一种基于96孔板的植酸酶高通量筛选方法

专利名称：一种基于96孔板的植酸酶高通量筛选方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，更具体的，本发明涉及一种基于96孔板的植酸酶 高通量筛选方法。
背景技术：
植酸酶是一种能将植物性饲料中植酸(盐)降解为肌醇和无机磷酸盐的酶类，其 作为单胃动物的饲料添加剂，对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要作 用。但目前酶活力和稳定性较低是植酸酶在生产运用中的一个瓶颈，因此通过基因工程和 蛋白质工程技术对植酸酶进行改造具有重要的科学和实用价值。定向进化技术是在体外模 拟达尔文自然进化过程，该技术已成为改造酶分子的一种有效策略，在农业、工业和医药等 领域都展现了其巨大的潜力。易错PCR是定向进化研究最早采用的一种构建基因文库的方法。首次提出易错 PCR是Leung等人。易错PCR是指通过改变PCR的反应条件，如调整反应方法中4种dNTP 的浓度、增加Mg2+的浓度、加入Mn2+或使用低保真度Taq酶等，使碱基在一定程度上随机错 配而引入多点突变，构建突变库，筛选出所需的突变体。易错PCR的关键是控制DNA的突变 频率。如果DNA的突变频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；如果突变频率太低，野生 型的背景太高，样品的多样性则较少。对于每一 DNA序列来说，合理的碱基突变数是1-3。 理想的碱基置换率和易错PCR的最佳条件则依赖于随机突变的目标DNA片段的片段长度。 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，所以属于无性进化。由于它较为费力、耗时， 一般多用于较小基因片段(< 800bp)的改造。在通常情况下，经一轮的易错PCR、定向筛 选，很难获得令人满意的结果，由此发展出了连续易错PClUsequentialerror-prone PCR)， 该方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行 随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。定向进化技术是植酸酶基因工程改造的有效方法，而构建一个高通量的筛选方法 决定了植酸酶定向进化研究的关键。植酸酶酶活性的测定主要是检测分解产物无机磷的生 成量，目前普遍采用的方法有4种钼-钒酸铵法、丙酮-磷钼酸铵法、维生素C-钼蓝法以 及FeSO4-钼蓝法。微板法测定酶活是源于酶联免疫测定的一种方法，在高通量筛选中已经 得到了广泛的运用。其中，96孔板微量滴定法是液态酶活测定最常用的一种方法，它是当前 和机器手臂、液体处理系统、读板仪最兼容的酶活测定方法，是最普遍的适于自动化、高通 量的筛选方法，筛选的结果非常可靠。该方法的优点是测活的体积可以减少，相应的器材、 试剂消耗可以减少，还可以从背景中区分低溶度的、弱活性的酶表达克隆。微板法在国外 分子生物学领域及医学领域经常采用，并也有应用此方法于工业微生物菌种筛选中，国内 采用此法应用于工业微生物工作中尚不多见，所以该种方法在国内具有很大的研究潜力。 用微板法进行植酸酶的微量酶活测定与常规钼钒法的常量酶活测定相比，两种方法在准确 度、灵敏度、稳定性、测定误差方面差异不显著，且微板法测定的线性范围略大于常规钼钒 法。同时微板法与常规钼钒法相比有如下优点(1)高效性常规钼钒法测定植酸酶酶活耗时长，工作量大。(2)经济性当把常量操作改为微量操作后，节约了昂贵的植酸钠底物以 及其它消耗的试剂。因此，可以认为微板法能够替代常规钼钒法进行植酸酶微量酶活测定。本发明在常规的酵母摇瓶培养和钼钒法测定植酸酶酶活的基础上，建立了在96 孔板上进行毕赤酵母生长表达及植酸酶微量测定，以构建高通量的植酸酶基因工程菌微量 酶活测定方法，为植酸酶突变体库的高通量筛选打下基础。

发明内容
本发明的目的是克服现有方法中的筛选容量小，筛选时间长等不足，提供了一种 基于96孔板方法的高效的、经济的植酸酶高通量筛选方法。本发明的具体实施步骤如下1、获得突变植酸酶基因(1)接种一环含有pUC18_phyA质粒的大肠杆菌DH5 α于IOmL LB液体培养基中 37°C培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取pUC18-phyA质粒。提取的质粒通过EcoR I，Kpn I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板。(2)调整反应参数和反应方法，通过引物Pl :5，-CGGAATTCCTGGCAGTCCCCGCCTC-3，(SEQID NO 1)和P2 :5，-GCGGTACCGCGGCCGCCTAAGCAAAACACTCC-3，(SEQ ID NO 2)进行易错PCR。反应结束后使用纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收。2、植酸酶毕赤酵母突变体库的构建本步骤是将回收的经易错PCR突变的植酸酶基因库经EcoR I, Kpn I双酶切后， 连入同样经过双酶切的含有AOXl启动子和氨苄青霉素、卡那霉素抗性基因的表达载体 PPIC9K 中。使用电击转化的方法，将含有突变的植酸酶基因库的表达载体质粒转入毕赤酵母 GS115中，通过MD平板筛选出阳性转化子。3、高通量筛选方法的建立本发明在常规钼钒法测定植酸酶酶活的基础上建立微板法进行植酸酶活的测定， 并在常规摇瓶培养产植酸酶酵母工程菌的基础上建立微板上的微量培养方法。(1)常规钼钒法将上清液用乙酸缓冲液(0. 25mol/L, pH4. 6)进行100倍稀释，取0. 5ml于离心管 中，再加入1. 5mL上述乙酸缓冲液，摇勻。按相同的顺序和间隔向实验组管中加入4mL8. 4g/ L植酸钠溶液，对照组中加入4mL颜色/终点混合液。于37°C 士0. 1°C的水浴中反应30分 钟后，立即向实验组试管中加入4ml颜色/终点混合液，对照组试管中加入4mL 8. 4g/L植 酸钠溶液。在实验样品反应过程中制作磷标准曲线，取表1中每个稀释度的磷标准液各4mL 加入微孔板相应的孔内，其中一孔中加4mL双蒸水做对照，另各孔加4mL颜色/终点混合液 并混勻。用分光光度计在415nm处测定光吸收值，以水作为仪器零点。对应各个磷标准浓 度，在酶标分光光度计中输入上述数值建立直线回归方程(仪器自动建立)。曲线建立好后，方可测定各个植酸酶样品415nm处的磷浓度值。植酸酶活性单位定义为在37°C、pH4. 6的条件下，一分钟从0. 0051摩尔(mol)的
5植酸钠溶液中稀释放出1纳摩尔(nmol)无机磷所需要的植酸酶量为一个酶活性单位(U)。
表1磷酸盐标准
稀释度 磷浓度(nmol/mL) 每毫升样品的植酸酶含量(u/mL) = [ (C样-C空)X 10 + 0. 5 X 100]+30 ；C样=样品光吸收值通过回归方程计算所得磷浓度(nmol/mL)；C空=空白样品光吸收值通过回归方程计算所得磷浓度(nmol/mL)；10 =水解液体积(mL)；0. 5 =样品水解时所取稀释液的体积(mL)；100=酶液稀释倍数；30 =样品水解时间(min)。(2)微板法微板法测定植酸酶活以钼钒法为基础。将每孔的上清液对应转入事先准备的96 孔微孔板(微孔板上预留6个孔作建立标准曲线用)，用乙酸缓冲液(0. 25mol/L,pH4. 6)进 行100倍稀释。每孔取15 μ L对应加入新的96孔微孔板中，再相应加入45 μ L上述乙酸缓 冲液，摇勻。按相同的顺序和间隔向实验组微孔板中加入120 μ L 8.4g/L植酸钠溶液，对照 组中加入120 μ L颜色/终点混合液。于37°C 士 0. 1°C的水浴中反应30分钟后，立即向实 验组试管中加入120 μ L颜色/终点混合液，对照组中加入120 μ L8. 4g/L植酸钠溶液。在预留6孔中加入相应的磷标准溶液和颜色/终点混合液用于制作磷标准曲线， 建立方法如下取表1中每个稀释度的磷标准液各150 μ L加入微孔板相应的孔内，其中一 孔中加150 μ L双蒸水做对照，另各孔加150 μ L颜色/终点混合液并混勻。反应完毕后将整块96孔微孔板放入酶标分光光度计内，在415nm处测定光吸收 值。以水作为仪器零点，对应各个磷标准浓度，在酶标分光光度计中输入上述数值建立直线 回归方程(仪器自动建立)。同时测出各个植酸酶样品415nm时的磷浓度值。每毫升样品的植酸酶含量(u/mL) = [ (C样-C空)X 0. 3 + 0. 015 X 100]+30 ；C样=样品光吸收值通过回归方程计算所得磷浓度(nmol/mL)；C空=空白样品光吸收值通过回归方程计算所得磷浓度(nmol/mL)；0. 3 =水解液体积(mL)；0. 015 =样品水解时所取稀释液的体积(mL)；100 =酶液稀释倍数；30 =样品水解时间(min)；
本发明针对植酸酶活力测定的微板法与常规钼钒法做了 5方面的对比①稳定性 ②最低检出值③样品测定的准确度④线性范围⑤样品测定精确度。微量培养是将酵母植酸 酶工程菌的培养转移到微板上进行。对于在微板上进行的酵母植酸酶工程菌的微量培养是 基于前期对该菌种在摇瓶中的培养条件进行优化的基础上，在同等条件下同比例缩小试剂 用量进行培养，摇瓶培养和微板培养的培养体积分别为IOml和200 μ 1。4、基于96孔板方法的植酸酶高通量筛选；挑取经MD平板筛选出的阳性转化子入每孔含有BMGY液体培养基的96孔深孔培 养板，每一孔对应一个阳性转化子，28-30°C、250-300rpm培养至OD6tltl为2_6。再向每孔中 加入BMMY液体培养基28-30°C、250-300rpm进行诱导产酶，每隔12小时加入甲醇使培养基 甲醇浓度保持在5%，诱导36-48小时后离心取上清液作为粗酶液。将每孔的上清液对应 转入事先准备的96孔酶标板，用乙酸缓冲液(0. 25mol/L, pH4. 6)进行100倍稀释，测定酶 活。植酸酶酶活性测定方法采用钼钒法。


图la :pUC18_phyA质粒酶切电泳检测泳道1-4依次为pUC18_phyA质粒，EcoR I、 Kpn I双酶切，EcoR I单酶切，Kpn I单酶切；图Ib 易错条件的优化Mn2+浓度为0. lmmol/L,Mg2+浓度(mmol/L)从泳道1_4依 次为 4、5、6、7 (mmol/L)；图Ic 易错条件的优化Mg2+浓度为7mmol/L，Mn2+浓度(mmol/L)从泳道1_8依次 为 0. 05、0· 1、0· 15、0· 20,0. 25,0. 30,0. 35,0. 40 (mmol/L)；图Id 易错PCR扩增产物电泳检测；图2a 易错PCR产物、pPIC9K质粒酶切电泳检测泳道1_2依次为易错PCR产物 双酶切后回收，PPIC9K质粒双酶切后回收；图2b 阳性转化子的MD筛选平板；图2c :pPIC9K_phyAep质粒酶切电泳检测泳道1_3依次为阳性转化子EcoR I、Not I双酶切，阳性转化子质粒EcoR I单酶切，阳性转化子质粒Not I单酶切；图3a 常规法与微板法OD值稳定曲线；图3b 常规法与微板法酶活稳定曲线；图4 酶促反应后加入颜色/终点液后的96孔酶标板；
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括1、菌株和质粒；大肠杆菌DH5a本实验室构建，受体酵母GSl 15购自Invitrogen公司，含phyA基 因的克隆载体pUC18-phyA由本实验室构建，酵母表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司， 含phyA基因酵母表达载体pPIC9K-phyA由本实验室构建，克隆载体pMD19_T Vector购自 Invitrogen公司，植酸酶毕赤酵母工程菌PP-NPm_8由本实验室构建。
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2、化学试剂和酶制剂；BspE I购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，Kpn I、EcoR I、NotI、氨苄青霉 素、卡那霉素、T4 DNA Ligase,Taq DNA Polymerase,dNTP,DNA Maker DL15000购自 Takara Biotechnology，质粒提取试剂盒、纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒购自OMEGA。NaCl、NaOH, HCl、K2HPO4 · 3H20、KH2PO4、MgCl2, MnCl2JjC乙酸、甲醇、甲酸、蛋白胨、 酵母抽提物、葡萄糖、蔗糖、琼脂粉、生物素、无氨基酸酵母氮源(YNB)、甘油、琼脂糖、乙二胺 四乙酸(EDTA)、Tris-HCl、十二烷基硫酸钠(SDS)、考马斯亮蓝R250、丙烯酰胺、甲叉双丙烯 酰胺、过硫酸铵、N，N, N’ N’ -四甲基乙二胺(TEMED)等。3、引物合成；本发明涉及的引物由Invitrogen公司合成。下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第三版)。实施例1 突变植酸酶基因的获得；(一 )实验方法1、突变模板的准备接种一环含有pUC18_phyA质粒的大肠杆菌DH5 α于IOmL LB液体培养基中37°C 培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取pUC18-phyA质粒。提取的质粒通过EcoR I,Kpn I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板。2、易错PCR方法分别采用不同浓度的Mg2+(4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L)和 Mn2+(0.05mmol/L、0. Immol/L、0. 15mmol/L、0.20mmol/L、0. 25mmol/L、0. 30mmol/L、 0. 35mmol/L、0. 40mmol/L)来做易错PCR条件的优化。3、易错PCR突变以pUC18_phyA质粒作为模板，以Pl :5’ -CGGAATTCCTGGCAGTCCCCGCCTC-3，和P2 :5，-GCGGTACCGCGGCCGCCTAAGCAAAACACTCC-3，作为引物进行易错 PCR，扩增 得到长度为1. 4Kb的植酸酶基因扩增产物。PCR反应参数为95°C预变性2min，94°C变性 lmin，5(TC退火lmin，72°C延伸2min，30个循环后，72°C延伸7min。反应结束后使用纯化试 剂盒对易错PCR产物进行纯化回收，取1 μ L PCR产物进行琼脂糖电泳检测其大小和含量。( 二)实验结果1、培养含pUC18_phyA质粒的大肠杆菌DH5a并提取质粒，通过EcoRI，Kpn I双 酶切对其进行了检测，证明该质粒含有植酸酶基因，可以作为植酸酶基因定向进化的模板 (图 la)。2、采用不同浓度的Mg2+和Mn2+进行易错PCR条件优化，优化后反应方法中Mg2+离 子浓度宜为7mmol/L，Mn2+离子浓度宜为0. lmmol/L(图lb，图Ic)。3、采用琼脂糖电泳鉴定PCR产物，得到大小约为1.4Kb的片段，此片段即为经 易错PCR突变后得到的植酸酶基因突变体库(图Id)。实施例2 突变植酸酶基因PPIC9K表达载体的构建(一)实验方法1、突变植酸酶基因PPIC9K表达载体的构建
1)质粒载体pPIC9K的准备培养含有pPIC9K质粒的大肠杆菌DH5 α于IOmL卡那抗性LB液体培养基中37°C 培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明书提取PPIC9K质粒。2)易错PCR产物、pPIC9K质粒的双酶切处理分别取上述易错PCR产物、pPIC9K质粒进行EcoR I、Not I双酶切，酶切方法如
下IOx digestion buffer10 μ LBSA10 μ LEcoR I1 μ LNot I1 μ LProducts2 μ gddH.O_up to 100 μ Lthe total volume100 μ L37°C酶切过夜。使用胶回收试剂盒回收纯化，植酸酶突变基因回收1. 4Kb左右片 段，PPIC9K质粒回收9K左右片段后，分别取1 μ L回收产物进行1 %琼脂糖电泳检测其大小
和含量。3)大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制备采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。4)易错PCR产物、pPIC9K质粒的连接与转化取易错PCR产物、pPIC9K质粒，按下列反应方法进行连接IOx Τ4 DNA Ligase buffer2μ LΤ4 DNA Ligase2μ LpPIC9K 质粒2yL印-PCR product8μ LddHoO_up to 20 μ Lthe total volume20 μ L16°C连接过夜后全量转化大肠杆菌DH5a感受态。同时设立pPIC9K阳性对照与感受态细胞阴性对照。将全部阳性转化子命名为 pPIC9K_phyAep，并随机挑取阳性转化子，提取质粒后，用EcoR I、Not I双酶切进行鉴定，同 时设立阳性转化子质粒EcoR I、Not I单酶切对照。2、突变植酸酶基因重组质粒的电击转化1)外源DNA的准备将2ml无菌水加入筛选平板，震荡混合所有阳性转化子后转20mL卡那抗性LB培 养基中37°C培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明书提取全部pPIC9K-phyAep质粒。使用 BspE I将所提质粒线性化，线性化酶切方法如下IOx digestion buffer3μ LBspE I2μ LpPIC9K-phyAep 质粒20 μ LddH,0_upto 30 μ L
the total volume30 μ L37°C酶切过夜。使用胶回收试剂盒回收纯化酶切产物，分别取1 μ L回收产物进行 1 %琼脂糖电泳检测其大小和含量。2)毕赤酵母GS115感受态细胞的制备将毕赤酵母GS115划线接种YPD平板，28-30°C培养直至长出单菌落。挑取一个 单菌落，接种至含有5mL YPD培养基的50mL三角瓶中，28-30°C、250-300rpm培养过夜；取 300 μ L的培养物接种至含有500ml YPD液体培养基中，28_30°C、250_300rpm培养过夜，至 OD600达到1. 3左右；将细胞培养物于4°C，1500g离心5mi η,用500mL的冰预冷的无菌去离 子水重悬菌体；4°C，1500g离心5min，用250mL的冰预冷的无菌水重悬菌体；4°C，1500g离 心5min，用20mL的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液重悬菌体；4°C，1500g离心5min，用2mL 的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液重悬菌体，等分细胞悬液为IOOyL/管。3)电击转化吸取20 μ L的线性化DNA加入100 μ L酵母感受态细胞中，边加入边搅拌混勻，然 后转入0. 2cm冰预冷的电转化杯中，将电转化杯冰浴5min，在Bio-Rad电穿孔仪上选择毕赤 酵母电击参数，进行电击并同时进行电击条件的优化，电击完毕后，立即加入Iml冰预冷的 lmol/L的山梨醇溶液将菌体混勻，转至1. 5mL离心管中，28_30°C温育30min，将菌体悬液涂 布于MD平板上，每400 μ L涂布一块平板，将平板置于28-30°C培养，直至单个菌落出现，即 为含有突变植酸酶基因PhyAep的转化子库。(二)实验结果1、采用琼脂糖电泳鉴定双酶切后含突变植酸酶基因片段的表达载体质粒，得 到1. 4Kb的目的基因片段和9Kb的载体片段(图2a)。2、将回收的易错PCR产物、pPIC9K质粒用T4 DNA Ligase进行连接，转化大肠杆 菌DH5 α，从氨苄-卡那抗性LB平板上筛选阳性转化子，经电击优化后，每个筛选平板可长 出200个左右的转化子(图2b)。3、随机挑取阳性转化子，提取质粒后，用EcoR I.Not I双酶切进行鉴定，得到9Kb 载体片段和1. 4Kb PhyAep基因表达片段，证明phyA印基因已成功克隆至pPI C9K载体上 (图 2c)。实施例3 高通量筛选方法的建立(一)实验方法获得植酸酶突变体库后，建立一种高通量的筛选方法筛选出有益突变成了本发明 的关键。1)菌种微量培养接种PP-NPm-8于IOmL YPD液体培养基中30°C，200r/min培养16h后取出置4°C 冰箱中放置lh，作为液体种子。按3%接种量接入每孔含有200 μ LBMGY液体培养基的96 孔深孔培养板。28-300C >250-300r/min培养至OD600为2-6。每孔再加入200 μ LBMMY液 体培养基28-30°C、250-300r/min进行诱导产酶，每隔12小时加入甲醇使培养基甲醇浓度 保持在4%，诱导36-48小时后将装有诱导液的96孔深孔板装入水平转头进行离心，室温 5000rpm, Imin离心取上清测定酶活。2)酶活测定
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本发明针对植酸酶活力测定的微板法与常规钼钒法做了 5方面的对比①稳定性 ②最低检出值③样品测定的准确度④线性范围⑤样品测定精确度。①稳定性稳定性测定将同一样品酶液反应后通过常规钼钒法和微板法分别测定OD值，计 算出酶活，且每隔一小时测定一次，共测定12次。②最低检出值用上述两种方法分别测定无机磷的最低含量即为该种方法的最低检出值。③样品测定的准确度准确称取磷酸二氢钾，配成0. 375mM溶液，分别采用上述两种方法测定，重复5次， 根据标准曲线计算出其无机磷含量并分析其准确度。④线性范围配置不同浓度的无机磷，分别采用上述两种方法测定OD值，以OD值为纵坐标，无 机磷为横坐标作出曲线。并作回归分析，凡能满足回归方程相关系数达0.99的回归直线两 个端点所对应无机磷浓度为该法定量的线性范围。⑤样品测定精确度以同一样品采用两种方法分别测定无机磷含量、计算酶活，重复5次，数据进行统 计学处理。(二)实验结果1、微板法与常规钼钒法的稳定性基本一致。两种测定方法均在12h内出现了降 低，其酶活呈先上升后下降的趋势，而在2-3小时酶活基本趋于稳定。因此，应控制在反应 后3小时内完成酶活测定(图3a，图3b)。2、常规钼钒法可以测出的无机磷最低含量为0. 30 μ g/ml，微板法可以测出的无机 磷最低含量为0. 67μ g/ml，两种方法灵敏度较高，均可测出反应液中微量的无机磷。3、常规钼钒法测得无机磷浓度为0. 375 士 0. 031，误差8. 2 % ；微板法测得无机磷浓 度为0. 375士0. 033，误差8. 8%。两种方法的误差范围差异不显著(P > 0. 05)。4、常规钼钒法和微板法测定时，满足回归相关系数0.99以上的回归直线两个端 点所对应的无机磷浓度为0. 30 μ g/ml-25. 50 μ g/ml ；微板法为0. 67 μ g/ml-48. 14 μ g/ml。 结果表明，微板法测定的线性范围略大于常规钼钒法。5、用一定稀释的酶液样品用两种方法进行测定，测定数据经统计学分析表明，CV 差异不显著(P > 0. 05)。结果见表2。表2误差分析表 6、比较后得出，微板法进行植酸酶的微量酶活测定与常规钼钒法的常量酶活测定 相比，两种方法在准确度、灵敏度、稳定性等方面差异不显著。因此，在植酸酶突变体库的筛选中微板法可以替代常规法测定酶活。实施例4 基于96孔板系统的植酸酶高通量筛选(一)实验方法1、产植酸酶基因工程菌的微量培养挑取经MD平板筛选得到的阳性转化子入每孔含有200 μ L BMGY液体培养基的96 孔深孔培养板，每一孔对应一个阳性转化子，28-30°C、250-300rpm培养至OD6tltl为2_6。每 孔再加入200 μ L BMMY液体培养基28-30°C、250-300rpm进行诱导产酶，每隔12小时加入 甲醇使培养基甲醇浓度保持在4%，诱导36-48小时后将装有诱导液的96孔深孔板装入水 平转头进行离心，室温5000rpm，Imin离心取上清液作为粗酶液。2、植酸酶的微量酶活测定微板法测定植酸酶活以钼钒法为基础。将每孔的上清液对应转入事先准备的96 孔微孔板(微孔板上预留6个孔作建立标准曲线用)，用乙酸缓冲液(0. 25mol/L,pH4. 6)进 行100倍稀释。每孔取15 μ L对应加入新的96孔微孔板中，再相应加入45 μ L上述乙酸缓 冲液，摇勻。按相同的顺序和间隔向实验组微孔板中加入120yL8.4g/L植酸钠溶液，对照 组中加入120 μ L颜色/终点混合液。于37°C 士 0. 1°C的水浴中反应30分钟后，立即向实 验组试管中加入120 μ L颜色/终点混合液，对照组中加入120 μ L8. 4g/L植酸钠溶液。在预留6孔中加入相应的磷标准溶液和颜色/终点混合液用于制作磷标准曲线， 建立方法如下取表1中每个稀释度的磷标准液各150 μ L加入微孔板相应的孔内，其中一 孔中加150 μ L双蒸水做对照，另各孔加150 μ L颜色/终点混合液并混勻。反应完毕后将整块96孔微孔板放入酶标分光光度计内，在415nm处测定光吸收 值。以水作为仪器零点，对应各个磷标准浓度，在酶标分光光度计中输入上述数值建立直线 回归方程(仪器自动建立)。同时测出各个植酸酶样品415nm时的磷浓度值。每毫升样品的植酸酶含量(u/mL) = [ (C样-C空)X 0. 3 + 0. 015 X 100]+30 ；C样=样品光吸收值通过回归方程计算所得磷浓度(nmol/mL)；C空=空白样品光吸收值通过回归方程计算所得磷浓度(nmol/mL)；0. 3 =水解液体积(mL)；0. 015 =样品水解时所取稀释液的体积(mL)；100=酶液稀释倍数；30 =样品水解时间(min)。(二)实验结果1、通过在96孔深孔板中的生长、诱导，突变植酸酶基因工程菌可以产酶并分泌到 细胞外。2、通过植酸酶微量酶活测定可以较快较好的测出每个突变植酸酶基因工程菌所 产酶的酶活力，如图4所示。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
一种基于96孔板的植酸酶高通量筛选方法，其特征在于，包含以下步骤A1，获得突变植酸酶基因；突变模板的准备接种一环含有pUC18 phyA质粒的大肠杆菌DH5α于10mL LB液体培养基中，37℃培养过夜，提取pUC18 phyA质粒；提取到的质粒通过EcoR I，Kpn I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板；通过引物P15’ CGGAATTCCTGGCAGTCCCCGCCTC 3’和P25’ GCGGTACCGCGGCCGCCTAAGCAAAACACTCC 3’进行易错PCR；易错PCR反应结束后使用纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收；A2，植酸酶毕赤酵母突变体库的构建；将步骤A1回收的所述易错PCR产物经EcoR I，Kpn I双酶切后，连入同样经过双酶切的含有AOX1启动子和氨苄青霉素、卡那霉素抗性基因的表达载体pPIC9K中；使用电击转化的方法，将含有突变的植酸酶基因库的表达载体质粒转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过MD平板筛选出阳性转化子；A3，基于96孔板方法的植酸酶高通量筛选；挑取经MD平板筛选出的阳性转化子入每孔含有BMGY液体培养基的96孔深孔培养板，每一孔对应一个阳性转化子，28 30℃、250 300rpm培养至OD600为2 6；再向每孔中加入BMMY液体培养基28 30℃、250 300rpm进行诱导产酶，每隔12小时加入甲醇使培养基甲醇浓度保持在5％，诱导36 48小时后离心取上清液作为粗酶液；将每孔的上清液对应转入事先准备的96孔酶标板，用乙酸缓冲液(0.25mol/L，pH4.6)进行100倍稀释，测定酶活；采用钼钒法测定植酸酶酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Al中的PCR反应参数为95°C 预变性2min，94°C变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸2min，30个循环后，72°C延伸7min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中的酶切方法如下 IOx digestion buffer IOuLBSA10 μ LEcoR I1 μ LNot I1 μ LProducts2 μ gddH20up to 100 μ Lthe total volume100 μ L37 °C酶切过夜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中的毕赤酵母GSl15感受态 细胞的制备方法为将毕赤酵母GS115划线接种YPD平板，28-30°C培养直至长出单菌落； 挑取一个单菌落，接种至含有5mL YPD培养基的50mL三角瓶中，28-30°C、250-300rpm培养 过夜；取300 μ L的培养物接种至含有500ml YPD液体培养基中，28_30°C、250_300rpm培养 过夜，至0D600达到1. 3左右；将细胞培养物于4°C，1500g离心5min，用500mL的冰预冷的 无菌去离子水重悬菌体；4°C，1500g离心5min，用250mL的冰预冷的无菌水重悬菌体；4°C， 1500g离心5min，用20mL的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液重悬菌体；4°C，1500g离心5min， 用2mL的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液重悬菌体，等分细胞悬液为100 μ L/管。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Α2中所述电击转化的方法为 吸取20 μ L的线性化DNA加入100 μ L酵母感受态细胞中，边加入边搅拌混勻，然后转入2.0.2cm冰预冷的电转化杯中，将电转化杯冰浴5min，在Bio-Rad电穿孔仪上选择毕赤酵母电 击参数，进行电击并同时进行电击条件的优化，电击完毕后，立即加入Iml冰预冷的lmol/L 的山梨醇溶液将菌体混勻，转至1. 5mL离心管中，28-30°C温育30min，将菌体悬液涂布于MD 平板上，每400 μ L涂布一块平板，将平板置于28-30°C培养，直至单个菌落出现，即为含有 突变植酸酶基因PhyAep的转化子库。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量筛选方法的建立方法为在钼 钒法测定植酸酶酶活的基础上建立微板法进行植酸酶活的测定，并在常规摇瓶培养产植酸 酶酵母工程菌的基础上建立微板上的微量培养方法。
全文摘要
本发明公开了基于96孔板的植酸酶高通量筛选方法，包含以下步骤A1，获得突变植酸酶基因；突变模板的准备；A2，植酸酶毕赤酵母突变体库的构建；A3，基于96孔板方法的植酸酶高通量筛选；建立了在96孔板上进行毕赤酵母生长表达及植酸酶微量测定，构建高通量的植酸酶基因工程菌微量酶活测定方法。
文档编号C12N15/55GK101914508SQ20101019044
公开日2010年12月15日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者吴振芳, 吴琦, 廖 燕, 曾民, 陈惠 , 韩学易 申请人:四川农业大学