刺激神经再生的方法

专利名称：刺激神经再生的方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，特别是神经系统的医药生物领域。更具体地讲，本发明涉及刺激神经再生的方法，它适用于外周神经和中枢系统，特别是脊髓。由于其局部和特异性特征，本发明方法可以在各种病理状况中刺激神经再生，特别是在脊髓、外周神经、臂或腰神经丛的损伤中。
中枢及外周神经系统的损伤在伤科中是常见的。骨髓的无论源自外伤还是变性的损伤、外周神经的损伤、臂或腰神经丛的损伤迄今留给伤者或患者沉重的生活障碍。虽然外周神经系统具有强自发再生能力，但采用神经修复的常规技术只能产生不可靠的结果。这些技术主要包括直接吻合术或当张力太大无法缝合两个神经端时(实体缺失或由于神经过分撕破需要切除一段神经时)放置自体或异体的神经移值物。腕部接受了正中神经修复的病人中只有5％以下的人在5年后恢复正常的感觉和运动(1)。
最近，连接损伤神经末端的管形假器的使用(套管式连接技术)为这些神经修复常规技术提供了一种替代方法(2，3)。这一技术提供了简化重新对齐神经束的条件的优点，并已在实验中和临床上桥连一些小的实体缺失(最多5-7mm(1-6))中取得成功。但对于更长的实体缺失，在管中加入神经营养物质或细胞看来是必不可少的。在实验中已试验了体内用于支持管的多种因子如FGF-1、FGF-2或NGF(7-10)，或全身应用的CNTF或IGF II，但不是为了清楚揭示它们在神经再生中的作用(7-12)。另外，现在还没有一种治疗脊髓损伤的临床方法。
本发明提供创伤性或变性性神经损伤治疗问题的解决方案。本发明实际上涉及一种用生物相容性套管和神经营养因子编码核酸的组合物刺激神经再生的方法。本发明还涉及一种用于刺激神经再生的装置，其包括一种生物相容性套管和引入其中的神经生长刺激因子(神经营养因子)的表达系统。本发明的另一方面涉及用于刺激神经再生的药盒，其一方面包括一种生物相容性套管，另一方面包括含有神经生长刺激因子表达系统的组合物。本发明还涉及其中引入了神经营养因子表达系统的生物相容性套管在制备用于刺激神经再生的组合物中的应用。
本发明另外还适用于外周神经的再生及刺激脊髓中轴突的再生。
本发明来源于多个发现。它特别来源于如下发现借助于适当的装置可以在两段神经之间外科重建一个物理桥，并且可以在该装置中引入神经营养因子的表达系统。本发明还来源于这样的发现可以在足以刺激神经元生长的期间内引入局部浓集的营养因子。因而本发明联合了多种在治疗方面特别有利的特性。本发明首先允许持续的作用，这是因为营养因子的延迟释放作用。另外神经营养因子的生物效应被套管的支柱作用所增强，它可加速和引导神经元的生长。本发明方法还允许在创伤或变性部位的很局部因而很特异性的作用，营养因子被分隔在密封的装置中。实施例中给出的结果表明用本发明的方法可进行快速有效和局部的神经修复。
本发明方法特别在于神经段水平的局部干预。断开的神经或神经束的近段或远段被引入一生物相容性套管的一端，它被物理地固定在此处。然后将含有神经营养因子表达系统的组合物引入该套管中。该断开神经或神经束的另一端被引入套管的另一端，也被物理地固定。为了避免表达系统扩散到套管之外，最好将其用生物胶连接和/或固定在两末端处。该装置另外还允许表达系统的再次注入。同时存在支持物和高浓度的神经营养因子及持续时间长，如实施例中所示，可以重建神经连续性，从而恢复相应的活动。
具体到外周神经系统，本发明方法包括取损伤之下外周神经或神经根，在切除该神经或神经根的一部分后将其置于一生物相容性套管中。将该神经段的近端部分(无论它是运动神经或感觉神经)引入套管中并固定，例如通过缝合或放置生物胶。将编码活性因子的表达系统注射在套管中，留在原处。该神经段的远端部分被引入在套管的另一端，从而得以恢复轴突的连续性(图1)。
在中枢神系统，特别是脊髓，本发明方法也特别适用于脊髓损伤的桥接。这种类型的创伤另外构成本发明系统的主要应用之一，对于这种创伤迄今还没有任何临床治疗方法。可以设想两种类型的应用方法将损伤之下的外周传入神经与该损伤之上的健康脊髓桥接(图5)，或将损伤之上的健康脊髓与该损伤之下的脊髓桥接(图6)。
在第一种情况下，脊髓损伤之下的一个或多个神经根被切割、引入管形假器(套管)中并通过缝合和生物胶固定。该支持管这时可以接受携带可刺激运动神经元轴突延长之基因的表达系统；和/或任选的用于刺激轴突重新生长的各种已知因子如外周神经移植物，或细胞。然后将该支持管引入在损伤之上的健康脊髓中所作的纵向切口中，使该管的近端与灰质前角(脊髓运动神经元定位处)对齐。通过一根或多根与蛛网膜的缝线和生物胶将该支持管固定(图5B)。这种装配因而可以恢复某些重要肌肉的功能。
在第二种情形下，切去脊髓的破碎部分，在上下游间植入一个支持管，以连接损伤的上下部分之间的主要神经束(锥体束、皮质脊髓束等)(图6)。然后在该支持管中充满前述物质。
在本发明中，神经段的近端部分或神经的近端部分指与中枢神经系统接触的神经部分。对于外周神经，其近端部分是与脊髓连接的部分。对于脊髓的损伤，近端部分是与中枢神经系统接触的部分。
还应理解，神经段的远端部分或神经的远端部分指神经的外周部分。对于外周神经，其远端部分是与运动板块(神经肌肉结)相连的部分。对于脊髓损伤，远端部分是与中枢神经系统失去连接的部分。
为实施本发明，套管可以是与治疗应用相适应的任何装置。套管的结构和组成最好按如下定义(i)它恢复轴突的连续性，(ii)它能包含包括活性因子表达系统的组合物，(iii)它能作为轴突再生长的支柱，包括脊髓向外周，外周向脊髓，和脊髓向脊髓。套管的支柱特性通过神经能粘附和在其上(特别是其内表面)生长的特性来起作用。粘附可以是任何能导致细胞在套管上附着和/或固定的生物和/或化学和/或物理相互作用形式的结果。另外，对于人类的治疗应用，还希望套管是不透性的或半透性的，但不会让表达系统通过。
最好，该套管是生物相容的无毒固体支持物。特别可以是由诸如聚硅氧烷、PAN/PVC、PVFD、聚四氟乙烯(PTFE)纤维或丙烯酸共聚物等合成材料组成的套管。在一种特别的实施方案中，优选使用由或主要由生物材料(特别是交联胶原、骨粉)、基于碳水化合物的聚合物、聚乙醇酸/聚乙酸衍生物、透明质酸酯、或基于钙质的支持物构成的套管。在本发明中优选使用胶原或聚硅氧烷。可以用源自人、牛或鼠的胶原。更优选使用由I、III或IV型胶原(最好是IV、IVOX)或聚硅氧烷的双层构成的套管。可以举出具体的实例，如由聚硅氧烷构成的Silastic套管(Dow-Corning)。另外，该套管最好具有管、一截圆柱体或角形的形状。套管的直径可由本领域技术人员根据具体的应用来确定。具体讲，对于刺激外周神经的再生，相对直径可为0.05-15mm。更具体地讲，套管的内径在0.5-10mm之间。用于脊髓的再生，可选择更大内径的套管。特别地，对于这些应用，所用套管根据所涉及的神经段具有可达15-20mm的内径。对于臂神经丛的破损神经根的桥接，套管的直径最好相应于神经根的直径，套管的长度一般取决于待补偿的缺失长度。可以使用长度在0.5-5cm的套管。优选地，套管长度小于5cm，实质缺失超过5cm是不常见的。
如上所述，本发明方法首先涉及将神经的第一部分引入套管中，这最好是神经的近端部分。然后将其固定以便确保(i)神经的良好生长和(ii)装置的密封性。为此，可以在神经和套管间进行缝合和/或放置生物胶。缝合可按外科的常规方法用适当的线进行。生物胶可以是可用于神经系统的任何生物相容性胶，特别是用于人类外科的任何生物胶，尤其是由纤维蛋白构成的胶Biocolle(Biotransfusion，CRTS，里尔)、Tissucol Immuno AG，奥地利维也纳)等。
如上所述，本发明方法包括在套管中引入包含神经营养因子表达系统的组合物。
在本发明中，术语“表达系统”指能使编码神经营养因子的核酸在体内表达的任何构建物。最好，该表达系统包含在转录启动子控制下的编码神经营养因子的核酸(表达盒)。核酸可以是DNA或RNA。对于DNA，可以使用cDNA、g DNA或杂合DNA，即含有g DNA的一个或多个内含子但不是全部的DNA。DNA还可以是合成的或半合成的，特别是优化了密码子或造成截短形式的人工合成DNA。
转录启动子可以是在哺乳动物(优选人)细胞(特别是神经细胞)中有功能的任何启动子。当负责相关神经营养因子表达的天然启动子区在相关细胞或机体中有功能时，可以用这种天然启动子区。也可以用不同来源的启动子区(负责其它蛋白的表达，或甚至是合成的)。特别可以用真核细胞或病毒基因的启动子区。例如可以用源自靶细胞基因组的启动子区。在真核启动子中，可以使用特异性或非特异性，可诱导地或不可诱导地、弱或强地刺激或抑制某基因转录的任何启动子或衍生序列。这特别可以是遍在型启动子(HPRT、PGK、α-肌动蛋白、微管蛋白等基因的启动子)、中间丝的启动子(GFAP、结蛋白、波形蛋白、神经丝、角蛋白等基因的启动子)、治疗性基因的启动子(例如MDR、CFTR、第八因子、ApoAI等基因的启动子)或应答于某种刺激的启动子(甾类激素的受体、视黄酸受体等)。同样，可用源自病毒基因组的启动子序列，例如腺病毒的E1A和MLP基因的启动子、CMV的早期启动子或RSV病毒LTR的启动子。另外，可通过添加活化、调节或进行组织特异或集中表达的序列而修饰这些启动子区。
在本发明中优选使用真核或病毒的组成性启动子，特别是选自HPRT、TGK、α-肌动蛋白、微管蛋白基因的启动子或腺病毒E1A和MLP基因的启动子、CMV的早期启动子或RSV病毒LTR启动子的那些。
另外，表达盒最好包含引导合成产物至靶细胞分泌道中的信号序列。这种信号序列可以是所合成产物的天然信息序列，但也可以是任何其他功能性信号序列或一种人工信号序列。
最后，表达盒一般包括指示转录终止信号的3′区和一个聚腺苷酸化位点。
可用于本发明的营养因子主要分类为神经营养蛋白家族、神经因子家族、TGF-β家族、成纤维细胞生长因子(FGF)家族和胰岛素型生长因子(IGF)家族(综述见16)。
在神经营养蛋白家族中，本发明中优选使用BDNF、NT-3或NT-4/5。
Thoenen(17)描述的脑衍生神经营养因子(BDNF)是一种118个氨基酸、分子量为13.5KD的蛋白质。在体外，BDNF刺激神经突的形成，视网膜节神经元、隔胆碱能神经元及中脑多巴胺能神经元的培养存活力(综述见18)。编码人BDNF和大鼠BDNF的DNA序列已被克隆和测序(19)，编码猪的BDNF的序列也已测定(20)。虽然其具有潜在的有意义的特性，但BDNF的治疗应用遇到了各种困难特别是，BDNF生物利用性的缺乏限制了任何治疗应用。在本发明中产生的脑衍生神经营养因子(BDNF)可以是人BDNF或动物BDNF。
神经营养蛋白3(NT3)是一种119个氨基酸的分泌蛋白，它甚至在很低浓度下使神经元体外生存(21)。已报道了编码人NT3的cDNA的序列(22)。
TGF-β家族特别包括衍生自神经胶质细胞的神经营养因子。这种衍生自神经胶质细胞的神经营养因子GDNF(23)是一种134个氨基酸、分子量为16kD的蛋白质。它具有体外促进多巴胺能神经元和运动神经元存活的重要能力(16)。本发明中产生的神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)可以是人GDNF或动物GDNF。编码人GDNF和大鼠GDNF的cDNA的序列已被克隆和测序(23)。
另一种可用于本发明的神经营养因子是CNTF(睫状神经营养因子)。CNTF是一种可阻止神经元死亡的神经因子。如以前报道的那样，临床试验已无结果而过早中断。本发明现在体内长时间持续地产生CNTF，单独产生或与其它营养因子联合产生。人及鼠的CNTF的cDNA和基因已被克隆和测序(EP385 060；WO91/04316)。
可用于本发明的其它神经营养因子例如是IGF-1(Lewis等，1993)和成纤维细胞生长因子(FGFa，FGFb)。尤其IGF-1和FGFa是很有意义的候选者。FGFa的基因序列及允许其体内表达的载体已在文献中报道(WO 95/25803)。
优选地，本发明的表达系统能在体内产生选自神经营养蛋白、神经因子和TGF的神经营养因子。更优选产生选自BDNF、GDNF、CNTF、NT3、FGFa和IGF-1的因子。尤其有意义的是产生NT3。
另外，根据本发明的一种变化方案，还可以利用本发明的表达系统以产生两种神经营养因子。在此实施方案中，表达系统包括两种表达盒，或同时表达两种核酸的单一表达盒(双顺反子单元)。当该系统包含两种表达盒时，它们可以使用相同或不同的启动子。
在本发明的表达系统中，表达盒最好构成载体的一部分。载体特别可以是病毒载体或质粒载体。在含多个表达盒的表达系统中，这些表达盒可以被分立的载体或被同一个载体所携带。
所用的载体可以是标准的质粒载体，除本发明的表达盒外，还包含复制起点和基因标记。另外已报道了各种类型的改进载体，它们没有基因标记和复制起点(WO 96/26270)或具有例如条件性的复制起点(PCT/FR96/01414)。这些载体可有利地用于本发明中。
所用的载体还可以是病毒载体。已从病毒构建了各种载体，它们具有显著的基因转移特性。特别可以举出腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒和疱疹病毒。为了用作基因转移的载体，这些病毒的基因组可被修饰使其不能在细胞中自主复制。这些病毒被称为复制缺陷性。一般地，用表达盒取代病毒复制所必需的区域来修饰该基因组。
在本发明中，优选使用腺病毒衍生的病毒载体。腺病毒是约36kb(千碱基)长的双链线性DNA病毒。其基因组特别包括在每个末端的反向重复序列(ITR)、衣壳化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要的早期基因包含在E1、E2、E3和E4区中。其中E1区中包含的基因是病毒繁殖所必需的。晚期基因主要包含在L1-L5区中。腺病毒Ad5的基因组已被整个测序，在数据库中可以找到(特别见Genebank M73260)。同样，其他腺病毒(Ad2、Ad7、Ad12等)基因组的部分甚至全部也已被测序。
为了作为基因转移载体，已制备了包含不同治疗基因的腺病毒衍生的不同构建物。更具体地讲，在现有技术中描术的构建物是缺失E1区(病毒复制所必需)并在此处插入外源DNA序列的腺病毒(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因50(1986)161)。另外，为了改善载体的性能，已提出在腺病毒基因组中创造其他缺失或修饰。例如，已在突变体ts125中引入了热敏性的点突交，使与DNA结合的72kDa蛋白质(DBP)失活(13)。另一些载体含有在另一病毒复制和/或繁殖必需区域(E4区)中的缺失。E4区实际上参与晚期基因的表达调节、晚期核RNA的稳定性、宿主细胞蛋白表达的消灭和病毒DNA复制的有效性。E1和E4区都缺失的腺病毒载体因而其有很低的病毒基因转录和表达的基底噪音。例如在专利申请WO 94/28152、WO95/02697、WO 96/22378中描述了这种载体。另外，还报道了在IVa2基因中有修饰的载体(WO 96/10088)。
文献中描述的缺陷性重组腺病毒是来自不同血清型腺病毒的产物。实际上存在多种血清型的腺病毒，其结构和特性有差异，但它们具有可比的基因结构。特别地，重组腺病毒可源自人或动物。对于人源的腺病毒，优选举出分类为C组的那些，特别是2(Ad2)、5(Ad5)、7(Ad7)或12(Ad12)型腺病毒。在源自动物的不同腺病毒中，优选举出来自狗的腺病毒，特别是CAV2腺病毒的毒株(例如manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。在特别是专利申请WO 94/26914(引入本发明作为参考)中描述了其他源自动物的腺病毒。
在一优选的实施方案中，重组腺病毒是C组人腺病毒。更优选是Ad2或Ad5腺病毒。
这些腺病毒在衣壳化细胞系中产生，即在能够反式补充重组腺病毒基因组中的一种或多种缺陷功能的细胞系中。例如一种这样的细胞系是293细胞系，其中已整合了一部分腺病毒基因组。更准确地讲，293细胞系是含有血清型5腺病毒(Ad5)基因组左端(约11-12％)的人胚肾细胞系，所述左端部分包括左侧ITR、衣壳化区、E1区(包括E1a和E1b)、编码pIX蛋白的区域和编码pIVa2蛋白的部分区域。该细胞系能够反式补充E1区缺陷的重组腺病毒(即失去E1区全部或部分的腺病毒)，产生高滴度病毒原种。该细胞系还能够在允许的温度(32℃)下产生另外含热敏性E2突变的病毒原种。还报道了能够补充E1区的其他细胞系，它们尤其基于人肺癌细胞A549(WO 94/28152)或人视网膜细胞(人类基因治疗(Hum.Gen Ther)(1996)215)。另外，也已报道了能够反式补充腺病毒多种功能的细胞系。特别地，可以举出补充E1和E4区的细胞系(Yeh等，病毒学杂志(J.Virol)70(1996)559；癌症基因治疗(Cancer Gen.Ther.)2(1995)322；Krougliak等，人类基因治疗(Hum.Gen.Ther.)6(1995)1575)和补充E1和E2区的细胞系(WO 94/28152，WO 95/02697，WO 95/27071)。这些重组腺病毒一般按如下过程产生在衣壳化细胞系中引入病毒DNA，在约2或3天后(腺病毒的动力学周期为24-36小时)裂解细胞，然后在氯化铯梯度上离心分离重组病毒颗粒。在专利申请FR9608164中描述了其它的方法，所述申请引入本文作为参考。
治疗基因的表达盒可以按现有技术中描述的技术插入到重组腺病毒基因组的不同位点。首先可以插入在E1缺失处。还可以插入在E3区，添加新序列或替代原序列。该表述盒还可以处于缺失的E4区中。为了构建带两个表达盒的载体，可将一个表达盒插入在E1区中，另一个插入在E3或E4区中。这两个表达盒也可以引入在同一个区域中。
为了实施本发明，可以按不同的方式配制含有表达系统的组合物。该组合物特别可以是无菌等渗盐溶液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)或通过加入蒸馏水或生理血清能构成可注射液的干组合物，特别是冻干组合物。也可以使用其他的赋形剂，例如稳定化蛋白质(特别是人血清白蛋白FR 9603074)、泊洛沙姆或水凝胶。水凝胶可以用任何生物相容性无细胞毒聚合物(均聚或共聚)制备。这样的聚合物例如描述在专利申请WO93/08845中。其中一些，特别是从环氧乙烷和/或环氧丙烷获得的那些是商业化的。另外，当表达系统由质粒载体构成时，最好在组合物中加入一种或多种有利于基因转移的化学或生化试剂。对此，可以特别举出聚赖氨酸型阳离子聚合物(LKLK)n、(LKKL)n(如专利申请WO 95/21931中所述)、聚乙烯亚胺(WO 96/02655)和DEAE葡聚糖或阳离子脂质或脂转染试剂。它们具有浓集DNA并促进其与细胞膜结合的特性。对于脂转染试剂，可以举出脂聚胺(脂转染胺试剂、transfectam，如专利申请WO 95/18863或WO 96/17823中所述)，不同的阳离子或中性脂质(DOTMA、DOGS、DOPE等)，以及核源的肽(WO 96/25508)，它们可以是为了靶向某些组织而功能化的。利用这种化学载体制备本发明的组合物可以按本领域技术人员已知的任何技术进行，一般通过各成分的简单接触进行。
特别优选地，本发明中所用的表达系统由编码一种神经营养因子的缺陷性重组腺病毒构成。更具体地讲，该神经营养因子是NT3。在本发明的应用中，这些腺病毒最好以104-1014pfu、优选106-1010pfu的剂量形式配制和给药。术语“pfu”(噬斑形成单位)相当于腺病毒溶液的感染能力，通过适当的培养细胞的感染和一般在15天后计量所感染细胞的空斑数来测定。病毒溶液的pfu滴度的测定技术在文献中有充分描述。下述实施例特别显著地表明，109和107的剂量可以(i)在切断的神经元中有效地转移基因，(ii)在所述神经元中持续地表达转基因，及(iii)恢复轴突的连续性。
表达系统向套管中的引入可以按不同的方式进行，特别是通过注射器。优选用微注射器的注射(Hamilton或Terumo微注射器)。
本发明特别有意义的应用之一是刺激外周神经的再生长。这种治疗方法用于各种病理状况，特别是神经创伤或变性。该方法可用于任何外科手术可及的神经，特别是上肢的桡神经、尺神经、中神经、手指侧神经和骨间神经，下肢的坐骨神经(出生时直径约1cm)或股神经(直径6-7mm)。
本发明另一特别有利的应用是在臂神经丛(直径5-6mm)根部或脊髓中(由创伤造成损伤)水平恢复神经连续性。这种类型的损伤迄今未知任何治疗方法。本发明方法可以在脊髓断裂之下段和之上段之间造成一个桥，以连接主要神经束并再生神经连续性。对于这些应用，所用的套管优选具有可达到15-20mm的内径。特别对于臂神经丛撕裂神经根的搭桥，套管的直径相应于神经根的直径。
本发明因而还涉及一种在神经损伤处局部持续地释放神经营养物质的产品，其包括能桥连损伤上下部分的生物相容性套管，在该套管中引入了神经营养因子的表达系统。
本发明可用于在人体及动物中体内刺激神经再生。在动物中，本发明还可用于研究一种新营养因子(新蛋白、突变体等)的特性。为此，将动物的神经切断，然后将待测因子的表达系统引入本发明的装置中。如实施例所述的那样测定所述因子恢复神经连续性的能力。该装置还可以用于比较不同的因子，或研究不同因子的协同作用。
以下借助于实施例更详细地描述本发明，这些实施例应视为说明性质的而不是限制性的。


图1描绘了本发明装置在外周神经上的安置。
图2在脊髓骶腰椎部分拍摄的显微照片，显示在脊髓运动神经元中大量产生β-半乳糖苷酶(由底物X-Gal揭示)。
图3第12天组织再生长的宏观状态。(A)在对照动物中观察到的实例，在神经分隔的远近两端间没有观察到任何组织连续性。(B)接受107pfu Ad-NT3注射的动物中支持管内容物的状态。可以观察到连接神经分隔远近两端的组织轴线的存在。
图4在第12天观察到的HRP反向标记的状态。(A)在对照组中，观察到有稀少的弱标记运动神经元。(B)在107pfu Ad-NT3治疗组中，存在大量强标记的脊髓神经元。
图5描绘本发明装置在损伤之下外周传入神经和损伤之上脊髓间的搭桥安置。
图6描绘本发明装置在脊髓中的安置。
图7描绘在处理神经和安置本发明的装置后随时间观察到的运动反应。
1方法1-1腺病毒载体如前文所述，病毒载体特别是腺病毒构成本发明的一种特别优选的实施方案。
所用的重组腺病毒按现有技术中描述的技术通过同源重组获得。实际上，它是在293细胞中构建的，即通过线性化病毒基因组片段(dl 324)和含有左侧ITR、衣壳化序列、转基因及其启动子和允许重组的病毒序列的质粒间的重组。这些病毒在293细胞中扩增。它们一般在我们的P3实验室中再纯化。病毒基因组还可以按专利申请WO 96/25506中描述的技术在原核细胞中制备。特别使用下列病毒-Ad-βGal衍生自Ad5血清型的缺陷性重组腺病毒，其含有(i)E1区的缺失，在此缺失处引入了一个表达盒，后者包含在劳氏肉瘤病毒LTR启动子(称为LTR-RSV或RSV)控制下的编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的核酸，和(ii)E3区的缺失。该腺病毒的构建已由Stratford-Perricaudet等报道(J.Clin.Invest.90(1992)626)。-Ad-NT3血清型Ad5的重组腺病毒，在其基因组中缺失的E1区处插入了NT3的表达盒，后者包含转录启动子(特别是LTR-RSV)控制下的编码NT3的cDNA。另一构建体包括在E4区中的额外缺失，如专利申请WO 96/22378中所述。-Ad-CNTF血清型Ad5的重组腺病毒，在其基因组中缺失的E1区处插入了CNTF的表达盒，后者包含转录启动子(特别是LTR-RSV)控制下的编码CNTF的cDNA。构建的详细描述已在专利申请WO94/08026中给出。另一构建体包括在E4区中的额外缺失，如专利申请WO 96/22378中所述。-Ad-GDNF一种Ad5血清型重组腺病毒，在其基因组中缺失的E1区处插入了一个GDNF的表达盒，后者包括在转录启动子(特别是RSV的LTR)控制下的编码GDNF的cDNA。构建的详细描述已在专利申请WO 95/26408中给出。另一构建体还在E4区中有缺失，如专利申请WO 96/22378中所述。-Ad-BDNF一种Ad5血清型重组腺病毒，在其基因组中缺失的E1区处插入了BDNF表达盒，后者包括转录启动子(特别是RSV的LTR)控制下的编码BDNF的cDNA。构建的详细描述已在专利申请WO95/25804中给出。另一构建体还在E4区中有缺失，如专利申请WO96/22378中所述。-Ad-FGFa一种Ad5血清型重组腺病毒，在其基因组中缺失的E1区处插入了FGFa的表达盒，后者包括转录启动子(特别是RSV的LTR)控制下的编码FGFa的cDNA。构建的详细描述已在专利申请WO95/25803中给出。另一构建体还在E4区中有缺失，如专利申请WO96/22378中所述。
所构建病毒的功能通过感染培养的成纤维细胞来验证。用ELISA在培养上清液中分析相应神经营养因子的存在和/或用神经元初级培养物揭示该上清液的营养特性。
可以理解，能够获得腺病毒衍生的其他构建物并用于本发明中，特别是带有额外缺失和/或不同的启动子和/或编码其他神经营养因子的载体。1-2.外科手术过程动物由320-340g的Sprague-Dawley雄性大鼠(法国Iffa Credo-Les Oncins)构成。在全身麻醉下(腹膜内注射1mg/kg戊巴比妥-SanofiSantéAnimale)，在右后腿大腿处切口，分离肌肉层以暴露右坐骨神经。在窝和坐骨神经分离间的中点切断神经，拿掉5mm的节段(图1B)。拿出一个聚硅氧烷管形假器(长14mm，内径1.47mm，壁厚0.23mm-Silastic，Dow Corning Corporation，美国)。将神经的近端引入该管中并用9/0尼龙缝线连结管和神经以将神经固定在位。在管和远端神经间设置另一缝线，获得神经两端间10mm的缺失(在所用试验条件下在大鼠中观察到的外周神经自发再生的极限距离)(图1c)。用纤维蛋白胶(Tissucol，Immuno AG，奥地利维也纳)对近端接头进行密封，然后用微注射器将10μl病毒溶液或对于对照动物的等渗盐的溶液引入支持管中并与神经近端接触(图1D)。支持管的死体积用等渗盐溶液(0.9％氯化钠溶液)充满，然后将神经的远端也引入管形假器中，并用纤维蛋白胶保证该末端的密封性(图1E)。分别用6/0和4/0尼龙标缝线重新缝合肌肉层和皮肤。将动物放在单个的笼中，保持在12h/12h的明/暗周期下。1-3.轴突再生和辣根过氧化物酶反向标记脊髓运动神经元的监控12天后，将动物全身麻醉后，重新暴露连接物，分离周围的粘附物。在原神经切口近端下游3mm处切割连接物之前观察到存在组织连续性。所得“残肢”用等渗盐溶液清洗，然后充满30％(w/v)的HRP溶液(Sigma Chemical，St Louis，MO，美国)。培养1小时后，弃去该溶液，用等渗盐溶液清洗该神经末端，然后再缝合肌肉层和皮肤，将动物放回它们的笼中。40小时，再将动物麻醉、固定，用PBS清洗后用3.6％戊二醛心内灌注。然后解剖分离脊髓，在3.6％戊二醛中后固定3小时，再放在30％(w/v)蔗糖中48-72小时。通过35μm厚的系列纵向切割，冷冻切割脊髓的腰骶部分，按Mesulam(15)描述的常规技术用3，3 ′，5，5′-四甲基联苯胺(Benzidine)显示HRP的存在。1-4.β-半乳糖苷酶的检测用底物X-Gal显现了β-半乳糖蔗酶活性(14)。简言之，将100μm厚的腰骶脊髓纵向切片在含有六氰合铁酸钾(4mM)，铁氰化钾(4mM)、X-Gal底物(0.4mg/ml)、氯化镁(4mM)的PBS中37℃保温18小时。保温后将这些组织切片用PBS清洗，然后放在水性介质(明胶-甘油)中。2.显示非复制性腺病毒被去轴突脊髓运动神经元反向转运，验证转基因的表达。
该第一种研究得以证明去轴突神经元能够进行腺病毒载体的反向转运，并在可达4周的时间内表达一种转基因。每管注射了109pfu的载体(在1-1中描述的β-半乳糖苷酶腺病毒)，在第4天、第14天和第4周检测其转基因的表达。
第4天在相当于支配坐骨神经之神经根的脊髓骶腰部分腹角处观察到了β-半乳糖苷酶的强表达(图2)。在第14天再次发现脊髓运动神经元的这种转基因强表达，β-半乳糖苷酶阳性细胞平均总数为63.2±33.6，即感染效率为支配坐骨神经之脊髓神经元总数的约12.25％。在直达4周的时间内检测到了脊髓骶腰区中β-半乳糖苷酶活性的存在，而标记强度降低(表1)。3.编码神经营养蛋白(NT3)的载体对缺失10mm的大鼠坐骨神经轴突再生长的效果试验。
由于这些结果证明可能使用体内基因治疗类型的系统刺激去轴突后的神经再生长，我们试验了带编码神经营养蛋白3转基因的腺病毒(1-1中描述的Ad-NT3)对外周神经再生的作用。去轴突并用含107pfu载体或等渗盐水的导向支管修复，12天后的结果表明只在用Ad-NT3处理的动物组中观察到了组织连续性(图3，表II)。HRP反向标记对已再生轴突通过导向支管的脊髓运动神经元数目的分析表明，这种组织连续性是由神经再生长构成的，平均182.3±76.5个HRP阳性神经元，而对照组为24.25±42.7个HRP阳性神经元(图4，表II)。
从这些结果可以得出，使用带神经营养因子编码基因的复制缺陷性腺病毒载体的本发明装置，可用于促进中枢及外周轴突的再生长。4.在大鼠中比较外周神经切断后的功能恢复在成年大鼠坐骨神经上造成损伤以形成至少10mm的实质缺失。将损伤的近端和远端部分用本发明的装置连接(聚硅氧烷管，长14mm，内径14.7mm-Silastic)，在其中引入了盐水溶液、AV-RSVβGal(107pfu，10μl)、AV-RSVβNT3(107pfu，10μl)或NT3蛋白。通过肌电图测定了功能恢复每两周记录一次腓肠肌中的运动反应(图7)。
与其它组比较，在用AV-RSVNT3处理的组中观察到了功能恢复。这种提高在112天的期间内与AV-RSVβGal组比较，在70天到112天的期间内与rNT3组比较都有满意的显著性。各自的肌电特性分析表明用AV-RSVNT3处理提高了给定动物启动神经再生长的可能性。但是，当再生长已开始时，并不改变再生长速度。
这些结果表明用本发明中描述的技术对神经营养因子编码基因的转移对提高外周神经切断后的功能恢复是有效的。
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表I编码β-半乳糖苷酶的腺病毒载体对去轴突运动神经元感染效力的测定

表II注射Ad-NT3第12天对轴突再生长的影响

N.D.未测定*在灌注过程中动物死亡
权利要求
1.用于刺激神经再生的装置，其包括在其中已引入了神经营养因子表达系统的生物相容性套管。
2.用于刺激神经再生的药盒，其包括生物相容性套管和含有神经营养因子表达系统的组合物。
3.其中引入了神经营养因子表达系统的生物相容性套管在制备用于刺激神经再生的组合物中的应用。
4.权利要求3的应用，是制备用于刺激外周神经再生的组合物。
5.权利要求3的应用，是制备用于刺激脊髓中轴突再生的组合物。
6.其中引入了神经营养因子表达系统的生物相容性套管在制备用于治疗神经系统创伤性损伤的组合物中的应用。
7.用于在神经损伤处局部持续释放神经营养物质的产品，它由可连接损伤上下部分的生物相容性套管构成，其中引入了一种神经营养因子表达系统。
8.根据权利要求3-6之一的应用，其特征在于所述套管由无毒生物相容性材料的管形支持物构成。
9.根据权利要求3-6之一的应用，其特征在于神经的第一段被引入在套管的一端并用缝线和/或胶固定，在套管中引入表达系统，然后将神经的第二段插入在套管的另一端并用缝线和/或胶固定。
10.根据权利要求3-6之一的应用，其特征在于表达系统由含编码所述神经因子之核酸的载体构成。
11.根据权利要求10的应用，其特征在于载体是一种病毒载体。
12.根据权利要求11的应用，其特征在于病毒载体是一种腺病毒载体。
13.根据权利要求10的应用，其特征在于神经营养因子选自神经营养蛋白、神经因子、TGF-β、FGF和IGF家族的因子。
14.根据权利要求13的应用，其特征在于神经营养因子选自BDNF、GDNF、CNTF、NT3、GFGa和IGF-1。
全文摘要
本发明涉及用于刺激神经再生的方法,其可应用于外周神经以及中枢神经系统,特别是脊髓的神经。本发明特别地使用一种包括其中引入了神经营养因于表达系统的生物相容性套管的系统。
文档编号A61K48/00GK1251047SQ9880366
公开日2000年4月19日 申请日期1998年3月25日 优先权日1997年3月26日
发明者P·丘尔夫, F·莱瓦, M·塔迪 申请人:罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司