardh: :Km、帮助菌 JM109/pRK2013 接种 在加有卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌G. oxydans接种在G-Ara培养15 20h， A660值为0. 6 1. O时进行接合实验；按受体亲本菌帮助菌供体菌=3 1 3的菌 液体积比收集菌体，即受体亲本菌液1. 5mL，离心收集菌体，倒掉上清，用生理盐水洗两次 后，倒掉液体，加入0. 5mL帮助菌液，离心收集菌体后加入1. 5mL供体菌，离心收集菌体后 用G-Ara洗一次，倒掉液体，在剩下的少量培养基中将细胞用微量移液器混勻，转移到不加 抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30°C培养过夜；用G. oxydans具有的抗性加上重组质 粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体 G-Ara培养基上洗下，涂到加入头孢噻肟酸和卡纳霉素的G-Ara平板上，培养2 4天。挑取能在含Cefotaxime和Km抗性平板上生长的菌落培养，单菌落培养物离心收 集菌体，重悬，加入蛋白酶K，42°C 2h后，煮沸7min，4°C离心收集上清，即为待检测模板，同 时制备 CGMCC No. 2709 的模板上清；用 s-ardh L-fwd 和 km-rev 及 km-fwd 和 km-rev 引物， 分别进行PCR扩增，s-ardh L-fwd和km-rev扩增PCR产物进行测序分析，筛选出重组有Km 基因的CGMCC No. 2709，经基因水平的鉴定，成功获得s-ardh缺失的CGMCC No. 2709菌株， 即 CGMCC No. 2709 s-ardh: :Km mutant NSA18 菌株(图 8)。实施例3 木糖醇脱氢酶增强载体的构建。(1)获取xdh基因以GenBank公布的Gluconobacter oxydans 621H基因xdh序列为基础设计一对 特异引物，引物如下所示xdh-fwd :5，-AGGCTCGAGTCGAAGAAGTTTAAG-3’ Xho I，xdh-rev 5，-ATTCTCGAGTCAACCGCCAGCAAT-3，Xho I。通过PCR技术，以CGMCC No. 2709菌株基因组DNA为模板，以xdh-fwd和xdh-rev 扩增800bp左右xdh序列(图9)。xdh-fwd和xdh-rev引物两端加同样的限制性酶切位点 Xho I，下划线部分均为酶切位点。xdh 基因 PCR 反应条件为10XPCR buffer 5 μ L, Mg2+2 μ L, dNTP 5yL，弓| 物 xdh-fwd 禾口 xdh-rev 各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L,基因组模板 1 μ L，力口 ddH20 至反 应总体积为50 μ L ；PCR反应在PCR仪上进行，PCR程序为94°C预变性2min、94°C变性30s、 53. 6°C退火 30s、72°C延伸 lmin，循环 30 次，72°C延长 lOmin。将xdh胶回收纯化，取 xdh 片段4. 5μ L 与 pMD18-T0. 5 μ L和 solution I 5yL — 同加入一个印pendorf管，混勻后，16°C连接3h，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于含 Amp抗性平板上过夜培养，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用Xho I酶切，37°C水浴 2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到SOObp条带出现，将酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重 组质粒 pMD18-xdh。(2) xdh 基因增强载体 pSUP202-s_ardh: :xdh 的构建。将含目标基因的质粒pMD18-xdh用Xho I酶切，胶回收目的片段；载体 pSUP202-s-ardh: :Km用Xho I酶切后用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化；分别取xdh片段和载 体pSUP202-s-ardh Km酶切产物各4 μ L，与T4 DNA连接buffer和T4 DNA连接酶各1 μ L同时加入一个印pendorf管，混勻后，16°C连接过夜，转化E. coli JM109感受态细胞，分别 用含Amp和Km抗性平板筛选，筛选能在Amp抗性平板生长而不能在Km抗性平板生长的菌 落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I酶切，37°C水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到 2500bp条带出现，将酶切鉴定阳性重组质粒命名为pSUP202-S-ardh: :xdh (图10)。实施例4 :xdh 基因增强突变体 CGMCC No. 2709 s-ardh: :xdh NSAX31 的获得。将含敲除突变载体pSUP202-s_ardh: :xdh的E. coli JM109作为供体菌用于 三亲接合，受体菌为CGMCC No. 2709 s-ardh: :Km mutant NSA18。敲除突变载体在帮助 菌PRK2013的帮助下进入CGMCC No. 2709 NSA18，将含xdh基因的目标基因片段整合到 CGMCCNo. 2709 NSA18的染色体上。通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。将供体菌E. coli JM109/pSUP202-s-ardh: xdh、帮助菌 JM109/pRK2013 分别接 种在加有氨苄青霉素、卡纳霉素LB培养基中培养过夜，受体菌G. oxydans s-ardh: :Km mutantNSA18接种在G-Ara培养15 20h，A66tl值为0. 6 1. O时进行接合实验；按受体亲 本菌帮助菌供体菌=3 1 3的菌液体积比收集菌体，即受体亲本菌液1.5mL，离心 收集菌体，倒掉上清，用生理盐水洗两次后，倒掉液体，加入0. 5mL帮助菌液，离心收集菌体 后加入1. 5mL供体菌，离心收集菌体后用G-Ara洗一次，倒掉液体，在剩下的少量培养基中 将细胞用微量移液器混勻，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30°C培养过夜； 用G. oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜 的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入头孢噻肟酸的G-Ara 平板上，培养2 4天。挑取能在含Cefotaxime抗性平板上生长而不能在含Cefotaxime和Km抗性平 板上生长的菌落培养，单菌落培养物离心收集菌体，重悬，加入蛋白酶K，42°C 2h后，煮沸 7min，4°C离心收集上清，即为待检测模板，同时制备CGMCC No. 2709 s-ardh: Kmmutant NSA18的模板上清；用s-ardh L-fwd和xdh-rev及xdh-fwd和xdh-rev引物，分别进行PCR 扩增，s-ardh L-fwd和xdh-rev扩增PCR产物进行测序分析，经基因水平的鉴定，成功获得 xdh增强的CGMCC No. 2709 s-ardh: :Km mutant NSA18菌株，S卩 CGMCCNo. 2709 s-ardh: :xdh NSAX31 菌株(图 11)。实施例5 s-ardh基因敲除突变体转化D-阿拉伯糖醇产木糖醇。斜面培养基葡萄糖30g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏5g/L，琼脂20g/L。摇瓶培养基葡萄糖30g/L，酵母膏25g/L，牛肉膏5g/L，D-阿拉伯糖醇10g/L, KH2PO4 5g/L。把CGMCC No. 2709 菌株及突变菌株 CGMCC No. 2709 s-ardh: :Km NSA18 在斜面培 养基上30°C培养24h，然后接一环此菌于摇瓶培养基中，30°C培养10h，摇瓶转速200r/min。 将培养24h的菌体于8000r/min离心lOmin，并用IOOmM pH6. 0的磷酸钾缓冲液洗涤两次， 收集细胞。称取Ig离心后的湿细胞加入IOmL 30g/L的D-阿拉伯糖醇溶液中(细胞添加 量按每IOOg细胞转化IL 30g/L的D-阿拉伯糖醇溶液计)，在30°C条件下，220rpm下反应 9h后，加入5%乙醇30°C下静置反应27h，取样测定底物和产物的量。最终CGMCC No. 2709 菌株可获得木糖醇14. 6g/L，木糖醇对D-ara转化率为48. 7 % ；NSA18菌株可获得木糖醇 16. 7g/L，木糖醇对D-ara转化率为55. 7% (表1)。表1 s-ardh基因敲除对催化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的影响 从表1中可以看出，野生型CGMCC No. 2709菌株的转化液在反应终了时，D-阿拉 伯糖醇浓度从9h时的1. Og/L上升至13. 7g/L，而s-ardh基因敲除菌株的转化液在反应终 了时D-阿拉伯糖醇浓度不变，确证筛选到的转化子中s-ardh基因已被破坏和敲除。实施例6 :xdh基因增强突变体转化D-阿拉伯糖醇产木糖醇。把CGMCCNo. 2709菌株及增强菌株CGMCC No. 2709 s-ardh: :xdh NSAX31 在斜面培 养基上30°C培养24h，然后接一环此菌于摇瓶培养基中，30°C培养10h，摇瓶转速200r/min。 将培养24h的菌体于8000r/min离心lOmin，并用IOOmM pH6. 0的磷酸钾缓冲液洗涤两次， 收集细胞。称取Ig离心后的湿细胞加入IOmL 30g/L的D-阿拉伯糖醇溶液中(细胞添加 量按每IOOg细胞转化IL 30g/L的D-阿拉伯糖醇溶液计)，在30°C条件下，220rpm下反应 9h后，加入5%乙醇30°C下静置反应27h，取样测定底物和产物的量。最终NSAX18菌株可 获得木糖醇28. 7g/L，木糖醇对D (表2)。表2 s-ardh基因敲除且xdh基因增强对催化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的影响
Substrate and products g/L
权利要求
一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于该细菌是缺失s-ArDH基因的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。
2.权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于该方法包 括如下步骤(1)引物设计根据GenBank公布的Gluconobacteroxydans 621H基因为基础设计两 对特异引物，引物如下所示s-ardh L-fwd 5' -TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC-3’ EcoR I， s-ardh L~rev :5’ -CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3，Xho I， s-ardh R-fwd 5' -AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3' Xho I， s-ardh R-rev :5’ -ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG-3’ EcoR I ；(2)s-ardh L、s-ardh R 基因的克隆通过 PCR 技术，以 Gluconobacter oxydans 菌株 基因组DNA为模板，分别扩增s-ardh L和s-ardh R各800bp序列；(3)抗性片段Km的获得根据GenBank公布的卡纳霉素抗性基因Km序列，设计一对特 异性引物km-fwd和km-rev，以pET28a(+)质粒为模板扩增Km的完整⑶s，引物如下km-fwd :5’ -GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3’ Xho I， km-rev :5，-CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3’ Xho I， km-fwd和km-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I及保护碱基，下划线部分均 为酶切位点，扩增出900bp序列；(4)pMD 18-KR的构建将s-ardh R和Km片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为 1700bp的片段KR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km 抗性平板筛选获得含目标基因的重组质粒PMD18-KR ；(5)pMD18-LKR的构建将s-ardhL和KR片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为 2500bp的片段LKR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态e. coli JM109中，通过含Amp和Km 的LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pMDIS-LKR ；(6)s-ardh基因敲除载体pSUP202-s-ardh: :Km的构建将重组质粒pMD18_LKR用EcoR I酶切；载体PSUP202用EcoR I酶切后用CIAP去磷酸化；将酶切后的LKR片段和去磷酸化 后的载体PSUP202用T4连接酶连接，转化至感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Krm的 LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pSUP202-S-ardh: :Km ；(7)s-ardh 基因敲除突变体 G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18 的获得将含敲 除突变载体pSUP202-s-ardh: :Km的E. coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为 G. oxydans ；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入G. oxydans，将含Km基因的目标 基因片段整合到G. oxydans的染色体上，通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。
3.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤 (2)中，s-ardh L基因克隆的方法为采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因 组DNA为模板，用引物s-ardh L-fwd、s-ardh L-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为 lOXPCRbuffer 5 u L, Mg2+2 u L, dNTP 5 ii L，弓丨物 s-ardh L-fwd 禾口 s-ardh L-rev 各 2 ii L， exTaq DNApolymerase 1 u L，基因组模板1 P L，力口 ddH20至反应总体积为50 ii L ；PCR程序 为94°C预变性2min ；94°C变性30s, 60. 5°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延长2lOmin ；s-ardh R基因克隆的方法为采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因 组DNA为模板，用引物s-ardh R-fwd、s-ardh R-rev进行PCR扩增 >PCR反应条件为 lOXPCRbuffer 5 u L, Mg2+2 u L, dNTP 5 ii L，引物 s-ardh R-fwd 禾口 s-ardh R-rev 各 2 ii L， exTaq DNApolymerase 1 u L，基因组模板1 P L，力口 ddH20至反应总体积为50 ii L ；PCR程序 为94°C预变性2min ；94°C变性30s，61°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延长 lOmin。
4.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤 (3)中，Km的获得方法为采用PCR技术，以pET28a(+)质粒为模板，用引物km-fwcUkm-rev 进行 PCR 扩增；PCR 反应条件为:10XPCR buffer 5 u L, Mg2+2 u L, dNTP 5 ii L，引物 km-fwd 和km-rev各2 ii L，exTaq DNApolymerase 1 u L,基因组模板1 P L，加ddH20至反应总体积 为 50ii L ；PCR 程序为94°C预变性 2min ；94°C变性 30s, 61. 5°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循 环 30 次；72°C延长 lOmin。
5.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤 ⑷中，片段KR的基因克隆方法为采用PCR技术，以s-ardh R和Km片段为模板，用引物 km-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增；PCR反应分两步扩增；第一步体系如下:10XPCR buffer 2. 5 u L, Mg2+2 u L, dNTP 2 u L, s-ardh R 片段和 Km 片段各2u L, exTaq DNA polymerase 0. 5 u L,加ddH20至反应总体积为25 u L ；扩增程序 如下95°C预变性4min ；94°C变性55s，65°C退火40s，72°C延伸lmin，循环5次；72°C延长 2min ；第二步在第一步PCR产物中加入10XPCR buffer 5 u L, Mg2+2 u L, dNTP 4yL，弓丨物 km_fwd 禾口弓|物 s_ardh R-rev # 2 u L, exTaq DNA polymerase 1 y L，力口 ddH20 至反应总体 积为50ii L ；扩增程序如下:95°C预变性4min ；94°C变性50s，60°C退火40s，72°C延伸lmin, 循环30次；72°C延长lOmin。
6.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤 (5)中，片段LKR的基因克隆方法为采用PCR技术，以s-ardh L和KR片段为模板，用引物 s-ardh L_fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增，PCR反应分两步扩增；第一步体系如下:10XPCR buffer 2. 5 u L, Mg2+2 u L, dNTP 2 u L, s-ardh L 片段和 KR 片段各2u L, exTaq DNA polymerase 0. 5 u L,加ddH20至反应总体积为25 u L ；扩增程序 如下95°C预变性4min ；94°C变性55s，65°C退火40s，72°C延伸lmin，循环5次；72°C延长 2min ；第二步在第一步PCR产物中加入10XPCR buffer 5 u L, Mg2+2 u L, dNTP 4yL，弓丨物 s-ardh L—fwd 禾口弓|物 s—ardh R-rev # 2 u L, exTaq DNA polymerase 1 H L，力口 ddH20 至反 应总体积为50 uL ；扩增程序如下95°C预变性4min ；94°C变性50s，59°C退火40s，72°C延 伸lmin，循环30次；72°C延长lOmin。
7.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步 骤(7)中，三亲接合敲除方法为分别将供体菌E. coli JM109/pSUP202-S-ardh::Km、帮助 菌JM109/pRK2013接种在加有卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌G. oxydans接种在 G-Ara培养15 20h，A66(1值为0.6 1.0时进行接合实验；按受体亲本菌帮助菌供体菌=3:1: 3的菌液体积比收集菌体，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30°C 培养过夜；用G. oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将 培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入头孢噻肟酸 和卡纳霉素的G-Ara平板上，培养2 4天，长出接合子进行PCR验证。
8.一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于该细菌是缺失S-ArDH基因，且在 S-ArDH基因的位置上用XDH基因增强的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)。
9.权利要求8所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于该方法包 括如下步骤(1)引物设计根据GenBank公布的Gluconobacteroxydans 621H基因为基础设计两 对特异引物，引物如下所示s-ardh L-fwd :5’ -TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC-3， EcoR I， s-ardh L-rev :5’ -CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3， Xho I， s-ardh R-fwd :5’ -AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3' Xho I， s-ardh R-rev :5’ -ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG-3' EcoR I ；(2)s-ardh L、s-ardh R 基因的克隆通过 PCR 技术，以 Gluconobacter oxydans 菌株 基因组DNA为模板，分别扩增s-ardh L和s-ardh R各800bp序列；(3)抗性片段Km的获得根据GenBank公布的卡纳霉素抗性基因Km序列，设计一对特 异性引物km-fwd和km-rev，以pET28a(+)质粒为模板扩增Km的完整⑶s，引物如下km-fwd :5’ -GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3’ Xho I， km-rev :5， -CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3' Xho I， km-fwd和km-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I及保护碱基，下划线部分均 为酶切位点，扩增出900bp序列；(4)pMD 18-KR的构建将s-ardh R和Km片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为 1700bp的片段KR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态Ε. coli JM109中，通过含Amp和Km 抗性平板筛选获得含目标基因的重组质粒PMD18-KR ；(5)pMD18-LKR的构建将s-ardhL和KR片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为 2500bp的片段LKR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态Ε. coli JM109中，通过含Amp和Km 的LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pMDIS-LKR ；(6)s-ardh基因敲除载体pSUP202-s-ardh: :Km的构建将重组质粒pMD18_LKR用EcoR I酶切；载体PSUP202用EcoR I酶切后用CIAP去磷酸化；将酶切后的LKR片段和去磷酸化 后的载体PSUP202用T4连接酶连接，转化至感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km的 LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pSUP202-S-ardh: :Km ；(7)s-ardh 基因敲除突变体 G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18 的获得将含敲 除突变载体pSUP202-S-ardh: :Km的Ε. coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为 G. oxydans ；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入G. oxydans，将含Km基因的目标 基因片段整合到G. oxydans的染色体上，通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子；(8)引物设计根据GenBank公布的Gluconobacteroxydans 621H基因为基础设计两 对特异引物，引物如下所示xdh-fwd :5’ -AGGCTCGAGTCGAAGAAGTTTAAG-3，Xho I，xdh-rev :5’ -ATTCTCGAGTCAACCGCCAGCAAT-3，Xho I ；(9)xdh基因的克隆通过PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模 板，扩增800bpxdh序列；(10)xdh基因增强载体pSUP202-S-ardh: xdh的构建将含目标基因的质粒 pMD18-xdh用Xho I酶切，胶回收目的片段；载体pSUP202-s-ardh: :Km用Xho I酶切后 用CIAP去磷酸化；将酶切后的目的片段和去磷酸化后的载体用T4连接酶连接，转化至 感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km抗性平板筛选获得含目标基因的重组质粒 pSUP202-s-ardh::xdh ；(11)xdh基因增强突变体G. oxydans s-ardh xdh NSAX31的获得将含敲除突 变载体pSUP202-s-ardh xdh的Ε. coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为 G. oxydanss-ardh: :Km mutant NSA18 ；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入 G. oxydansNSA18，将含xdh基因的目标基因片段整合到G. oxydans NSA18的染色体上；通过 Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。
10.根据权利要求9所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于 步骤(9)中，xdh基因克隆的方法为采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株 基因组DNA为模板，用引物xdh-fwd、xdh-rev进行PCR扩增，PCR反应条件为10XPCR buffer5 μ L,Mg2+2 μ L, dNTP 5 μ L，弓丨物 xdh-fwd禾口 xdh-rev各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L，基因组模板1 μ L，加ddH20至反应总体积为50 μ L ；PCR程序为94°C预变性2min ； 94°C变性 30s，53. 6°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循环 30 次；72°C延长 lOmin。
11.根据权利要求9所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步 骤(11)中，三亲接合增强的方法为将供体菌E. coli JM109/pSUP202-S-ardh::Xdh、帮助 菌JM109/pRK2013分别接种在加有氨苄青霉素和卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌 G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18 接种在 G-Ara 培养 15 20h，A660 值为 0. 6 1. O 时进行接合实验；按受体亲本菌帮助菌供体菌=3:1:3的菌液体积比收集菌体，转 移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30°C培养过夜；用G. oxydans具有的抗性加 上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸 水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入头孢噻肟酸的G-Ara平板上，培养2 4天，长出 接合子进行PCR验证。
全文摘要
本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，该细菌是缺失s-ArDH基因的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。本发明还公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，该细菌是缺失s-ArDH基因，且在s-ArDH基因的位置上用XDH基因增强的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。本发明同时公开了上述两种基因工程菌的构建方法。本发明的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌可以阻断生物法转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇过程中木酮糖逆反应生成D-阿拉伯糖醇，进而从根本上解决木糖醇生产过程中副产物伴生的问题，此外，XDH增强菌株提高了木糖醇脱氢酶活力，提高了木糖醇的转化率。
文档编号C12N1/20GK101880643SQ20101019093
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者冯小海, 徐虹, 朱宏阳, 李莎 申请人:南京工业大学