专利名称：一种人LIGHT-Fc融合蛋白的制备方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和基因工程药物领域，具体涉及重组质粒LIGHT-Fc-pPIC9K的构建及LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达的方法。
背景技术：
LIGHT(homologous to lymphotoxins exhibiting inducible expression andcompeting with herpes simplex virus glycoprotein D for herpesvirus entrymediator[HVEM], a receptor expressed by T lymphocytes)最早是 Mauri 等 在对单纯疱疹病毒入侵活化T细胞的研究中发现的，又称为HVEM-L (herpesvirus entrymediator-ligand)，属于TNF超家族的第14个成员(TNFSF14)。目前发现它有3个受 体HVEM、LT β R及TR6。LIGHT通过与这3个受体相互作用而发挥不同的生物学功能。其 中HVEM主要在T细胞上表达，与LIGHT结合后可以共刺激T细胞活化并调节T细胞免疫应 答，介导同种异体移植排斥反应。LT β R主要在非淋巴细胞如上皮细胞和基质细胞上表达， LIGHT-LT β R信号途径可以诱导细胞凋亡，促进多种细胞因子产生，参与淋巴结的发生发育 以及二级淋巴组织结构和功能的恢复。TR6是LIGHT的一个可溶性受体，它的mRNA在人体 许多正常组织如胃、脊髓、结肠、淋巴结、脾都有高表达，但在胸腺中表达很少，在外周血淋 巴细胞中不表达。TR6通过竞争结合LIGHT，抑制LIGHT与HVEM或LT β R的相互作用，从而 干扰或阻断1^6肌-^^11及1^6肌-1^^1 所引发的生物学效应。另外，TR6还可以与FasL 竞争性结合以阻断其诱导的细胞凋亡，从而有助于肿瘤免疫逃逸及自身免疫病的发生。因 此，LIGHT在肿瘤等多种免疫相关疾病中发挥着非常重要的作用，有很大的应用前景，克隆 LIGHT基因并获得重组蛋白对其生物学功能的研究具有重要意义。毕赤酵母是一种嗜甲醇酵母，能以甲醇为唯一碳源，是继酿酒酵母之后发展起来 的一种新型酵母表达系统，毕赤酵母能在体外大规模高密度发酵，并受醇氧化酶强启动子 的控制，在甲醇存在条件下诱导表达，使表达量大幅度提高，并能精密控制；另外，酵母属于 真核生物，对表达的蛋白质能进行如蛋白质的裂解、二硫键的形成等翻译后的加工、修饰， 并具有适于真核基因表达产物正确折叠的细胞内环境和糖基化系统，表达产物以活性形式 存在，因此，很多在大肠杆菌中以非活性的包涵体形式存在的蛋白质，在毕赤酵母中可以以 活性蛋白形式得到表达；毕赤酵母还能很好的分泌外源蛋白，几乎不受分子量限制，且其自 身蛋白很少分泌到培养基中，为后续的纯化带来了极大的方便。目前，在原核细胞和哺乳动物细胞中表达人LIGHT蛋白的方式已有报道，但尚未 有人在酵母中进行尝试。探索人LIGHT在毕赤酵母中的表达条件，寻找一种更为高效、简 单、大规模易工业化的LIGHT蛋白制备方式极为必要。
发明内容
本发明的目的在于运用毕赤酵母表达系统获得人LIGHT-Fc融合蛋白，为人LIGHT 蛋白的生物学功能及肿瘤免疫治疗的研究提供一种新型的生物制剂。
本发明所提供的获取人LIGHT-Fc融合蛋白的方法，包括以下步骤1、重组质粒 LIGHT-Fc_pPIC9K 的构建(1)人LIGHT胞外段cDNA的PCR体外扩增根据GenBank公布的人LIGHT基因序列设计如下引物Primer 1:5' ~CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG~3‘(划线部分为 EcoR I 酶切 位点，178-197)Primer 2:5' ~CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT~3‘(划线部分为 BamH I 酶切 位点，701-720)以pET32a_LIGHT重组质粒为模板，进行PCR反应扩增人LIGHT胞外段基因。(2)将含Fc片段的重组质粒pKS-IL-15-Fc用EcoR I和BamH I双酶切后回收大 片段(含pKS载体部分和Fc片段)，与用EcoR I和BamH I双酶切后的PCR产物于16°C过 夜连接，经转化和酶切鉴定后得到pKS-LIGHT-Fc重组质粒。(3) EcoR I和Not I双酶切pKS-LIGHT-Fc重组质粒回收LIGHT-Fc融合基因，与用 相同限制性内切酶双酶切的PPIC9K质粒于16°C过夜连接，酶切鉴定及测序正确的重组质 粒命名为pPIC9K-LIGHT-Fc。2、人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定①将构建的重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc用Sal I酶切线性化，同时将空载体 PPIC9K相同酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中。电转化 GS115感受态细胞，涂布MD平板，所得的his+转化子又涂布含不同浓度G418的YPD平板， 获得高G418抗性的阳性克隆。②提取多拷贝转化子的基因组，以基因组为模板，PCR扩增其Aoxl基因，琼脂糖凝 胶电泳鉴定，仅出现一条带(1726bp)者为甲醇利用慢型(Muts),出现两条带(上述条带及 2. 2Kb条带)者为甲醇利用快型(Mut+)。3、人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达(1)在毕赤酵母中诱导表达LIGHT-Fc融合蛋白将筛选出的重组子接种5mlYPD试管，30°C，250rpm振荡培养16_18h，再以1 %接种 量接种至20mL BMGY培养基中，30°C，250rpm振荡培养至0D600 = 2_6，离心收集菌体，用等 体积的BMMY培养基重悬(若为Mut+型转化子，则加入等体积的BMMY培养基，若为Muts型 转化子，则加入1/5倍体积的BMMY培养基)，30°C，250rpm振荡培养96h，每隔24h补加甲醇 至0. 5 %，分别在Oh、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取ImL培养基分析表达水平，以确 定最佳收菌时间。 (2) LIGHT-Fc融合蛋白的鉴定①抽提诱导后酵母菌体的总RNA，以Primer UPrimer 2为引物进行RT-PCR反应。②重组子经过甲醇诱导后，收集其培养基，加入上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳。③以鼠抗人LIGHT血清为一抗，以HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，Western Blot鉴 定人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重组子中的表达。本发明所用的酵母电转化的条件为电压1500V，电容25uF，电阻200。本发明进行多拷贝转化子筛选时所用的G418的最大浓度为4. Omg/ml。本发明中制备人LIGHT-Fc融合蛋白的方法具有操作简单、成本低、所表达的蛋白能进行正确的加工、修饰，从而表达具有完整生物活性蛋白的特点。分泌表达的产物中杂蛋 白少，易于对目的蛋白的分离纯化。而且，融合蛋白中的人类免疫球蛋白Fc片段既不影响 LIGHT蛋白的生物学活性，又可使融合蛋白不容易被蛋白酶降解，从而在体内外应用过程中 具有较好的稳定性。
图1为重组质粒pPIC9K-LIGHT_Fc构建流程2为重组质粒pPIC9K-LIGHT_Fc的酶切鉴定图(EcoR I/BamH I)，图中1为DL 2000分子量标准；2为EcoR I/BamH I双酶切后的pPIC9K-LIGHT_Fc ;3为未酶切的 pPIC9K-LIGHT-Fc。图3为重组质粒pPIC9K-LIGHT_Fc的酶切鉴定图(EcoR I/Not I)，图中1为 DL 2000分子量标准；2为EcoR I/Not I双酶切后的pPIC9K-LIGHT_Fc ;3为未酶切的 pPIC9K-LIGHT-Fc。图4为酵母转化子的表型鉴定图，图中1为500bp DNA Ladder ；2为未转化GS115 的鉴定结果；3为GS115/pPIC9K转化子的鉴定结果；4 13为GS115/pPIC9K-LIGHT_Fc转 化子的鉴定结果。图5为酵母转化子表达的RT-PCR鉴定结果，图中1为DL 2000分子量标准；2为 GS115/pPIC9K转化子的鉴定结果；3为GS115/pPIC9K-LIGHT_Fc转化子的鉴定结果。图6为酵母表达的SDS-PAGE分析图，图中1为蛋白质分子量标准；2为GSl 15空 菌体的分析结果；3为GS115/pPIC9K转化子的分析结果；4为GS115/pPIC9K-LIGHT_Fc转化 子的分析结果。图7为酵母表达产物的Western blot分析图，图中1为蛋白质分子量标 准；2为GS115空菌体的分析结果；3为GS115/pPIC9K转化子的分析结果；4为GS115/ pPIC9K-LIGHT-Fc转化子的分析结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1重组质粒LIGHT-Fc-pPIC9K的构建流程图如图1所示，具体步骤如下1.根据 Genebank公布的人LIGHT基因序列设计如下引物Primer 1:5' ~CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG~3‘(划线部分为 EcoR I 酶切 位点，178-197)Primer 2:5' ~CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT~3‘(划线部分为 BamH I 酶切 位点，701-720)以pET32a-LIGHT重组质粒为模板，以Primer 1和Primer 2分别为上下游引物进 行PCR反应。
反应程序95°C2min，94°C 30s，55°C 30s, 72°C lmin，30 个循环后，72°C继续延伸 IOmin0PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收并纯 化，得到5'端为EcoR 1,3'端为BamH I酶切位点的PCR产物。2.将含Fc片段的重组质 粒pKS-IL-15-Fc用EcoR I和BamH I双酶切后回收大片段(含pKS载体部分和Fc片段)， 与用EcoR I和BamH I双酶切后的PCR产物于16°C过夜连接，经转化和酶切鉴定后得到 pKS-LIGHT-Fc 重组质粒。3. EcoR I 和 Not I 双酶切 pKS-LIGHT_Fc 重组质粒回收 LIGHT-Fc 融合基因，与用相同限制性内切酶双酶切的PPIC9K质粒于16°C过夜连接，酶切鉴定及测序 正确的重组质粒命名为pPIC9K-LIGHT-Fc。经双酶切鉴定所构建的重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc正确(图2和图3)，经基因测 序分析证实重组质粒中LIGHT基因序列与GenBank公布的基因序列(AF036581) —致。实施例2将实施例1中所构建的重组质粒转化毕赤酵母感受态并筛选多拷贝转化子，具体 步骤如下1.制备感受态毕赤酵母GS115(1)取冻存的GS115酵母菌株，在YPD平板上划线，30°C静置培养36_48h待其长出
单克隆菌落。(2)挑单克隆菌落接种至5mLYPD培养基中，30°C，250rpm振荡培养12_16h。(3)取0.2mL菌液转接至IOOmL YPD培养基中，30°C，250rpm振荡培养12_16h，至 0D600 = 1. 3-1. 5。(4) 40C、1500rpm离心5min，弃上清，加IOOmL冰预冷的无菌双蒸水重悬沉淀。(5) 40C、1500rpm离心5min，弃上清，加50mL冰预冷的无菌双蒸水重悬沉淀。(6) 40C、1500rpm离心5min，弃上清，加5mL冰预冷的lmol/L山梨醇重悬沉淀。(7)4°C、1500rpm离心5min，弃上清，加0. 2mL冰预冷的lmol/L山梨醇重悬沉淀， 冰浴备用。2.重组质粒pPIC9K-LIGHT_Fc的预处理(1)用Sal I酶切重组质粒pPIC9K_LIGHT-Fc，使其完全线性化。酶切后取3 μ 1 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2)线性化质粒去磷酸化处理，于37°C水浴30min。(3)线性化质粒的纯化a)加入等体积的酚/氯仿抽提2次。b)入等体积的氯仿抽提1次。c)加入2. 5倍的冷乙醇，混勻，-20°C下放置30_60min。d) 12000rpm离心lOmin，弃上清。沉淀用200ul 70%冷乙醇洗净，减压干燥。e)加20 μ 1以下的TE缓冲液溶解沉淀。3.电转化毕赤酵母感受态菌(1)取10 μ 1上述线性化重组质粒(10-20呢)，加入8(^1感受态毕赤酵母65115， 混勻后转入冰冷的0. 2cm电转化杯中，冰浴lOmin。(2)电击电压 1500V，电容 25 μ F,电阻 200 Ω。
(3)电击一次后，立即加入Iml lmol/L山梨醇，混勻。(4)取转化液，涂布MD平板。30°C静置培养48h至长出单克隆菌落。4.筛选多拷贝转化子(1)在MD平板上挑单克隆接种至96孔细胞培养板中，每孔200 μ 1 YPD培养基， 30°C静置培养24h。(2)取10 μ 1菌液接种至新的96孔细胞培养板中，每孔加190 μ 1 YPD培养基， 30°C静置培养24h。(3)重复上步操作一次。(4)取 2μ 1 菌液分别接种至含 0,0. 5,1. 0,2. 0,4. Omg/ml G418 的 YPD 平板上， 30°C静置培养至长出单克隆菌落。5.转化子表型鉴定(1)转化子酵母基因组的抽提a)在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆至5ml YPD液体培养基中，30°C，250rpm振 荡培养12-16h。b)取 Iml 菌液，2500rpm 离心 5min。c)弃上清，500 μ 1 PBS 悬浮沉淀，2500rpm 离心 3min。d) 100 μ 1 TE 悬浮沉淀，煮沸 IOmin。e) -80 V 冷冻 30min。f)再次煮沸 IOmin。g) 1500rpm 离心 5min，取上清。(2) PCRPrimer 3 5' -GAC TGG TTC CAA TTG ACAAGC-3' (5’ AOXl Primer)Primer 4 5' -GCAAAT GGC ATT CTG ACA TCC—3’ (3’ AOXl Primer)以上一步得到的酵母基因组为模板，以Primer 3,Primer 4为引物进行PCR反应。 反应程序95°C预变性5min，94°C lmin，55°C lmin，72°C 3min，30个循环后，72°C继续延伸 IOmin0扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定转化子表型(见图4所示)，仅出现一条带 (1726bp)者为甲醇利用慢型(Muts)，出现两条带(上述条带及2. 2Kb条带)者为甲醇利用 快型(Mut+)。实施例3将实施例2经G418筛选和表型鉴定为阳性的酵母转化子在甲酵诱导下表达 LIGHT-Fc融合蛋白，具体步骤如下1.在毕赤酵母中诱导表达LIGHT-Fc融合蛋白(1)挑取单克隆，接种至5ml YPD培养基中，30°C，250rpm振荡培养16_18h。(2)取200 μ 1菌液接种于20mL BMGY培养基中，30°C，250rpm振荡培养至OD6tltl = 2-6。(3)室温，1500-3000rpm 离心 5min，去上清。(4)用无菌水洗涤菌体沉淀一次。(5)用BMMY培养基重悬菌体沉淀(若为Mut+型转化子，则加入等体积的BMMY培养基，若为Muts型转化子，则加入1/5倍体积的BMMY培养基)，30°C，250rpm振荡培养96h， 每隔24h补加甲醇一次。(6)分别在011、1211、2411、3611、4811、6011、7211、8411、9611取 ImL 培养基至 Ependorf管 中，离心，分离培养及和菌体沉淀，分析表达水平，以确定收集菌体的最佳时间。2. LIGHT-Fc融合蛋白表达情况的鉴定(I)Trizol法抽提酵母重组子的总RNA，以oligo dT(20)为引物进行反转录，并以 Primer 1和Primer 2为引物进行PCR反应，若含有LIGHT片断，则说明目的基因可以在酵 母中进行转录反应。(2)酵母重组子经过诱导表达后，收集培养基，加入SDS上样缓冲液，进行 SDS-PAGE电泳分析。(3)以鼠抗人LIGHT血清为一抗，以HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，WesternBlot 鉴定人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重组子中的表达。RT-PCR结果显示，有一特异性DNA条带出现(见图5所示)。SDS-PAGE检测结果 显示，在相对分子量45KD 66. 2KD之间有一特异性条带(见图6所示)，与预期融合蛋白 的分子量相同。Western blot结果显示，该蛋白具有很好的特异性，可与鼠抗人LIGHT抗体 发生特异性结合(见图7所示)，证实该表达蛋白是LIGHT-Fc融合蛋白。
权利要求
1.一种人LIGHT-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc的构建①人LIGHT胞外段cDNA的PCR扩增根据GenBank公布的人LIGHT基因序列设计如下引物Primer 1 5' -CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG-3 ‘，划线部分为 EcoR I 酶切位点， 178-197Primer 2:5' -CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT-3 ‘，划线部分为 BamH I 酶切位点， 701-720以pET32a-LIGHT重组质粒为模板，进行PCR反应扩增人LIGHT胞外段基因；②将含Fc片段的重组质粒pKS-IL-15-Fc用EcoRI和BamH I双酶切后回收含pKS载 体和Fc的大片段，与用EcoR I和BamH I双酶切后的PCR产物于16°C过夜连接，经转化和 酶切鉴定后得到pKS-LIGHT-Fc重组质粒；③EcoRI和Not I双酶切pKS-LIGHT-Fc重组质粒回收LIGHT-Fc融合基因，与用相同 限制性内切酶双酶切的PPIC9K质粒于16°C过夜连接，酶切鉴定及测序正确的重组质粒命 名为pPIC9K-LIGHT-Fc ；(2)人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定①将构建的重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc用SalI酶切线性化，同时将空载体pPIC9K相 同酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；电转化GS115感受 态细胞，涂布MD平板，所得的his+转化子又涂布含不同浓度G418的YPD平板，获得高G418 抗性的阳性克隆；②提取多拷贝转化子的基因组，以基因组为模板，PCR扩增其Aoxl基因，琼脂糖凝胶电 泳鉴定，仅出现一 1726bp条带者为甲醇利用慢型，即Muts型，出现上述条带及一 2. 2Kb条 带者为甲醇利用快型，即Mut+型；(3)人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达①在毕赤酵母中诱导表达LIGHT-Fc融合蛋白将筛选出的重组子接种5ml YPD试管，30°C，250rpm振荡培养16_18h，再以接种量 接种至20mL BMGY培养基中，30°C，250rpm振荡培养至OD6tltl = 2-6，离心收集菌体。若为 Mut+型转化子，则加入等体积的BMMY培养基重悬，若为Muts型转化子，则加入1/5倍体积的 BMMY培养基重悬；30°C，250rpm振荡培养96h，每隔24h补加甲醇至0. 5%，分别在Oh、12h、 24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取ImL培养基分析表达水平，以确定最佳收菌时间；②LIGHT-Fc融合蛋白的鉴定A)抽提诱导后酵母菌体的总RNA，以Primer1、Primer 2为引物进行RT-PCR反应；B)重组子经过甲醇诱导后，收集其培养基，加入上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳；C)以鼠抗人LIGHT血清为一抗，以HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，WesternBlot鉴定 人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重组子中的表达。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述酵母电转化的条件为电压1500V，电容 25uF,电阻 200 Ω。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述G418的最大浓度为4.Omg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白的方法，步骤包括(1)构建重组表达质粒pPIC9K-LIGHT-Fc；(2)表达人LIGHT-Fc融合蛋白酵母工程菌的制备及筛选；(3)人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定。本发明弥补了传统人LIGHT制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化人LIGHT蛋白的生产，则具有操作简单，原料生物体生长周期短，生产规模大(可以高密度发酵)，提取成本低，产物活性高等优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。
文档编号C12N15/62GK101993883SQ201010190548
公开日2011年3月30日 申请日期2010年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者杜佳妮, 樊燕, 江文正, 郝文丽, 闻洁君 申请人:华东师范大学