专利名称：：重组人sCTLA4-Ig融合蛋白基因及其药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物制药领域，涉及一种溶细胞性T细胞相关抗原4的融合蛋白基因，更特别的，本发明涉及一种重组人sCTLA4-Ig融合蛋白基因及其药物组合物。
背景技术：
：艮卩溶细胞性T纟田胞相关抗原4(CytotoxicTLymphocyteassociateAntigen—4，CTLA-4，又称CD152)，是表达在活化T细胞表面的标志性分子之一。研究表明，该成分是维持体内T细胞稳定性的负调控因子，具有抑制活化T-细胞的增值的功能，与CD28构成了一对十分重要的免疫调节因子。目前，它被作为免疫抑制受体进行了广泛的研究，在临床上有可能作为抑制免疫排斥反应的制剂进行应用。T-细胞、抗原提呈细胞表面参与产生共刺激作用的分子统称为共刺激分子。目前公认最重要的共刺激通道为B7-CD28共刺激通路。B7位于抗原提呈细胞，与T细胞表面的CD28分子结合可以产生共刺激。当T细胞激活后，其细胞表面会出现另外一种可以与B7细胞结合的分子CTLA4。CTLA4与B7的亲和力很高，该分子与B7细胞结合后可以诱导B7细胞的调亡。因此目前认为它对T细胞激活有负调节作用，对于维持人体内免疫状态的平衡起重要作用。CTLA4还可以与CD80和CD86结合，它们的亲和力比CD28明显高，其功能与CD28相反，对T细胞有负调节作用。CTLA-4是一种极性跨膜蛋白。将这种蛋白的膜外可溶性部分与抗体分子的Fc片段的编码区融合在一起构成的融合基因sCTLA4-Ig，插入适当的载体，导入适当的细胞后可以得到一种天然不存在的融合蛋白，它既有细胞表面受体预期原有配体结合的能力，又有抗体分子一样的可溶性，半衰期和抗体分子接近，保持活3性时间比较长。利用人源基因获得的蛋白分子在体内不会引起免疫反应。目前已经由多种类似的可溶性融合蛋白质被制备出来并成功地用于临床。CTLA4的可溶性受体可以竞争性地与B7分子结合，而且其对B7的亲和力远远大于CD28，因此可以明显地抑制B7-CD28通道。sCTLA4-Ig与APC上表达的CD80(B7-l)和CD86(B7-2)的亲和力高于T细胞上表达的CD28与B7-l禾卩B7-2的亲和力。sCTLA4-Ig的作用是抑制CD28介导的T细胞共刺激作用。CD40/CD40L途径是另一组攻刺激分子，能刺激T和B细胞同时转化。如封闭CD40/CD4()L途径，能延长小鼠和灵长类的同种异体移植物存活。如果联合sCTLA4-Ig和抗CD40L单抗封闭这两种共刺激作用途径将显著延长移植物存活。鉴于T细胞在移植物排斥中的重要作用，目前临床使用和正在研制的绝大多数免疫抑制剂都作用于T细胞。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组人sCTLA4-Ig融合蛋白基因，其具有SEQIDNO:l所述的基因序列。本发明所要解决的技术问题还在于提供一种重组人sCTLA4-Ig融合蛋白药物组合物，所述的药物组合物中包含sCTLA4-Ig融合蛋白、海藻糖以及磷酸盐缓冲液。更特别的，所述的重组人sCTLA4-Ig融合蛋白药物组合物含有sCTLA4-Ig融合蛋白10-30mg/ml，含有海藻糖20-50mg/ml，溶解在100mM的磷酸盐缓冲液中。比如，其中可含有CTLA4-Ig融合蛋白20mg/ml，含有海藻糖40mg/ml，溶解在100mM的磷酸盐缓冲液中。更特别的，在制备所述的重组人sCTLA4-Ig融合蛋白的药物组合物时，可将液态的药物组合物制成冻干制剂，在施用时用蒸馏水重悬。更特别的，所述的重组人sCTLA4-Ig融合蛋白药物组合物可采取肌内给药、静脉内给药、皮下给药或皮内给药。在本发明中，"本发明的药物组合物"指含有sCTLA4-Ig融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物，可起到抑制机体免疫反应的作用。在本发明中，"(s)CTLA4-Ig融合蛋白"指由人CTLA-4可溶部分(sCTLA-4)与人Ig抗体Fc片段融合所形成的融合蛋白。海藻糖(ci-D-吡喃葡糖基-(-吡喃葡糖苷))是天然存在的非还原型二糖。海藻糖的形式包括结晶型的海藻糖二水合物(TD)，非结晶型海藻糖(AT)，也可以是无水形式的海藻糖，即无水非晶型海藻糖(AAT)和无水结晶海藻糖(ACT)。本发明中可使用任何物理形式的海藻糖，包括无水、部分水合、完全水合的海藻糖。在使用本发明的药物组合物时，是将安全有效量药物组合物用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10"gsCTLA4-Ig融合蛋白/Kg体重，而且在大多数情况下不超过约8mgsCTLA4-Ig融合蛋白/Kg体重，较佳地该剂量是约10ug/千克体重-约lmg/Kg体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况、年龄等因素。图1显示了本发明所用的表达载体pMG18-3K，标明了其中的元件及酶切位点。HCMVpro，人巨细胞病毒MajorImmediate早期启动子；Ck，人K链恒定区基因；CH，人Yl链恒定区基因；pA，多聚腺苷化信号；DHFR，二氢叶酸还原酶基因；pUCorigin,质粒复制起始位点；Amp为氨苄青霉素抗性基因。具体实施例方式实施例1重组人sCTLA-4融合蛋白的设计与制备1.重组人sCTLA-4基因的设计在本申请人的已有专利CN01132075.3中，己经公开了本申请人设计的重组人sCTLA-4融合蛋白基因结构，在本专利中，以改进蛋白的表达量和亲和力为出发点，本申请人对sCTLA-4的基因做了进一步的改进。基于上述已有专利，本发明参考一些基因表达的规律，根据已有的经验以及密码子的偏爱性，经过数百次的设计和改进，设计出了一段带有克隆表达操作序列的新的重组sCTLA-4基因(SEQIDNO:l):CATgctagcATGGCTATGCACGTCGCGCAGCCAGCCGTAGTTCTCGCGAGGAGCCGTGGAATGGCAAGTATA60GTCTGAGACTAAGCTTCCCCTGGAAAGGCAACGGACGTGCGAGTCACTGTCCTACGCCAT120GCAGAGAGGCACGTCACAGAGGTGTGAGCCGCTACGTAGAACACCGGAAAGGACTTCACG180TTGCTCGAAGAGTCGATATGGACCGGAACATCGAGAGGTAAGCAAGTCAAGCTGACAATT240CATGGTCTCAGCGCGATGGAGACCGGTCTGTAGATGTGGAACGTCGACCTGATGTAGCCT300CCACGTTAGTAGCTCGGAATCGGAAAGGGTAGGCACATATACGTCATAGAACCTGATCCC360TGGCCTGAATCAGAGTTGCTGCTGTGCATACTAGCTGCTGTAAGATCCGGCTTCTAATTA420TAAAGGTTGCTACTGACTGCAGTATCATTCAGGAATATGCTTAACAATAGTAGGCCACTA480ACTACTGGCGTGTAAGTCAATATGCCTCCCACTGACCCTGATTGAGATAACCATTTGCAT540CCTTAATTAATCGGAATGAATTGT5642.sCTLA-4/Fc融合基因的获得人IgGlFc片段的序列是已知的(参见例如Genebank登录号acc82527)。以前述的sCTLA4和带有全长IgGl基因的质粒pMG18-3K(图1，也可参考DEVELOPMENTOFTOOLSFORENVIRONMENTALMONITORINGBASEDONINCP-9PLASMIDSSEQUENCES.A.Greated,R.Krasowiak，M.Titok,C.M.ThomasSchoolofBiologicalSciences,UniversityofBirmingham,Edgbaston，BirminghamB152TT,UKandFacultyofBiology,DeptofMicrobiology,BelarusStateUniversityScorinaAv.4,Minsk220080Belarus)为模板，设计相应的引物，进行PCR(具体方法可参见本申请人的专利CN01132075.3)。在琼脂糖凝胶电泳上获得分子大小约为1233bp的单-条带后进行凝胶回收。获得的DNA按照常规方法克隆到pUC18载体上后转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选，通过酶切鉴定和测序，确认序列完全正确的克隆，即为sCTLA4/Fc。可选择的，还可以在sCTLA4和IgGl之间加上接头序列，为(Ala3Ser。5(SEQIDNO:2)，其基因序列为ACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3，(SEQIDNO:3)，即为sCTLA4/接头/Fc(具体方法可参见本申请人的专利CN01132075.3)。实施例2sCTLA-4融合蛋白的表达融合基因表达载体的构建6将前述构建的pUC18[sCTLA-4/Fc]和pUC18[sCTLA-4/接头/Fc]正确克隆接种于含有氨苄青霉素的20ml液体LB培养基，37'C培养过夜，用Promega公司的Midi质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提质粒DNA，各得质粒DNA约30微克。分别用NheI禾卩Xho1(Phamarcia)(10U/pl)消化pUC18[sCTLA-4/Fc]，pUC18[sCTLA-4/接头/Fc]和表达质粒pMSG(Phamarcia)。酶切反应37。C反应过夜。酶切产物在0.8%琼脂糖电泳上进行分离鉴定，用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收大小约为1500bp的片段。分别用T4DNA连接酶(10U/pl)将sCTLA-4/Fc或sCTLA-4/接头/Fc连接到pMSG载体的NheI和XhoI位点。按照常规方法(见Sambrook等，1989)用连接所得重组pMSG转化大肠杆菌DH5a菌株，并在IPTG/X-Gal平板培养基上进行蓝白斑筛选。各取白斑12个接种于LB液体培养基37t:培养后抽取质粒如前所述进行酶切鉴定，每种融合基因至少获得4个具有正确大小的插入片段的克隆，作为候选克隆。将上述候选克隆中的两个进行DNA测序。根据测序结果，分别确认插入片段的序列与设计的完全一致。将所得的正确克隆分别记作pMSG[sCTLA4/Fc]、pMSG[sCTLA4/接头/Fc]。2.CHO细胞的转化与表达取带有上述2种重组pMSG的大肠杆菌菌株，分别接种于500ml加入了氨苄青霉素的2xYT液体培养基，37°C，260rpm震荡培养16小时。用Qiagen公司的"UltrapurePlasmidPurificationKit"抽提质粒DNA，抽提过程按照厂家提供的说明书进行。用脂质体法转染CHO细胞，转染试剂盒购自Invitrogene公司。转染时分别取上述纯化的pMSG[sCTLA4/接头/Fc]、pMSG[sCTLA4/Fc]质粒100微克作为DNA样品对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选，其浓度从0.05pM到lO)iM，每两周增加一次浓度，每次MTX的用量约为前一次的2倍，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为15%胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37'C，5%(302培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。应用ELISA方法分别检测其融合蛋白的表达量，总共得到pMSG[sCTLA4/接头/Fc]克隆152个、pMSG[sCTLA4/Fc]克隆128个。在DEME培养基中常规培养，用ELISA对上述部分克隆sCTLA-4的表达强度进行了研究，具体数据如下表表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上数据说明，本发明的重组sCTLA-4基因显著提高了融合蛋白的表达水平，比原有的水平提高了大约一个数量级(IO倍)。实施例3sCTLA-4融合蛋白抑制淋巴细胞增殖能力的研究将上述pMSG[sCTLA4/接头/Fc]和pMSG[sCTLA4/Fc]的表达细胞株培养后用A蛋白-Sepharose进行亲和层析，获得纯度达90%以上的融合蛋白。1.常规分离人外周血淋巴细胞(PBMC)，调整细胞密度为2xl06cells/ml，PBMC和等体积培养液混合后以2xl05cells/0.2ml/孔接种"U"型96孔培养板，加入不9同量的纯化融合蛋白，设置等体积相应空载体转染上清或培养基作对照，每组3复孔，37°C，5。/。C02培养5d，终止培养前16h加入3H陽TdR(终浓度5^Ci/ml),收集细胞于0.45pm微孔滤膜上，烘干，液体闪烁计数仪测DPM值。2.结果以5士s表示，MicrosoftExcel统计程序进行均数差异显著性分析。3.在MLR反应(LinsleyPS，BradyW,UrnesM,etal.CTLA-4isasecondreceptorfortheBcellactivationantigenB7[J]JExpMed,1991,174(3):561-569.)体系中，分别加入1微克、5微克和10微克ProteinA纯化纯化的sCTLA4/接头/Fc、sCTLA4/Fc或空载体转染CHO细胞上清，结果表明，即使加入l微克A蛋白纯化的融合蛋白，也能显著抑制人外周血MLR，抑制率为60%70%;而加入同样体积的空载体转染CHO细胞上清，则无此作用，经单因素方差分析，结果有统计学意义。同样，我们也曾用未纯化的转染细胞的上清直接进行MLR实验，未能观察到显著的抑制作用，这可能与未纯化细胞转染上清中异源蛋白的刺激作用与微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有关。实施例4本发明的药物组合物的制备首先配制lOOmM的磷酸盐缓冲液，并且调节缓冲液的PH值，使其在PH7.0左右。在磷酸盐缓冲液中加入适量的海藻糖，使其达到50mg/ml，接着加入sCTLA-4融合蛋白，使其达到50mg/ml，获得的药剂可以直接施用于哺乳动物(包括人)，如通过静脉注射的方式。另外，也可将本发明的药物组合物制成冻干制剂，以便于运输和贮藏。在需要施用时，可以用生理可用的溶剂将本发明的药物组合物进行重悬，比如可以使用蒸馏水迸行重悬。<110〉上海中信国健药业有限公司〈120〉重组人sCTLA4-Ig融合蛋白基因及其药物组合物<160〉3<210〉1〈211〉564<212>腿〈213〉聚核苷酸<400〉1GCTATGCACGTCGCGCAGCCAGCCGTAGTTGTCTGAGACTAAGCTTCCCCTGGAAAGGCAGCAGAGAGGCACGTCACAGAGGTGTGAGCCTTGCTCGAAGAGTCGATATGGACCGGAACACATGGTCTCAGCGCGATGGAGACCGGTCTGCCACGTTAGTAGCTCGGAATCGGAAAGGGTTGGCCTGAATCAGAGTTGCTGCTGTGCATATAAAGGTTGCTACTGACTGCAGTATCATTCACTACTGGCGTGTAAGTCAATATGCCTCCCCCTTAATTAATCGGAATGAATTGTCTCGCGAGGAGCCGTGGAATGGCAAGTATA60ACGGACGTGCGAGTCACTGTCCTACGCCAT120GCTACGTAGAACACCGGAAAGGACTTCACG180TCGAGAGGTAAGCAAGTCAAGCTGACAATT240TAGATGTGGAACGTCGACCTGATGTAGCCT300AGGCACATATACGTCATAGAACCTGATCCC360CTAGCTGCTGTAAGATCCGGCTTCTAATTA420AGGAATATGCTTAACAATAGTAGGCCACTA480ACTGACCCTGATTGAGATAACCATTTGCAT540564<210〉2<211〉25〈212〉PRT<213〉接头肽<400〉2AlaAlaAlaSerSerAlaAlaAlaSerSerAlaAlaAlaSerSerAla51015AlaAlaSerSerAlaAlaAlaSerSer2025<210〉3<211>7510<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>权利要求1.一种重组人sCTLA4-Ig融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由SEQIDNO1所述的基因序列编码。2.—种重组人sCTLA4-Ig融合蛋白药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含权利要求1所述的sCTLA4-Ig融合蛋白、海藻糖以及磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求2所述的重组人sCTLA4-Ig融合蛋白药物组合物，其特征在于，其中含有sCTLA4-Ig融合蛋白10-30mg/ml，含有海藻糖20-50mg/ml，溶解在100mM的磷酸盐缓冲液中。4.根据权利要求3所述的重组人sCTLA4-Ig融合蛋白药物组合物，其特征在于，将液态的药物组合物制成冻干制剂，在施用时用蒸馏水重悬。5.权利要求3—4中任何一种重组人sCTLA4-Ig融合蛋白药物组合物，其特征在于，采取肌内给药、静脉内给药、皮下给药、皮内给药中的任何一种方式。全文摘要本发明涉及生物制药领域，公开了一种在CHO等哺乳动物细胞中具有高的表达量的重组人sCTLA4-Ig融合蛋白基因。本发明还公开了一种特异性的免疫抑制剂药物组合物，其有效成分包含sCTLA4的细胞外区域和免疫球蛋白的恒定区域。本发明的药物组合物在体内可以与抗原提呈细胞表面的CTLA4配体相结合，从而阻断B7-1和/或B7-2与T细胞表面的CD28和/或CTLA4受体的结合，起到抑制机体免疫反应的作用。文档编号C07K19/00GK101519451SQ200910130178公开日2009年9月2日申请日期2005年4月5日优先权日2005年4月5日发明者盛侯,静陈申请人:上海中信国健药业有限公司