专利名称：一种扇贝酚氧化酶的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及双壳贝类的酚氧化酶分离纯化技术的改进，具体涉及一种扇贝酚氧化 酶的分离纯化方法，属于贝类免疫学技术领域。
背景技术：
扇贝是低等无脊椎动物，通过非特异性免疫抵御外来病原体的入侵。酚氧化酶 (phenoloxidase，简称P0)是非特异性免疫的重要因子之一，在微生物多糖等诱导下被激 活，催化有关底物生成醌，最终产生黑色素。PO催化反应生成的一系列产物能够限制和隔离 外来物；抑制病原菌胞外蛋白质和几丁质的活性；杀死病原体；愈合伤口 ；起到调理作用； 促进血细胞吞噬和包囊；介导凝集、凝固和其他杀菌物质的产生。目前在无脊椎动物中，PO 的分离纯化大多采用中性盐(主要指硫酸铵)盐析结合柱层析(阴离子交换层析、疏水层 析、葡聚糖凝胶层析、琼脂糖凝胶层析、亲和层析和等电聚焦层析)的方法。扇贝体内PO的 含量非常低，并且其活性对外界环境非常敏感而极易失活，盐析与柱层析结合的方法耗时 长(至少需要72小时)、处理步骤繁多无法在纯化的过程中保持PO活性，并且该方法目的 蛋白回收率低。因此需要开发一种简便高效的分离提纯扇贝PO的方法。非变性电泳(nat i ve-PAGE)，是一种快速、简便的蛋白分析鉴定技术，其最大 限度的保持蛋白在生物体内所具有的特性，常与底物发色技术相结合用以确定酶的分 子量和同工酶，而连续梯度非变性电泳能够更高效准确地分离目标蛋白。电洗脱技术 (electroelution)是一种用于回收凝胶中蛋白的电泳技术。目前，应用连续梯度非变性电 泳_特异性底物发色_电洗脱等技术的综合，在分离纯化无脊椎动物PO方面的研究还未见 相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便、高效的扇贝酚氧化酶的分离纯化方法。本发明通过连续梯度非变性电泳分离扇贝的酚氧化酶，再以特异性底物发色方法 确定目的蛋白位置，并通过电洗脱法回收目的蛋白得到纯化的酚氧化酶；最后通过电泳验 证提纯出的酚氧化酶纯度及其亚基组成并应用生理生化方法确定提纯的酚氧化酶生物学 活性和酶学特性。本发明的技术方案包括以下步骤(1)从扇贝的闭壳肌获得血淋巴，经离心、重 悬、破碎后离心取上清，获得血细胞破碎液上清；(2)以血细胞破碎液上清为样品进行连续 梯度非变性电泳；(3)以邻苯二酚为特异性底物发色，定位酚氧化酶蛋白带；(4)对目的带 进行切胶，通过电洗脱法回收酚氧化酶蛋白带，经透析冻干后得到提纯的扇贝酚氧化酶。按所述的扇贝酚氧化酶的分离纯化方法分离纯化海湾扇贝(Argopecten irradians)P0和栉孔扇贝(Chlamys farreri)P0，得到结果如下纯化后的海湾扇贝PO和 栉孔扇贝PO经连续梯度非变性电泳检测均仅呈现一条带，分子量分别为477kDa和408kDa 左右；经变性电泳检测两种PO均只有一条带，海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO分子量分别为54kDa和80kDa左右，表明这两种PO仅由一种亚基组成；经酶标板法测PO生物学活性和 酶学特性，结果显示在海湾扇贝中，纯化后的PO总活力(U)是纯化前样品总活力(U)的 73. 14%，纯化后PO特异性活力(U/mg)是纯化前样品特异性活力(U/mg)的413. 08倍；在 栉孔扇贝中，纯化后的PO总活力(U)是纯化前样品总活力(U)的72. 16%，纯化后PO特异 性活力(U/mg)是纯化前样品特异性活力(U/mg)的533. 33倍；两种酶的活力均可受到温 度、PH、二价金属离子和PO抑制物的影响，对不同底物也表现出不同的亲和力，具有一定的 底物专一性。本发明的优点在于①以血细胞破碎液上清为样品，通过连续梯度非变性电泳与 特异性底物发色和电洗脱技术结合起来，实现了扇贝PO的纯化，全过程耗时短(大约需要 48小时)，有利于较好的保持酶的活性；②只需要电泳/洗脱与特异性底物发色等技术即可 达到PO的纯化，设备要求简单，成本低，操作简便，且大大减少了对样品的处理步骤，在保 持对蛋白的较高分离能力的同时也有利于保持酶的活性；③提纯的样品纯度高，通过非变 性与变性电泳检测只呈现一条带，并且目的蛋白回收率高，很好的保持了酶的生物活性，提 高了提纯效率。
图1为本发明提纯的海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO电泳图。其中，(A)为连续梯度非变性电泳结果；⑶为变性电泳结果。图2为温度对本发明提纯的海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO活力的影响图。图3为pH对本发明提纯的海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO活力的影响图。图4为二价金属离子对本发明提纯的海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO活力的影响图。其中，(A)为海湾扇贝结果；(B)为栉孔扇贝结果。图5为本发明提纯的的海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO动力学参数图。其中，(A)为海湾扇贝结果；(B)为栉孔扇贝结果。参见图1-图5:图I(A)表示连续梯度非变性电泳图。其中1是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染 色结果；2表示海湾扇贝血细胞破碎液上清考马斯亮蓝染色结果；3表示栉孔扇贝血细胞破 碎液上清考马斯亮蓝染色结果；4表示纯化后的海湾扇贝PO考马斯亮蓝染色结果，分子量 约为477kDa ；5表示纯化后的栉孔扇贝PO考马斯亮蓝染色结果，分子量约为408kDa ；6表 示海湾扇贝血细胞破碎液上清电泳后以邻苯二酚为底物发色的结果，分子量约为477kDa ； 7表示栉孔扇贝血细胞破碎液上清电泳后以邻苯二酚为底物发色的结果，分子量约为 408kDa。图I(B)表示变性电泳图。其中1是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；2表 示纯化后的海湾扇贝PO考马斯亮蓝染色结果，分子量约为54kDa;3表示纯化后的栉孔扇贝 PO考马斯亮蓝染色结果，分子量约为80kDa。图2表示温度对本发明提纯的海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO活力的影响，海湾扇贝 PO活力最适温度约为40°C左右，当温度高于或低于40°C时，酶的活力随着温度的升高或降 低而下降；栉孔扇贝PO活力最适温度约为30°C左右，当温度高于或低于30°C时，酶的活力 随着温度的升高或降低而下降。图3表示pH对本发明提纯的海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO活力的影响，海湾扇贝PO和栉孔扇贝PO活力最适pH约8. 0左右，当pH高于或低于8. 0时，酶的活力随着pH的升高 或降低而下降。图4㈧表示二价金属离子对本发明提纯的海湾扇贝PO活力的影响，Ca2+、Mg2+对 酶活力有明显促进作用，Fe2+、Mn2+对酶活力有明显抑制作用，Cu2+、Zn2+对酶活力影响随金 属离子浓度不同而不同；图4(B)表示二价金属离子对本发明提纯的栉孔扇贝PO活力的影 响，Ca2+、Mg2+对酶活力有明显促进作用，Fe2+对酶活力有明显抑制作用，Cu2+、Zn2+、Mn2+对酶 活力的影响随金属离子浓度不同而不同。图5 (A)表示本发明提纯的海湾扇贝PO动力学参数，该PO对三种底物L-DOPAdP 苯二酚、对苯二酚的米氏常数Km分别为0. 51mM、0. 23mM、0. 87mM ；图5 (B)表示本发明提纯 的栉孔扇贝PO动力学参数，该PO对三种底物L-D0PA、邻苯二酚、对苯二酚的米氏常数Km分 别为 0. 61mM、0. 2mM、0. 84mM。
具体实施例方式下面结合附图并通过具体实施例进一步说明本发明。实例1 连续梯度非变性电泳-特异性底物发色-电洗脱法分离纯化海湾扇贝 (Argopectenirradians) PO(1)制备血细胞破碎液上清①用灭菌注射器从海湾扇贝的闭壳肌取血，离心(4°C，3000rpm, 15min)，收集血细 胞沉淀，大约IOOml血淋巴离心得到的血细胞沉淀用1. 5ml预冷至4°C的20mM Tris-HCl缓 冲液(pH 7. 0)重悬；②将血细胞悬液用超声波破碎仪在4°C条件下破碎，离心(4°C，14000rpm， 30min)，取上清，即为血细胞破碎液上清。(2)以血细胞破碎液上清为样品进行连续梯度非变性电泳①配制pH 8. 8Tris-Glycin 非变性电泳缓冲液(6. 06g Tris, 28. 82g Glycin，2L Dff)，预冷至4°C。②用恒流泵配制丙烯酰胺浓度范围为6% -20%的连续梯度分离胶，浓缩胶浓度 为5%，胶中不含十二烷基硫酸钠(SDS)。③将血细胞破碎液上清与等体积不含SDS和变性剂的样品缓冲液混合，每孔加样 110μ 1，4°C条件下恒功率3W电泳12h。(3)以邻苯二酚为特异性底物发色，定位非变性电泳的PO蛋白带将电泳后的凝胶中的一条泳道切下，浸于邻苯二酚溶液中，发色5分钟左右至 出现棕红色条带。(4)电洗脱法回收PO蛋白，经透析冻干后得到提纯的海湾扇贝PO蛋白①参照邻苯二酚发色结果，将其余未发色凝胶中含有PO的条带切下，在pH 8. 8Tris-Glycin非变性电泳缓冲液中，4°C条件下恒电流20mA电洗脱12h(Model 422， Bio-Rad)。②洗脱后得到的溶液于4°C条件下在蒸馏水中透析12h，每3h换一次蒸馏水。③对透析后得到的溶液进行真空冷冻干燥，得到的蛋白即为海湾扇贝P0。(5)连续梯度非变性电泳和变性电泳法鉴定提纯的海湾扇贝PO蛋白纯度和亚基分子量①连续梯度非变性电泳鉴定提纯的海湾扇贝PO蛋白纯度a 配制 pH 8. 8Tris-Glycin 非变性电泳缓冲液(6. 06g Tris, 28. 82g Glycin，2L Dff)，预冷至4°C。b用恒流泵配制丙烯酰胺浓度范围为6% -20%的连续梯度分离胶，浓缩胶浓度为 5%，胶中不含十二烷基硫酸钠(SDS)。c将提纯的海湾扇贝PO水溶液与等体积不含SDS和变性剂的样品缓冲液混合，每 孔加样110μ 1，4°C条件下恒功率3W电泳12h，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色。②变性电泳(SDS-PAGE)确定海湾扇贝PO蛋白亚基组成a配制pH 8. 8Tris_Glycin变性电泳缓冲液(3. 03g Tris, 14. 41g Glycin, Ig SDS, IL Dff)b配制分离胶浓度为12%、浓缩胶浓度为5%的聚丙烯酰胺凝胶，胶中含0. 15% SDSc将提纯的海湾扇贝PO水溶液与等体积含SDS和β -巯基乙醇的样品缓冲液混 合，在沸水中煮3-5min，将处理过的样品加入上样孔中，每孔上样20 μ 1 ；d在恒流条件下，起始时用低电流(30_40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线 后，加大电流(50-70mA)，电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶，用 考马斯亮蓝染色。结果如图1所示在连续梯度非变性电泳中，本发明分离纯化的海湾扇贝PO只呈 现一条带，分子量为477kDa左右；在变性电泳中，本发明分离纯化的海湾扇贝PO也呈现一 条带，分子量约为54kDa，表明本发明的连续梯度非变性电泳-特异性底物发色-电洗脱 方法成功的从海湾扇贝血细胞破碎液上清中分离纯化了 P0，并具有较高纯度，该PO是由 54kDa左右的亚基组成的寡聚体。(6)对本发明提纯的海湾扇贝PO的生化和酶学特性的分析①海湾扇贝PO活力的测定采用酶标板法，每孔中加10 μ 1 15mM L-DOPA (溶于pH 7. 0、20mM Tris-HCl缓冲 液)与10 μ 1待测样品(血细胞破碎液上清或提纯后的PO水溶液)，混勻后于37°C孵育 40min，然后加入200μ 1 0°C蒸馏水，使用酶标仪在492nm波长下测定光吸收。PO活力定义 为光吸收值每分钟增加0. 001为1个活力单位(U)。Bradford法测蛋白浓度，使用牛血清 白蛋白(BSA)作为标准蛋白。样品的PO特异性活力定义为U/mg蛋白。②温度对提纯后的海湾扇贝PO活力的影响选取6个温度梯度10°C、20°C、30°C、40 V、50°C、60 V，分别在这6个温度下按照酶 标板法测定提纯后的PO特异性活力，每个温度梯度做三个重复。③pH对提纯后的海湾扇贝PO活力的影响选取6个pH梯度，5、6、7、8、9、10，分别在这6个pH下按照酶标板法测定提纯后的 PO特异性活力，每个PH梯度做三个重复。④二价金属离子对提纯后的海湾扇贝PO活力的影响10 μ IPO 水溶液分别与 10 μ 1 不同浓度的 MgSO4, ZnSO4, MnCl2, FeCl2, CuSO4, CaCl2 (溶于pH 7.0、20mM Tris-HCl缓冲液)溶液于4°C条件下在酶标板中预先孵育20min，
6然后每孔加入10μ1 15mM L-DOPA(溶于pH 7. 0、20mM Tris-HCl缓冲液)，37°C条件下孵育 40min，最后每孔加入190 μ 10°C蒸馏水，用酶标板法测定PO特异性活力。每种金属离子的 每个浓度做三个重复，对照组以20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7. 0)取代金属离子溶液。⑤PO抑制物对提纯后的海湾扇贝PO活力的影响10μ IPO水溶液分别与10μ 1不同浓度的常见PO抑制物(溶于pH 7. 0、20mM Tris-HCl缓冲液)，半胱氨酸、抗坏血酸维生素C、亚硫酸钠、柠檬酸、硫代尿素、叠氮钠、乙 二胺四乙酸二钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠，于4°C条件下在酶标板中预先孵育20min，然 后每孔加入10μ 115mM L-DOPA(溶于pH 7. 0、20mM Tris-HCl缓冲液)，37°C条件下孵育 40min，最后每孔加入190 μ 10°C蒸馏水，用酶标板法测定PO特异性活力。每种PO抑制物的 每个浓度做三个重复，对照组以20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)取代PO抑制物溶液。⑥海湾扇贝PO动力学参数测定10 μ IPO水溶液分别与10 μ 1不同浓度的四种底物(溶于pH7. 0、20mM Tris-HCl 缓冲液)，L-D0PA、邻苯二酚、对苯二酚、酪氨酸，于37°C条件下在酶标板中孵育40min，然后 每孔加入200 μ 1 0°C蒸馏水，采用酶标板法测定PO活力，使用Lineweaver-Burk双倒数作 图法求得PO对上述四种底物的米氏常数。每种底物的每个浓度做三个重复。结果海湾扇贝PO纯化效率如表1所示表1海湾扇贝PO纯化效率 经过纯化后的海湾扇贝PO总活力⑶是纯化前样品总活力⑶的73. 14%,纯化 后的海湾扇贝PO特异性活力(U/mg)是纯化前样品特异性活力(U/mg)的413. 08倍。PO抑制物对纯化后的海湾扇贝PO活力的影响如表2所示表2P0抑制物对纯化后的海湾扇贝PO活力的影响 在上述PO抑制物中，亚硫酸钠对纯化的海湾扇贝PO活力抑制作用最强，抗坏血 酸维生素C和二乙基二硫代氨基甲酸钠有显著抑制作用，半胱氨酸和柠檬酸有明显抑制作 用，乙二胺四乙酸二钠抑制作用相对较弱，硫代尿素和叠氮钠无抑制作用。如图2所示，纯化的海湾扇贝PO活力的最适温度为40°C ；如图3所示，最适pH为 8.0左右；如图4㈧所示，Ca2+、Mg2+对纯化的海湾扇贝PO活力有明显促进作用，Fe2+、Mn2+ 对PO活力有明显抑制作用，Cu2+、Zn2+对PO活力的影响随其浓度不同而改变。如图5(A) 所示，海湾扇贝PO对三种底物，L-D0PA、邻苯二酚、对苯二酚的米氏常数Km分别为0. 51mM、 0. 23mM、0. 87mM,但酪氨酸不被该PO催化。实例2 连续梯度非变性电泳_特异性底物发色_电洗脱法分离纯化栉孔扇贝 (Chlamysfarreri)PO(1)制备血细胞破碎液上清①用灭菌注射器从栉孔扇贝的闭壳肌取血，离心(4°C，3000rpm, 15min)，收集血细 胞沉淀，大约IOOml血淋巴离心得到的血细胞沉淀用1. 5ml预冷至4°C的20mM Tris-HCl缓 冲液(pH 7. 0)重悬；②将血细胞悬液用超声波破碎仪在4°C条件下破碎，离心(4°C，14000rpm， 30min)，取上清，即为血细胞破碎液上清。(2)以血细胞破碎液上清为样品进行连续梯度非变性电泳同实例1中步骤(2)，将样品替换为栉孔扇贝血细胞破碎液上清。(3)以邻苯二酚为特异性底物发色，定位非变性电泳的PO蛋白带同实例1中步骤(3)。(4)电洗脱法回收PO蛋白，经透析冻干后得到提纯的栉孔扇贝PO蛋白同实例1步骤(4)。
(5)连续梯度非变性电泳和变性电泳法鉴定提纯的栉孔扇贝PO蛋白纯度和亚基 分子量同实例1中步骤(5)，将样品替换为提纯的栉孔扇贝PO水溶液。结果如图1所示在连续梯度非变性电泳中，本发明分离纯化的栉孔扇贝PO只呈 现一条带，分子量为408kDa左右；在变性电泳中，本发明分离纯化的栉孔扇贝PO也呈现一 条带，分子量约为80kDa，表明本发明的连续梯度非变性电泳-特异性底物发色-电洗脱 方法成功的从栉孔扇贝血细胞破碎液上清中分离纯化了 P0，并具有较高纯度，该PO是由 54kDa左右的亚基组成的寡聚体。(6)对本发明提纯的栉孔扇贝PO的生化和酶学特性的分析同实例1中步骤(6)，将样品替换为栉孔扇贝血细胞破碎液上清或提纯的栉孔扇 贝PO水溶液。结果栉孔扇贝PO纯化效率如表3所示表3栉孔扇贝PO纯化效率 经过纯化后的PO总活力⑶是纯化前样品总活力⑶的72. 16%，纯化后PO特异 性活力(U/mg)是纯化前样品特异性活力(U/mg)的533. 33倍。PO抑制物对纯化后的栉孔扇贝PO活力的影响如表4所示表4P0抑制物对纯化后的栉孔扇贝PO活力的影响 在上述PO抑制物中，亚硫酸钠与抗坏血酸维生素C对纯化的海湾扇贝PO活力抑 制作用最强，二乙基二硫代氨基甲酸钠有显著抑制作用，半胱氨酸和柠檬酸有明显抑制作 用，乙二胺四乙酸二钠抑制作用相对较弱，硫代尿素和叠氮钠无抑制作用。如图2所示，纯化的栉孔扇贝PO活力的最适温度为40°C ；如图3所示，最适pH为 8.0左右；如图4(B)所示，Ca2+、Mg2+对纯化的栉孔扇贝PO活力有明显促进作用，Fe2+对酶活 力有明显抑制作用，Cu2+、Zn2+、Mn2+对酶活力的影响随金属离子浓度不同而不同。如图5(B) 所示，纯化的栉孔扇贝PO对三种底物，L-D0PA、邻苯二酚、对苯二酚的米氏常数Km分别为 0. 61mM、0. 2mM、0. 84mM，但酪氨酸不被该PO催化。本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行 修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
一种扇贝酚氧化酶的分离纯化方法，其特征在于它包括以下步骤(1)从扇贝的闭壳肌获得血淋巴，经离心、重悬、破碎后离心取上清，获得血细胞破碎液上清；(2)以血细胞破碎液上清为样品进行连续梯度非变性电泳；(3)以特异性底物发色法定位非变性电泳的酚氧化酶蛋白带；(4)对目的带进行切胶，通过电洗脱法回收酚氧化酶蛋白带，经透析冻干后得到提纯的扇贝酚氧化酶蛋白。
2.根据权利要求1所述的扇贝酚氧化酶的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)所述的 扇贝为海湾扇贝酚或栉孔扇贝。
3.根据权利要求1所述的扇贝酚氧化酶的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)所述的 特异性底物为邻苯二酚。
全文摘要
本发明公开了一种扇贝酚氧化酶的分离纯化方法，其特征在于它包括以下步骤(1)从扇贝的闭壳肌获得血淋巴，经离心、重悬、破碎后离心取上清，获得血细胞破碎液上清；(2)以血细胞破碎液上清为样品进行连续梯度非变性电泳；(3)以特异性底物发色法定位非变性电泳的酚氧化酶蛋白带；(4)对目的带进行切胶，通过电洗脱法回收酚氧化酶蛋白带，经透析冻干后得到提纯的扇贝酚氧化酶蛋白。本发明的优点在于①提纯时间短；②操作简便，设备要求简单，成本低，且大大减少了对样品的处理步骤；③提纯的样品纯度高，通过非变性与变性电泳检测只呈现一条带，并且很好的保持了酶的生物活性，提高了提纯效率。
文档编号C12N9/02GK101899425SQ20101019133
公开日2010年12月1日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者战文斌, 绳秀珍, 蒋经伟, 邢婧 申请人:中国海洋大学