专利名称：：广泛反应性的dr限制性表位的鉴定的制作方法相关申请的交叉引用本发明申请为1997年1月23日提交的USSN60/036,713和1997年2月7日提交的USSN60/037,432的部分继续申请，这两篇申请都在纳入本文为参考。
背景技术：
：辅助(性)T淋巴细胞(HTL)在对病原体的免疫中发挥着多种重要功能。首先，它们辅助诱导CTL和抗体应答。通过直接接触和通过分泌淋巴因子(如IL2和IL4)，HTL支持和促进了T细胞和B细胞前体细胞的扩张和分化成效应细胞。此外，HTL可能自身也是效应细胞，这种活性也是由直接细胞接触和分泌淋巴因子(如IFN-γ和TNFα)所介导的。已表明，在肿瘤以及病毒、细菌、寄生虫和真菌感染的情况下，HTL有直接的效应器活性。HTL识别II类MHC分子与抗原肽(通常长10-20个残基，平均大小为13-16个氨基酸)形成的复合物。肽-II类(分子)之间的相互作用在结构和功能水平上已被详细分析，从而提出了对人和小鼠的II类MHC分子的特异性肽基序。在过去数年内，以表位为基础的疫苗作为开发新的预防疫苗和免疫治疗策略的一种可能手段，已经受到了很大的关注。选择合适的T细胞和B细胞表位，可使免疫系统集中针对那些以序列高可变性为特征的病原体(如HIV、HCV和疟疾)的保守表位。此外，使免疫应答反应集中针对选定的决定簇，在各种慢性病毒疾病和癌症中可能有价值，其中针对优势免疫表位的T细胞可能已被灭活，而针对亚优势(subdominant)表位特异的T细胞可能逃逸T细胞耐受性。使用以表位为基础的疫苗还可避开“抑制性”T细胞决定簇，这些决定簇会在需要TH1应答的情况下却诱导TH2应答，或反之亦然。最后，以表位为基础的疫苗还能提供一种机会，即在疫苗构建物中包含经基因工程改造的表位以调节其效力或是增加MHC结合亲和力，或者是改变其TCR接触残基，或二者兼而有之。包含完全人工合成的非天然或遗传上与病原体无关的表位(例如衍生自TT的“通用”表位)，也提供了一种调节HTL应答向TH1或TH2表型(转移)的可能手段。一旦确定了合适的表位决定簇，它们可以被归类并通过各种不同方法，包括脂肽、病毒输送载体、病毒颗粒或合成的颗粒、裸cDNA或颗粒吸附的cDNA来输送。然而，在确定合适的表位之前，一个主要障碍必须被克服，即人群中表达的MHC分子的极高度多态性。事实上，已经鉴定了200种以上不同类型的I类和II类HLA分子。已表明，在I类HLA分子的情况下，已鉴别出能够结合数种不同I类HLA分子的肽。事实上，已知的I类HLA分子60％以上可被归入4个大的HLA超型，其特征是具有类似的肽结合特异性(HLA超基序)。对于III类分子，也已知道，的确存在能够结合多种HLA型并且在不同HLA分子情况下具有免疫原性的肽。然而，到目前为止，还没有开发出一种通用的鉴别它们的方法，这可能至少反映了这样的事实即定量的DR结合试验是费力的事情而且大量的等位基因必须被考虑在内。本发明针对这些及其他需求。发明概述本发明(至少部分)根据的是世界人群的各种代表性DR分子的特异性基序的发现和验证以及分析系统。还描述了它们在鉴别广泛简并的HLAII类结合肽方面的应用。定义在本说明书中，术语“肽”与“寡肽”可互换使用，指一系列互相连接的残基，通常为L-氨基酸，通常是通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键一个与另一个相连。本发明的寡肽长度小于约50个残基，通常为10-30个残基，更通常为12-25个残基，最好为15-20个残基。“免疫原(性)肽”是含有等位基因特异性基序的肽，因而该肽会与MHC分子结合并诱导HTL应答。本发明的免疫原性肽能与适当的HLA分子结合并诱导针对衍生出该免疫原性肽的抗原的HTL应答。“保守性残基”是占据肽基序中特定位点的保守氨基酸，通常是位于MHC结构提供的与免疫原性肽的接触点处的残基。在限定长度的肽中有1-3个(通常2个)保守性残基，它们确定了免疫原性肽的基序。这些残基通常与肽结合沟槽(groove)紧密接触，残基的侧链被埋在沟槽自身的特异空穴(pocket)中术语“基序”指确定长度(通常为约8-11氨基酸)的肽上的残基(序列)模式，这种模式可被某特定的MHC等位基因(产物)识别。术语“超基序”指这样的基序，当它存在于免疫原性肽中时，可使该肽能与一种以上的HLA抗原结合。超基序能被至少一种，较佳地至少2种，更佳地至少3种，最佳地3种以上在人群中广泛分布的HLA等位基因(产物)所识别。词语“分离的”或“生物纯的”指材料大致或基本上不含有那些在自然状态下常与其伴随的成分。因此，本发明的肽不含有在原来环境中通常与其相伴的物质，即抗原呈递细胞上的MHCI分子。即使将蛋白质分离至均质或主要条带，但仍有5-10％与所需蛋白质一起纯化的天然蛋白质痕量污染物。本发明的分离肽不含有这种内源性的同时纯化的蛋白质。术语“残基”指通过酰胺键或类酰胺键掺入寡肽的氨基酸或类氨基酸。附图简述图1是当20种天然存在氨基酸中的每种氨基酸占据了相对于P1-P6主锚着位点的某个特定位置时，对DR4w4结合能力的正面或负面影响图。图2是当20种天然存在氨基酸中的每种氨基酸占据了相对于P1-P6主锚着位点的某个特定位置时，对DR1结合能力的正面或负面影响图。图3是当20种天然存在氨基酸中的每种氨基酸占据了相对于P1-P6主锚着位点的某个特定位置时，对DR7结合能力的正面或负面影响图。优选例的描述本发明涉及用于预防、治疗或诊断大量病症(如病毒、真菌、细菌、寄生虫性疾病和癌症)的组合物和方法。具体地讲，本发明提供了能与选定的II类主组织相容性复合体(MHC)分子结合并诱导免疫应答的新颖的肽。肽与MHC分子的结合是由MHC分子的等位基因类型和肽的氨基酸序列所决定的。MHCI类结合肽通常在其序列中含有2个保守(“锚着”)残基，该残基与MHC分子中对应的结合穴相互作用。与人MHC(HLA，组织相容性白细胞抗原)的数种等位基因形式结合而所需的锚着残基的特定组合(通常称为“MHC基序”)，在国际申请WO94/03205和WO94/20127中有描述。明确了特异性的MHC基序，使得人们可以根据各蛋白质的氨基酸序列来预测哪个肽对CTL有潜在的免疫原性。这些申请描述了免疫原性肽制备方法以及在疾病治疗中的用途。此处描述的肽还可作为辅助性T细胞肽与诱导CTL应答的肽组合使用。这在WO95/07077有描述。出于预防和/或治疗的目的，可将本发明的DR结合肽或其编码核酸用于哺乳动物，尤其是人。当本发明的肽用作辅助性肽时，DR肽可用于加强针对与肽一起施用的其它免疫原的免疫应答。例如，本发明肽与诱导CTL应答的肽的混合物，可用于治疗和/或预防病毒感染和癌症。或者，可使用能诱导抗体应答的免疫原。可用DR肽和其它免疫原构成的免疫原性混合物来治疗的疾病的例子包括前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、肾癌、宫颈癌、淋巴瘤、CMV和尖锐湿疣。DR结合肽或其编码核酸，还可用于治疗涉及T细胞不良反应性的各种疾病。可用DR结合肽治疗的疾病的例子包括自身免疫疾病(如类风湿关节炎、多发性硬化和重症肌无力)、同种移植排斥反应、变态反应(如花粉过敏)、莱姆病、肝炎、LCMV、链球菌引起的心内膜炎、或肾小球性肾炎，以及食物过敏。用于治疗时，本发明的免疫原性组合物或者DR结合肽或其编码核酸用于已经患有癌症、自身免疫疾病或已被有关病毒感染的个体。可单独使用DR结合肽或免疫原性复合体、或结合其它疗法(只要合适)，来对疾病潜伏期或发作期的病人进行治疗。用于治疗时，给予病人含有免疫原性成分的组合物，其用量足以引发对病毒或肿瘤抗原的有效免疫应答，从而治愈或至少部分抑制症状和/或并发症。与此类似，可给予病人足量的含有DR结合肽的组合物，以治愈或至少部分抑制疾病症状及其并发症。足以达到上述效能的剂量被定义为“治疗有效剂量”。对于此用途而言的有效量将取决于例如肽组份、给药方式、接受治疗的疾病病期及严重性、病人的体重和总体健康状况、以及开方医师的判断。本发明的免疫原性组合物的治疗有效量，对于初次免疫(这是对治疗和预防性给药而言)一般范围约为1.0μg至10,000μg肽/70kg病人，通常为100-8000微克，较佳地为200-6000微克。随后数周至数月内的加强免疫方案中，所用的加强剂量约为1.0μg至1000μg肽，这取决于病人的应答和状况，这可通过测定病人血液中特异性的免疫原活性而确定。必须记住，本发明的组合物通常可用于疾病严重期，即危及生命或对生命有潜在威胁的情况。在这种情况下，鉴于本复合物的外源物质极少和相对无毒的性质，因此给予大大过量的这些组合物是可能的并且治疗医师也许会认为是需要的。用于预防时，应施用于高危人群。例如，通过预防性地施用本发明的组合物，从而增强免疫力，可以起保护作用以免患疟疾、肝炎或AIDS病。治疗性施用，必须在疾病出现首次症状，或作出诊断或手术切除肿瘤后，或刚确诊急性感染后就开始。这之后是给予加强剂量直到至少症状显著缓解为止，并再维持一段时间。在慢性感染中，可能需要在加强剂量前给予负荷剂量(loadingdose)。用本发明组合物治疗受感染个体，可以促进急性感染个体中感染的消除。对那些易于(或预先有倾向)发展成慢性感染的个体，该组合物特别适用于防止急性感染发展成慢性感染的治疗方法。例如，如本文所述，在感染之前或之中诊断出某些易感个体，那么就可以给他们服用该组合物，从而最大程度降低给更大群体用药的需求。肽混合物或复合物可用于治疗慢性感染并刺激免疫系统杀灭携带者体内被病毒感染的细胞。重要的是所提供的制剂中的免疫加强肽的数量和给药方式应足以有效激发细胞毒性T细胞应答反应。所以，对于慢性感染的治疗，代表性剂量的范围是70kg的病人每剂约为1.0μg-5000μg，较佳地为5μg-1000μg。可能在此剂量免疫后长时间内，需要按既定间隔时间(例如1至4周)给予加强剂量以有效地免疫个体。在慢性感染中，必须持续给药直至临床症状或实验室检测表明病毒感染已消除或基本缓解，并再持续给药一段时间。用于治疗性或预防性处理的药物组合物，可经非肠胃道、表面、口服或局部给药。通常，药物组合物为非肠胃道给药，例如静脉内、皮下、皮内或肌内给药。因为施用方便，本发明的疫苗组合物特别适合于口服给药。所以，本发明提供了非肠胃道给药的组合物，它包括溶解或悬浮于可接受载体(较佳地是水性载体)中的肽或复合物溶液。有许多水性载体可供使用，例如水、缓冲水溶液、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可用常规的、熟知的灭菌技术进行灭菌，或者也可过滤除菌。所得的水溶液可经包装供直接使用，或者冻干，冻干制剂在使用前与无菌溶液混合。组合物中还可以按照近似生理条件所需含有药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲液、渗透压调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨酯、油酸三乙醇胺等。根据选定的特定给药形式，药物制剂中本发明的DR和/或CTL刺激肽的浓度变化范围很宽，即按重量计可从不足约0.1％，通常为或至少约为2％，到多达20％至50％或更多，并且主要是根据液体体积、粘度等来选择。本发明的肽和复合物还可以通过脂质体来给药，脂质体可使复合物靶向特定组织(例如淋巴样组织)或选择性地靶向被感染细胞，并可延长肽组合物的半衰期。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散系、薄片层(lamellarlayer)等。在这些制剂中，将欲输送的肽掺入作为脂质体的一部分，肽可以单用或与可结合于(例如)淋巴样细胞中的主要受体的分子(例如结合CD45抗原的单克隆抗体)联用，或与其它治疗性或免疫原性组合物联用。所以，内含所需要的本发明的肽或复合物的脂质体可被导向淋巴样细胞部位，然后脂质体在那里递送了所选定的治疗性/免疫原性肽组合物。用于本发明的脂质体是由标准的成囊(vesicle-forming)脂类所形成的，这些脂类通常包括中性和带负电的磷脂和甾醇，例如胆固醇。对脂类的选择通常要考虑到以下因素例如脂质体的大小、酸不稳定性和脂质体在血液中的稳定性。有许多方法可用于制备脂质体，比如以下文献中所述的方法如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9，467(1980)；美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369，均纳入本文作参考。为了靶向免疫细胞，可将配体掺入脂质体，配体包括，例如对所需免疫系统细胞的细胞表面决定簇特异的抗体或其片段。含有肽或复合物的脂质体悬液可通过静脉内、局部、体表面等途径给药，其剂量可根据(尤其是)给药方式、被输送的复合物和被治疗疾病的病期而变化。或者，可将编码一种或多种DR肽，或编码含有一个或多个CTL表位或抗体诱导表位的多肽的DNA或RNA，引入病人体内以获得针对该核酸所编码的多肽的免疫应答。Wolff等人，科学(Science)2471465-1468(1990)描述了使用核酸来导致核酸编码基因的表达。这种用途还公开于美国专利No.5,580,859和5,589,466中。核酸还可用(例如)美国专利No.5,204,253中所述的轰击输送法(ballisticdelivery)给药。可以给予只由DNA构成的颗粒。或者，DNA可以粘附于颗粒(例如金颗粒)上。核酸还可以与阳离子化合物(如阳离子脂类)复合的形式来输送。脂质介导的基因输送方法在(例如)下列文献中有所描述WO96/18372；WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques6(7)；682-691；Rose的美国专利No.5,279,833；WO91/06309；和Felgner等人(1987)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)847413-7414。本发明的肽还可由减毒病毒宿主(例如痘苗病毒和禽痘病毒)表达。这种方法涉及将痘苗病毒用作载体来表达编码本发明肽的核苷酸序列。一旦被引入急性或慢性感染的宿主或被引入未感染宿主，重组的痘苗病毒就会表达免疫原性肽，从而引发宿主的CTL应答。用于免疫方案中的痘苗载体和方法在例如美国专利4,722,848中有描述，该文献纳入本文作为参考。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover等人的文献(Nature351456-460(1991))中有所描述，该文献纳入本文作为参考。根据上面的描述，本领域的熟练技术人员将显然能找到各种各样能用于治疗或免疫接种的本发明肽的其他载体，如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)载体等。一种给予编码本发明肽的核酸的优选方法，是使用编码多个本发明的肽和CTL诱导肽的小基因构建物。为了产生编码所选定的DR表位和CTL表位的DNA序列以便在人类细胞中表达，可以对该表位的氨基酸序列进行反向翻译。可利用人类密码子使用表来指导选择每个氨基酸的密码子。这些编码表位的DNA序列可直接毗邻连接，从而产生连续的多肽序列。为了优化表达和/或免疫原性，可以在小基因设计中引入额外元件。能够被反向翻译并包含在小基因序列中的氨基酸序列例子包括本发明的DR肽、前导(信号)序列、一种或多种CTL表位、内质网保留信号。此外，通过包含合成的序列(如聚丙氨酸)或天然存在的与CTL表位相邻的侧翼序列，可以提高MHC对CTL表位的呈递作用。通过装配编码小基因的正链和负链的寡核苷酸，可以将小基因序列转变成DNA。重叠寡核苷酸(长30-100碱基)，可以在合适的条件下用熟知的技术合成、磷酸化、纯化、并退火。寡核苷酸末端可用T4DNA连接酶连接。然后，可将这种合成的、编码CTL表位多肽的小基因克隆入所需的表达载体中。可将本领域技术人员熟知的标准调控序列包含在载体中以确保在靶细胞中的表达。几种载体元件是需要的启动子，其下游有插入小基因的克隆位点；用于有效终止转录的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；和大肠杆菌选择标记(如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。有许多启动子可用于该目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。其他合适的启动子序列，可参见美国专利No.5,580,859和5,589,466。为了优化小基因的表达和免疫原性，可能需要附加的载体修饰。在某些情况下，为了有效表达基因需要内含子，因而可以将一种或多种合成的或天然存在的内含子引入小基因的转录区域。还可考虑引入mRNA稳定化序列以增加小基因的表达。最近提出，免疫刺激序列(ISSs或CpGs)在DNA疫苗的免疫原性中起作用。如果发现能够提高免疫原性，这些序列可包含在载体中小基因编码序列之外。在某些实例中，可以使用双顺反子表达载体，以便产生小基因编码的表位和包含的第二种蛋白质，从而提高或降低免疫原性。共表达时能够有利地提高免疫应答的蛋白质或多肽的例子包括细胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)、诱导细胞因子的分子(如LeIF)或共刺激性分子。本发明的HTL表位可连接于胞内导向信号并且与CTL表位分开来表达。这可以将HTL表位导向不同于CTL表位的细胞区室。如果需要，这能够促使HTL表位更有效地进入MHCII类途径，从而提高CTL诱导。与CTL诱导相反，在某些疾病中，也许通过共表达免疫抑制性分子(如TGF-β)来特异性地降低免疫应答是有利的。一旦选定表达载体，就可将小基因克隆入载体下游的多接头区域。将该质粒转入合适的大肠杆菌宿主，并用标准技术制备DNA。载体中所包含的小基因的取向和DNA序列以及其它元件，可用限制性酶切图谱和DNA序列分析加以证实。可将携带正确质粒的细菌细胞储藏起来作为母细胞库和工作细胞库。通过在大肠杆菌中发酵，然后纯化，生产治疗量的质粒DNA。按照熟知的技术，将工作细胞库的等份细胞接种于发酵培养基(如Terrific肉汤)，在摇瓶或生物反应器中生长至饱和。质粒DNA可用标准生物分离技术(如Quiagen供应的固相阴离子交换树脂)进行纯化。如果需要，用凝胶电泳或其他方法，可从开环或线性形式的DNA分离出超螺旋的DNA。可用各种配方来制备纯化的质粒DNA，以用于注射。其中最简单的形式就是在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中重建冻干的DNA。各种不同方法已有描述，而且也有新的方法可供使用。如上所述，核酸可方便地用阳离子脂类进行配制。此外，糖脂、融合脂质体、肽和通称为“保护性、相互作用的、非凝集性(PINC)”的化合物，也可与纯化的质粒DNA复合，以影响诸如稳定性、肌内分散性等因素，或者对运输至特定器官或细胞类型产生影响。靶细胞致敏可用于小基因编码的CTL表位的表达和MHCI类分子呈递的功能性测定。将质粒DNA导入适于用作标准CTL铬释放试验靶细胞的哺乳动物细胞中。所用转染方法将取决于最终的配方。电穿孔可用于“裸露的”DNA，而阳离子脂质则允许直接体外转染。可以共转染表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒，以便用荧光激活细胞分拣法(FACS)富集转染的细胞。然后用铬-51对这些细胞作标记，并用作检测表位特异性CTL系的靶细胞。51Cr释放检测到细胞溶解即表明产生了小基因编码的CTL表位的MHC呈递。体内免疫原性是小基因DNA配方功能测试的第二种方法。用DNA产物免疫接种表达合适入MHC分子的转基因小鼠。给药剂量与途径与配方有关(例如，对于IM用PBS配的DNA，对于IP用脂质复合的DNA)。免疫21天后，收获脾细胞，在编码待试各表位的肽存在下再刺激1周。用标准技术测定这些效应细胞中负载了肽的、铬-51标记的靶细胞的细胞溶解。被对应于小基因编码表位的肽的MHC负载所致敏的靶细胞的裂解，证明该DNA疫苗具有体内诱导CTL的功能。对于固体组合物，可采用常规的无毒固体载体，例如包括药剂级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服，可以通过掺入任何一种常用赋形剂(例如前面列出的那些载体)而形成药学上可接受的无毒性组合物，它通常含有10％-95％活性成分(即一种或多种本发明的偶联物)，更佳的浓度为25％-75％。对于气雾剂给药，肽最好和表面活性剂及推进剂一起以细分(微滴)形式提供。偶联物的典型百分比为0.01-20％(重量)，更佳为1-10％。当然，表面活性剂必须无毒性，而且最好溶于推进剂中。这类试剂的代表是含有6-22个碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸和油酸)与α脂族多元醇或其环状酐的酯或部分酯。可以使用混合酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可占组合物的0.1-20％(重量)，更佳为0.25-5％。组合物的其余部分通常为推进剂。如果需要还可包括一种载体，例如用于鼻内给药的卵磷酯。本发明另一方面涉及疫苗，它含有免疫有效量的本文所述免疫原性DR肽或CTL/DR肽偶联物或其编码核酸作为活性成分。可将偶联物引入某宿主(包括人)，其形式可以是连于其自身的载体或者是活性肽单元的均聚物或异聚物。这种聚合物具有增加免疫反应的优点，当用不同的肽构成聚合物时还能够诱导与病毒或肿瘤细胞的不同抗原决定簇反应的抗体和/或CTL。可以使用的载体是本领域公知的，包括例如甲状腺球蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白，破伤风类毒素，聚氨基酸(如聚(赖氨酸谷氨酸))，乙型肝炎病毒核心蛋白，乙型肝炎病毒重组疫苗等。疫苗还可含有生理上可接受的稀释剂如水、磷酸盐缓冲盐水、或盐水，通常还含有佐剂。诸如不完全Freund佐剂，磷酸铝，氢氧化铝，或明矾之类的佐剂是本领域公知的材料。而且如上所述，通过将本发明的肽偶连于脂质如P3CSS，可以引起CTL应答。通过注射、气雾剂、口服、透皮或其他途径用本文所述的肽组合物进行免疫，则宿主的免疫系统会对疫苗接种作出应答反应产生大量针对所需抗原的特异性CTL，因而宿主至少对以后的感染有部分免疫力或能防止演变为慢性感染。含有本发明的DR肽的疫苗组合物可以给予易感或有患病(例如病毒感染或癌症)风险的患者，以引发针对抗原的免疫应答反应，并因此增强患者自身的免疫应答能力，例如用**中描述的CTL表位。这种用量被定义成“致免疫有效剂量”。在这样的应用中，精确的用量同样取决于患者的健康状况和体重、给药方式、配方的性质等，但对于每位70kg患者而言，通常为1.0μg至约5000μg，更常用每70kg体重10-500μg。在某些情况下，可能希望将本发明的肽疫苗和能诱导针对感兴趣病毒(尤其是病毒包膜抗原)的中和抗体应答反应的疫苗联合使用。例如，PADRE肽可以与肝炎疫苗联合使用，以增强药效或扩大人群覆盖率。能以这种方式使用的合适肝炎疫苗包括RecombivaxHB(Merk)和Engerix-B(Smith-Kline)。对于治疗或免疫目的，本发明的肽还可以由减毒的病毒宿主如牛痘或禽痘(fowlpox)病毒来表达。这种方法涉及使用牛痘病毒作为表达编码本发明肽的核苷酸序列的载体。将其引入急性或慢性感染的宿主中或未感染的宿主中，重组的牛痘病毒便会表达免疫原性肽，从而引发宿主的CTL应答。免疫方案中所用的牛痘载体和方法在例如美国专利4,722,848中有所描述，该文献纳入本文作为参考。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover等人的著作中(Nature351456-460(1991))有所描述，该文献纳入本文作为参考。用于本发明肽的治疗性给药和免疫的其它各种载体(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)载体等)，是本领域技术人员根据本文描述能明显找到的。抗原性偶联物还可以用来在体外引发CTL。得到的CTL能用于治疗患者的慢性感染(病毒性或细菌性)或肿瘤，而这些患者对其他常规形式的治疗方法无反应或者对于肽疫苗治疗方法不会产生应答。对特定病原(感染因子或肿瘤抗原)的体外CTL应答，可以通过在组织培养物中将患者的CTL前体细胞(CTLp)和某来源的抗原呈递细胞(APC)及合适的免疫原性肽一起孵育来诱导。孵育适当时间后(通常为1-4周)，在此期间CTLp被激活，成熟并扩展成效应CTL，将细胞输回患者，在患者体内它们会破坏其特异性靶细胞(感染细胞或肿瘤细胞)。本发明的肽还可用来制备单克隆抗体。这些抗体可用作潜在的诊断或治疗剂。本发明的肽可以用作诊断试剂。例如，本发明的肽可以用于确定特定个体对采用肽或相关肽的治疗方案的易感性，因而能够有助于修改已有的治疗方案或有助于确定受感染个体的预后。此外，该肽还可以用于预测哪些个体将会有演变成慢性感染的实际风险。实施例材料和方法细胞。采用下列EB病毒(EBV)转化的纯合细胞系作为人HLAII类分子的来源LG2[DRB1c0101(DR1)1；GM3107[DRB50101(DR2w2a)]；MAT(DRB10301(DR3)1；PREISS[DRB10401(DR4w4)1；BIN40[DRB10404(DR4w14)1；SWEIG[DRB11101(DR5w11)]；PIOUT[DRB10701(DR7)](a)；KT3[DRB0405(DR4w15)]；Herluf[DRB11201(DR5w12)]；HO301[DRB11302(DR6w19)]；OLL[DRB10802(DR8w2)]；和HTC9074[DRB10901(DR9)，由哥伦比亚大学PaulHarris博士慷慨提供]。在一些情况下，采用了转染的成纤维细胞L466.1[DRB11501(DR2w2b)]；TR81.19[DRB30101(DR52a)]；和L257.6[DRB40101(DRw53)]。(Valli等人，J.Clin.Invest.91616(1993))。细胞通过培养在RPMI1640培养基中在体外维持，培养基中添加了2mML-谷氨酰胺[GIBCO，GrandIsland，NY]、50μM2-ME和10％热灭活的FCS[IrvineScientific，SantaAna，CA]。细胞中还添加了100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素[IrvineScientific]。大量细胞生长在旋转培养中。以PBS使浓度为108细胞/毫升的细胞裂解，该PBS中含有1％NP-40[FlukaBiochemika，Buchs，Switzerland]、1mMPMSE[CalBioChem，LaJolla，CA]、5mMNa-原钒酸、和25mM碘乙酰胺[SigmaChemical，St.Louis，Mo]。用10,000xg离心20分钟，除去裂解液中的碎片和细胞核。HLA-DR分子的亲和纯化。如以前所述的那样(Sette等人，J.Immunol.14235(1989)和Gorga等人，J.Bio1.Chem.26216087(1987))，用偶联于Sepharose4B珠的单克隆抗体LB3.1对II类分子进行亲和层析纯化。使裂解液过滤通过0.8和0.4μM滤膜，再通过抗DR柱，然后用15倍柱体积的10mMTRIS以(以1％NP-40配)、PBS和2倍柱体积的含0.4％正辛基葡糖苷PBS洗柱。最后，用50mM二乙胺(用含0.4％正辛基葡糖苷的0.15MNaCl，pH11.5配)洗脱DR。在洗脱液中加入1/25体积的2.0MTris(pH6.8)，使pH降低至约为8.0，然后在Centriprep30浓缩器(Amicon，Beverly，MA)中2000rpm离心浓缩。II类肽结合试验。本研究中采用了一组13种不同特异性DR-肽试验。选择这些试验作为DR等位基因最常见的代表。表I中列出了试验中采用的各个DR抗原、采用的代表性等位基因产物、用作DR源的细胞系以及放射性标记探针。使纯化的人II类分子[5-500nM]在蛋白酶抑制剂混合物的存在下，在含5％DMSO的PBS中与各种未标记的肽抑制剂和1-10nM125I放射性标记的探针肽一起培育48小时。所用的放射性标记探针是HAY307-319(DR1)、破伤风毒素[TT]830-843(DR2w2a，DR5w11，DR7，DR8w2，DR8w3，DR9)，MBPY85-100(DR2w2b)，TT1272-1284(DR52a)，MT65kDY3-13(Y7用F代替的DR3)，带有序列YARFQSQTTLKQKT(DR4w4，DR4w15，DRw53)的非天然(Valli等人，同上)，对于DR5w12是从细胞系CIR中洗脱出的天然加工的肽EALIHQLINPYVLS(DR5w12)，以及对于DR6w19是650.22肽(TT830-43A-S836类似物)。用氯胺-T方法碘化放射性标记肽。肽抑制剂通常在1201μg/ml-1.2ng/ml的浓度范围内进行测试。然后将数据绘图，测定产生50％抑制(IC50)的剂量。在合适的化学计量条件下，未标记的测试肽对于纯化的DR的IC50是相互作用亲和力(Kd)的合理的近似值。在2-4个完全独立的试验中对肽进行测试。蛋白酶抑制剂的最终浓度为1mMPMSF，1.3nM1.10二氮杂啡，73μM抑胃酶肽，8mMEDTA和200μMNα-p-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)[所有蛋白酶抑制剂来自CalBioChem，LaJolla，CA]。培育混合物中的最终洗涤剂浓度为0.05％NonidetP-40。除DR3在pH4.5下进行、DRw53在pH5.0下进行外，所有试验在pH7.0下进行。如以前所述的那样(Sette等人，J.Immunol.148844(1992))调节pH。在TSK2000柱(TosoHass16215，Montgomeryville，PA)上凝胶过滤，从游离肽中分离出II类肽复合物，如前所述(Sette等人，(1989)同上)那样计算结合的肽组分。在基础试验中，在固定量的放射性标记肽存在下滴定DR制备物，以测定结合总放射活性10-20％所需的II类分子的浓度。随后的所有抑制和直接结合试验用II类分子的这些浓度来进行。DR4w15，DR6w19，DR8w2，DR8w3和DR9试验的DRB1特异性由于用于纯化的抗体是α链特异性的，因此未从β3(和/或β4和β5)分子中分离出β1分子。关于DRβ链特异性试验的发展和验证已经在上述关于DR等位基因的许多文献中有详细描述(108)。这里我们首先描述DR4w15，DR6w19，DR8w2，DR8w3和DR9试验。本章节中描述的实验说明了这些新试验的β链特异性。DR4w15。β4产物DRw53和DR4w15共同表达，DR4w15结合试验特异性的确定由于DR4w15和DRw53结合试验采用相同的放射性标记配体而复杂化。由于β1链通常比其它β链的表达水平高5-10倍，且所有结合试验均采用有限量的DR，因此可以预计，试验中检测到的主要的特异性是DR4w15。为了证实事实确实如此，查验了推定的DR4w15特异性试验中的一组58种不同的合成肽的结合方式以及DRw53特异性试验中获得的结合方式(采用DRw53成纤维细胞作为II类分子来源)。注意到有两种非常不同的结合方式，在一些场合下，肽与一种DR分子高亲和力结合，且不与另一种结合(数据未显示)。DR6w19。DR6w19试验采用共同表达DRB30301(DR52a)的EBV转化的纯合细胞系H0301作为II类分子的来源。尽管DR6w19试验中所用的放射性标记配体与DR52a试验中的不同，但是此配体与高亲和力的DR52a结合物是相关的(即是单一的取代类似物)。如DR4w15例子中所作的那样，分析一组天然存在的肽对DR6w19和DR52a的结合能力，研究了该试验的特异性。两个试验证明了完全不同的结合特异性。例如，在相对结合方面，DR52a试验中的TT1272-1284结合比DR6w19试验中高63倍。相反，DR6w19试验中的不变链肽结合高189倍。总之，这些数据证明了放射性标记肽650.22与H0301细胞系纯化II类MHC分子的结合对于DR6w19是特异性的。DR8w2和DR8w3。DR8w2和SR8w3试验的β1特异性是明显的，因为β3(和/或β4和β5)分子没有表达。DR9。以前的研究已经表明TT830-834放射性标记探针肽不结合DRw53分子(Alexander等人，Immunity1751(1994))可以推断出DR9试验有特异性。结果DR限制性T细胞识别的抗原性肽的DR结合亲和力为了确定DR结合亲和力的临界值(在生物学上这被认为是很重要)，我们编辑了一组32个给定T细胞表位的DR限制性报道例子的亲和力。在大约一半的例子中，DR限制性与低于100nM的亲和力有关，在另一半例子中，IC50％在100-1000nM范围内。32个例子中只有1个(3.1％)的DR限制性与1000nM或更高的IC50％有关。注意到亲和力的这一分布与以前报道的HLAI类表位(大多数表位以50nM或更低的IC50％结合(Sette等人，JI，1994))不同。II类限制性表位相互作用的这一相对较低的亲和力可能解释了为什么II类限制性T细胞的激活通常需要比I类限制性T细胞更多的抗原的原因。总之，该分析提示了，1000nM可定为与DR分子免疫原性有关的亲和力临界值，由于这个原因，它是我们研究中的合适的靶。P1和P6锚着是DRB10401结合所必须的但还不够几个独立的研究指出，靠近肽N端的1位上的大芳香族或疏水性残基以及9个残基的核心区(残基1至9)在DRB10401结合中起关键作用。另外，证实了该9个残基核心区的6位(P6)残基起重要作用。在该位置上，短的和/或疏水性残基通常是较佳的(O’Sullivan等人，JI1472663，1991；Sette等人，JI1513163，1993；Hammer等人，Cell74197，1993和Marshall等人，JI1545927，1995)。在本组试验中，分析了384种肽的文库对DRB10401的结合能力并筛选出P1-P6基序(即，F、W、Y、L、I、V或M在P1，以及S、T、C、A、P、V、I、L或M在P6，距离肽C端至少9个残基)的存在。该组384个肽含有总共80个DR4w4结合物(binder)(具体地说，有27种好的结合物[IC50为100nM或更低]，53种中间型结合物[IC50在100-1000范围内])。80种DR4w4结合物中有77种(96％)携带了P1-P6基序。然而，应注意，大多数不结合DR4w4的肽也含有P1-P6基序。在我们的数据库中包括的384种肽中，只有125种是“P1-P6阴性的”。与“P1-P6阳性”表位的77/259(30％)相比，其中只有3种(6％)明显结合纯化的DR4w4。因此，这些结果证明合适的P1和P6锚着的存在是DRB10401结合所必需的，但还不够。DRB10401肽相互作用的详细图表下面对于每个P1-P6排列的核心区域，以类似于以前用于详细描述I类肽相互作用的策略，计算每个位置携带特定残基的肽相对于其它基团的平均结合亲和力。在进行该方法后，汇编出平均相对结合(ARB)值的表。该表还表示20种天然存在氨基酸每一个在占据相对于主要P1-P6锚位的特定位置时，对于DRB10401结合能力的正面或负面影响的图表(图1)。ARB值变化大于4倍(ARB大于等于4或小于等于0.25)就认为是显著的，并表示给定残基对于DR-肽相互作用有次级效应。大多数次级效应与4、7和9位有关。这些位置对应于DR分子上的次级锚位啮合浅穴位。另外，3位的M(ARB＝12.8)、3位的T(ARB＝4.34)和5位的I(ARB＝4.4)检测到有明显的次级效应。DRB10401具体算法的开发下面，用ARB表开发出DRB10401的具体算法。为了预测0401的结合倾向，通过乘以每个位置的合适氨基酸的ARB值，对于每种P1-P6排列序列进行评分。根据该程序，获得以数字表示的“算法评分”。如果P1-P6排列有多种可能，则计算每一种排列的结合评分并选出最佳的评分。该方法预测0401结合能力的效果显示在表IIa中。仅考虑算法评分高于-17.00的肽，从而将预测的肽组缩小到156个。该组中仍含有总共80个高的或中等的DR结合物中的72个(90％)。将算法评分的截断值提高到-16.44或更高，仍鉴定出了80个DR4w4结合肽中的60个(75％)。在总共为107个肽的组中，有25个是良好的或中等的结合物。换句话说，如所预计的那样，提高算法评分的严谨度预示了存在该组中的总结合物的更少部分，但是同时也确定了更少的假阳性肽。DRB10401具体算法预测能力的盲试验为了验证我们算法的预测能力不仅仅能反映采用相同数据组可测试和确定算法本身，我们还进一步在盲预测试验中检验了它的效果。对于这一范围，我们采用了独立的50个肽组的数据，这些肽的结合亲和力是已知的，但是并未用来获得算法。如表IIb所示，此算法在预测该独立肽组的DR4w4结合能力上是有效的。-17.00的算法评分鉴定出总共18个肽。该组含有整个50个肽的测试组中所有(3/3(100％))好的结合物，以及所有中等结合物的70％(8/11)。将截断值提高到-16.44，鉴定出9个肽，其中7个(78％)是好的或中等的结合物。该组含有盲预测肽组所含14个结合物中的7个(50％)。结论是，这些数据证实了上述DR4w4具体算法是正确的。DRB10401，DRB10101以及DRB10701肽结合特异性的详细图表下面，我们分析用于确定DR4w4算法的同一组的384个肽与纯化的DR1和DR7分子的结合。发现该组分别含有120个和59个DR1和DR7等位基因的结合物。总共有158个肽能与DR1、DR4w4或DR7结合。其中大部分(73/158；46％)也是简并结合物，它们能与有待考虑的三个等位基因中的两个或更多个结合。而且，我们还发现超过90％的DR1或DR7的好的和中等的结合物携带了P1-P6基序。最重要的是，73个简并DR结合物中有72个(99％)携带了该基序(数据未显示)。结论是，这一分析表明，P1-P6为基础的算法可用于有效地预测简并DR结合物。以类似于上述DR4w4分子的方法，设计DR1和DR7等位基因的具体算法。图2A和2B详细描述了根据本发明确定的等位基因特异性图表。在DRB10401例子中，大多数次级效应集中于4、7和9位。在DR1例子中，4位是尤其显著的，而7位是DR7的最显著的次级锚位。根据这些图表开发出具体的算法，并发现，预测75％或90％的结合物所需的截断值对于DR1来说是-19.32和-20.28，对于DR7来说为20.91和-21.63。根据所选的特定等位基因或截断值，预测的肽40-60％实际上是良好的或中等的结合物(数据未显示)。DR1-4-7组合算法的开发最后，我们检验了是否可用组合算法来预测简并结合物。出于这个目的，用三个(DR1，4w4和7)具体算法来同时筛选我们的数据库中384个肽的序列。结果发现，预测(用75％截断值)到有100个肽与所考虑的等位基因中的两个或三个结合。该组含有73个实际上能1-4-7简并结合(定义为能结合DR1，4w4或7等位基因中一个以上的等位基因)的肽中的59个(81％)(表III)。代表全世界人口的DR特异性目标组的定义前面章节中列出的数据描述了怎样用组合的″1-4-7″算法来鉴定能结合多个DR等位基因的肽。下面，我们希望检验表现出1-4-7简并结合行为的肽是否还与其它常见的DR类型结合。我们的试验策略的第一步是，试图确定一组代表全球人口大部分(80％)的靶DR类型(不管人种群起源如何)。出于这个目的，还考虑了其它7个DR抗原。对于本研究中考虑的每一个DR抗原(包括DR1，4和7)，根据最近的HLA研讨会(第11期，1991)，不同人种中的估计的频率以及有待鉴定的主要亚型显示在表IVa中。为了测定肽对不同DR分子的结合亲和力，，对于每种DR抗原选择一个代表性亚型(表I)。应注意，对应于大多数抗原，有一种亚型迄今是最丰富的，或者每种DR抗原的不同的最丰富的亚型表现出的结合方式可能存在很大程度的相似性(见表IVb的评论栏)。DR4抗原代表了该常见趋势的一个例外，已经报道DR4抗原在0401和0405之间的肽特异性有明显差异。由于这两个等位基因均是非常常见的(分别在白种人和东方人中)，因此我们在代表性DR结合试验组中包括了DR0401和0405。我们的代表性试验组主要侧重于基因的等位基因产物，因为这些分子看来表达最为丰富，起着所分析的大多数人III类应答主要限制性元件的作用，而且血清学方法很准确，又很容易获得DNA分类。然而，在我们的分析试验中，我们还考虑了DRB3/4/5分子的代表性(表IVc)。这些分子起着功能性限制元件作用，前经表明，它们的肽结合特异性与几种常见DRβ1等位基因产物的特异性有某些相似性。预测DR-简并结合物的总和策略为了测试1-4-7组合算法是否也能预测与其他常见DR型的简并性结合，我们测定了三组不同合成肽结合一组纯化HLADR分子的能力。这三组不同的肽是A)在组合算法1-4-7中分值不为正(非预测)的36条肽，B)截留比为75％时的1-4-7算分为正值，预测DR-简并结合物的总策略为了测试1-4-7组合算法是否也预测与其他常见DR型的简并性结合，我们测定了三组不同合成肽结合一组纯化HLADR分子的能力。这三组不同的肽是A)在组合算法1-4-7中分值不为正(非预测)的36条肽，B)截留比为75％时的1-4-7算分为正，但经实际试验却不是1-4-7简并结合物(错误预测)的36条肽，和C)在1-4-7组合算法中分值为正，而且经试验证明的确是1-4-7简并结合物(正确预测)的29条肽。以上分析的结果见表V。在“非预测”肽组中，34条中只有3条(9％)结合至少DR分子、4w4或7分子中的两种。有趣的是，这3条肽中的2条(1136.04和1136.29)有相当的交叉反应性，还与其他DR型结合(1136.04结合DR2w2β2、DR4w15、5w11和8w2，1136.29结合2w2β2、4w15、9和5w12)。“错误预测”组中的肽(表V5)，至多只明确结合DR1、4w4或DR7分子之一，而且简并性很低，或是其他DR型，其中只有两条肽(1136.22和1188.35)与上述3种DR分子都结合。在这组肽中，没有一种肽结合4种或4种以上被测DR分子(数据未显示)。以上结果与由以下肽获得的数据相反，这组肽对应于最初用组合算法1、4、7预测并经实验证明为简并结合DR1-4-7的肽。29条肽中有14条(48％)结合总共5个或5个以上等位基因。其中4条具有明显的简并性(1188.16，1188.32，1188.34和F107.09)，并结合总共11种被测DR分子中的9种。所以，以上结果显示依次使用组合的DR1、4、7算法和定量的DR1、4、7结合实验，该基础上的策略可用来鉴定具有广泛交叉反应性的DR结合肽。HLA-DR1-4-7超型的定义以上数据还表明几种常见DR型的特点在于高度重叠的肽结合特性。通过分析表Va和b中32条肽(都是真DR1-4-7结合物)的结合方式对这一问题进行了更详细地研究，。其中31条(97％)结合DR1，22条(69％)结合DR4w4，21条(66％)结合DR7。这些数据与就其他非简并结合肽所观察到的低结合百分比(针对DR1、4w4和7分别为17/67(25％)，8/67(12％)和7/67(10％))(表VII)形成对照。有趣的是，1-47简并结合物中大部分还结合其他常见DR型。其中16条(50％)结合DR2w2，18条(56％)结合DR6w19，18条(56％)结合DR2w2b，20条(62％)结合DR9。在各种情况下，非1-4-7简并肽的结合频率都低得多(表VIII)。DR4w15、DR5w11和DR8w2也有尽管较较低但是明显的交叉反应频率(介于28至37％)。最后，DR3和5w12和DR53仅表现微不足道的交叉反应性。进一步的研究将涉及这两组分子(一组是DR4w15、DR5w11和DR8w2，另一组是DR3和5w12和DR53)是否属于不同的DR超型。总之，以上信息表明包括DR1、4w4、2w2a、2w2b、7、9和6w19在内的DR分子大组其特征在于具有高度重叠的肽结合特性。讨论本报告中，我们已经分析了一组13种不同DR分子的肽结合特异性，它们代表着世界人群中常见的几种DR型。由其中3种(DR4w4、DR1和DR7)得到了次级锚位和次级相互作用的详细图谱。而且，我们还证明一组包含至少7种不同DR型的分子所共有的重叠性肽结合特性；因此，这种广泛简并的HLADR结合肽相对常见。以上研究还描述了极其有助于鉴定这类简并肽的计算机程序。我们希望讨论有关II类肽相互作用的现有知识，以及最近报道的I类超基序的以上数据。最后，还应该考虑II类表位的广泛简并性对基于表位的疫苗设计的影响。首先，我们的研究阐明了本研究中接受分析的、以良好的亲和性结合DR4w4、DR1、DR7和其他大多数DR型(数据未显示)中绝大多数肽如何以P1-P6基序为特征，这一基序与最先由O’Sullivan等所提出的一致。对DR1-肽复合物的晶相分析揭示这些位置上的残基占据了DR1分子上两个互补的空穴，P1位置对应于最关键的锚着残基，而且是最深的疏水穴。我们的分析还显示其他“次级锚着”位置如何以等位基因特异性方式显著影响着肽结合能力。第4位被发现对于结合DR1来说尤其重要，第9位对结合DR4w4特别重要，第7位对结合DR7尤其重要。以上数据与最早描述这种等位基因特异性锚着的结果一致，也与显示这些残基如何占据DR分子上空穴的晶相数据一致。其次，我们的研究说明了以大型肽文库的排列和平均相对结合值的计算得出的方法如何确定了预测结合能力的定量算法。本研究将观察结果扩展到了另两种常见HLA-DR型，还阐明了组合使用算法1-4-7如何帮助鉴定广泛简并性DR结合肽。本文中的数据提示至少包括DR1、DR2w2a、DR2w2b、DR4w4、DR6w19、DR7和DR9在内的一组常见DR等位基因都具有有高度重叠的肽结合特性。Lanzavechia，Sinigallia研究小组和Rothbard研究小组最早记述了简并肽结合多种DR等位基因并识别多种等位基因的相同表位。本研究对从属于主要HLA-DR超型(DR1-4-7样)的等位基因(其中包括DR1、DR2w2a、DR2w2b、DR4w4、DR6w19、DR7和DR9)进行了分类。根据本文信息，至少还另有两组等位基因存在。第一组(DR4w15、8w2、5w11)编码与1-4-7样超型明显重叠但是程度较低的分子。显然，另一组等位基因(5w12、3w17和w35)几乎不具有与1-4-7相关的特性。因此必须注意，Hammer等曾提出良好的DR5w11结合肽常以带正电的P6锚位(无法与本发明提出的1-4-7超基序相比)为特征。还必须注意的是，Sidney等曾提出DR3w17结合与其他DR型所结合的肽极其不同的一组肽。进一步的研究要确定的是以上列出的任何一种分子是否可以归为其他DR超型。我们研究组目前研究的是对沿肽结合穴排列的多形性残基的分析是否能够用来帮助HLADR超型的分类和预测。我们想要评论的是本文所述HLADR超型与最近报道的HLAI类超型之间的差异。I类超基序是明确的，而且是非重叠性的(作为一条规则)。据报道，其中4种在世界人群中具有几乎相同的频度。相比之下，本文所定义HLADR超型库是不明确的，是与其他等位基因库相互重叠的，至少部分重叠。而且，根据本文表I和IV中的数据，即使存在其它DR超型，DR1-4-7看来也是迄今世界上最多的。最后，我们想指出的是以上数据在开发基于表位的疫苗方面可能有关联。II类限制性HTL已经作为处方用于预防和治疗多种重要的疾病。将定义明确的II类表位包含在预防或治疗用疫苗中将使得免疫应答集中针对保守性表位或亚优势表位成为可能，而且避开了抑制决定簇。根据本文数据(表IV)，DR1-4-7超型包括了人群50至80％的范围，这还具体取决于所考虑的种族。所以，通过考虑数量很有限的肽结合特异性，就可能实现广泛但是非种族偏向性的人群覆盖。根据以上结果，浏览各种感兴趣抗原的序列，检测是否存在DR1-4-7基序。用该方法鉴定出的肽具有广泛的交叉反应性，是II类限制性T细胞表位。表VIII列出了这些肽，它们来自HBV、HCV、HIV和恶性疟原虫(Pf)。总共鉴定得到146条肽35条来自HBV，16条来自HCV，50条来自HIV，45条来自Pf。应用时，使用的是标准的保守性(conservancy)标准。以上实施例用来说明本发明，而不限定本发明的范围。对本领域熟练技术人员来说，本发明的其他变化形式是显而易见的。出于各种目的，本文将在此引用的所有出版物、专利和专利申请均纳为参考。表I本研究使用的HLA-DR结合试验代表性试验抗原等位基因别名细胞系放射性标记探针文献评论DR1DRBl*0101(DR1)LG2HAY307-3191)(8)01是最主要的DR1等位基因。DR2DRB1*1501(DR2w2b)L466.1MBP88-102Y2)(8)0101是最主要的DR2等位基因。DR3DRBl*0301(DR3w17)MATMT65kDY3-13(8)01在大多数人群中是同系物3)最主要的DR3等位基因。01和02在NABlack中平均割裂(split)。DR4DRBl*0401(DR4w4)Preiss非天然YAR肽4)(8)01是最主要的DR4等位基因。DRBl*0405(DR4w15)KT3非天然YAR肽本论文05是东方人中最主要的DR4等位基因。DR7DRB1*0701(DR7)PitoutTT830-8435)(8)01/02的第1位不同，该位置在结合沟之外。DR8DRB1*0802(DR8w2)OLLTT830-843本论文02在大多数主要人群中是优势的。02和03具有几乎相同的结合特异性(J.Sidney&A.Sette，尚未公开)。DR9DRB1*0901(DR9)9074TT830-843本论文DR9割裂是沉默突(HID)变的产物。DR11DRB1*1101(DR5w11)SweigTT830-843(8)01是迄今最主要的DR11等位基因。DR12DRB1*1201(DR5w12)HerlufC1R衍生肽6)(9)01/02分布相当。两等位基因的第67位不同，这似乎并不明显影响肽结合特性。DR13DRB1*1302(DR6w19)HO301650.22(TT830-(10)02比01略为多843同系物)7)见。两等位基因的第86为不同(对决定P1锚特异性是关键性的)。DR51DRB5*0101(DR2w2a)GM3107TT830-8435)(8)0101是最主要的割裂。DR53DRB4*0101(DR4，DR7，L257.6非天然YAR肽4)(8)0101实际上是唯一DR9)的等位基因。1)YPKYVKQNTLKLAT6)EALIHQLKINPYVLS2)VVHFFKNIVTPRTPPY7)QYIKANAKFIGITE3)YKTIAFDEEARR8)Vellietal.，J.Clin.Invest.91616，1993.4)YARFQSQTTLKQKT9)Falketal..Immunogenetics39230，1994.表II预测DRB1*结合能力的算法a)原始肽组肽编号(结合浓度nM)选择标准高≤100中等100-000无＞1000总数无2753304384P1-P62750182259-17.00274584156-16.442535471071)预测所有结合物中90％的计算值2)预测所有结合物中70％的计算值b)预测DRB1*0401结合能力的盲试算法肽编号(结合浓度nM)选择标准高≤100中等100-1000无＞1000总数无3113650P1-P6392840-17.0038718-16.443429表III“1-4-7”组合算法选择标准简并结合物1)总简并结合物百分比无73/384100％P1-P672/25999％组合算法(截断值67/14792％90％)组合算法(截断值59/10081％90％)4)简并结合物即至少结合DR1、4w4和7分子中两种的肽，IC50不超过1μM。表IV10种主要HLA-DR抗原的表型频率<p>表VA)非预测结合能力DR1，4，7其它等位基因结合等肽DR1DR4w4DR7DR2w2bDR2w2aDR3DR4w15DR5w11DR6w19DR8w2DR9DR5w12位基因总数1136.293243271381.1468-7456250-2970183100071136.04242033331264741-56369-552885-61136.1978119151323861250-445183166750523125-41136.49--505-702-250645-15814167909141136.02.01a806--284416--1379-338-992731136.35116--2459--10861268750306-136431136.52-703155639571667-563---2419-21136.0379865420332431250-1689--73133947357121136.0619231364--3136977-6908750---21136.23962--262-2727--3182---21136.3237--17171739-6266250-1976--21136.3352--82736250-7600183587503161-47621136.44.01526780----65524000-6364--21136.62.01a----449--396-29703000-21136.42-1875--769--95248750---11136.548333-------761--272711136.07.01b1190-463015422857--1980-1225261421411136.05-492----------11136.08-9375378873------2027-11136.251163-6250283846---2917--384611136.3445455453247-------5000-11136.36204--5688------12931-11136.64-225----1267-5000---11136.69--------54-5769-11136.40454515468333-4348---7000---01136.50-1875----66677143-5506--01136.56-4500----3918-3500---01136.57-8654-6500--57581626-51044688-01136.61----------7979-01136.66------------01136.68------------01136.70-------3704----01136.72------------01136.63.01a----1905--7692-4298--0-表示结合亲和力≥10,00034条中的2条(59％)对5种活5种以上DR型具有简并性。表VB)正确预测结合能力(IC50％nM)DR1，4，7其它等位基因结合等DR1DR4w4DR7DR2w2bDR2w2aDR3DR4w15DR5w11DR6w19DR8w2DR9DR5w12位基因总数1188.163.77.114125123-47304284628-91188.323.144167-29-1402117.11912685191188.34141266370148133295927033.768194979F107.094.114395028286-32496346938529-927.41214282138-323--312053590249581188.45269.057260123757105725323.92816-81136.161.621446162534-7413571129648868-71136.212.25152284462-27012122591420132-71136.110.89999615603261-84315-52919743243727.39241449333102499-166812039.888362-627.41756-425210251--47118422177859251261136.38701222404258741-133400038-8627321627.388505737497181635-141054266-708-527.403784146207132875--73-1672423348851136.715.177696-1212-95015381400-375-51136.145.3478710081135-792---7732-51136.2418258443915069524-1357-6.5---427.38466-281357----65-458-41188.13116692358382--1069-0.77-142-4F107.10120272867807--1647-5.5-135-4F107.17221388---48785705-76764029934784F107.2316357131414413--6770-14-151-41136.121057201429142128-1583-34329172500-41136.472.24072119303755-53524255----41136.280.2384936232.21481-6667952431827538-447831136.55651382451---27145455000---31136.59.01a13039--29-3140-----327.4152011754718653---671222348997--21136.46689855814---------2-表示结合亲和力≥10,000表VI“1-4-7”简并结合物结合能力(IC50％nM)DR1，4，7其它等位基因肽序列结合等位DR1DR4w4DR7DR2w2bDR2w2aDR3DR4w15DR5w11DR6w19DR8w2DR9DR5w12基因总数1188.34HNWVNHAVPLAMKLI+++++-+-++++101188.32GLAYKFVVPGAATPY+++-+--+++++91188.16KSKYKLATSVLAGLL+++-+-+++++-9F107.09KYKLATSVLAGLLGN+++-+-+++++-91188.45RHNWVNHAVPLAMKL++++++--+++-927.412AYKFVVPGAATPYAG+++-+--++++-81136.11VVFPASFFIKLPIILA++-++-++-+--71136.16LTSQFFLPALPVFTWL+++-+-+--++-71136.21IPQEWKPAITVKVLPA+++-+-+-+-+-71136.29GPPTALRSFGFAFGYM+-+++-+---++727.392SSVFNVVNSSIGLIM++++----+++-727.417VKNVIGPFMKAVCVE+-+++--++-+-71136.04LFHYYFLSEKAPGSTV++--+-++-+--627.388MRKLAILSVSSFLFV+-++---++-+-61136.38SSIIFGAFPSLHSGCC++-++-+---+-627.403LVNLLIFHINGKIIK+-++---++-+-61136.71EPQGSTYAASSATSVD+++---+---+-51136.14FATCFLIPLTSQFFLP+-+++-+-----527.384FNVVNSSIGLIMVLS+-++----+-+-51188.13AGLLGNVSTVLLGGV+-++----+-+-5F107.10LAGLLGNVSTVLLGG+-++----+-+-51136.47THHYFVDLIGGAMLSL++-++-------41136.12IKLPIILAFFATCFLIP++-+----+---4F107.23VFNVVNSSIGLIMVL+-+-----+-+-41136.24NLSNVLATTTTGVLDI+-++----+---4F107.17KFVVPGAATPYAGEP++------+-+-41136.28LAAIIFLFGPPTALRS++-+--------31136.55QEIDPLSYNYIPVNSN++----+-----31136.59.01aRVYQEPQVSPPQRAET++--+-------327.415NVKYLVIVFLIFFDL-+++--------31136.46LWWSTMYLTHHYFVDL++----------21136.44.01WLFPRFKFVWVTYASW++----------2312221181611291810203-表示结合亲和力≥10,00029条中的16条(55％)对5种活5种以上DR型具有简并性。表VII结合物频率DR型1-4-7简并结合物(％)非1-4-7简并结合物(％)131/32(97)17/67(25)4w422/32(69)8/67(12)721/32(66)7/67(10)920/32(62)2/67(3.0)6w1918/32(56)6/67(8.9)2w2βb18/32(56)16/67(24)2w2βa16.32(50)10/67(15)4w1512/32(37)4/67(6.0)8w210/32(31)3/67(4.5)5w119/32(28)6/67(8.9)5w123/32(9.4)4/67(6.0)3w171/32(3.1)0/67(0)w532/16(13)7/43(16)表VIII<</tables>II类肽肽AA序列来源008.0016SALLSSDITASVNCAKHEL81-96200.0616SALSEGATPQDLNTMLHIVgp2541-56213.1016NKALELFRKDIAAKYKSp.W.myo.132-147506.0120NKALELFRKDIAAKYKELGYSWMyo132-151506.0518ALELFRKDIAAKYKELGYSp.Wmyo.134-151506.0316ELFRKDIAAKYKELGYSp.Wmyo.136-151570.0116MAKTIAYDEEARRGLEHeatShockProt705.0620KVYLPRMKMEEKYNLTSVLMOva279-298717.0414YASFVKTTTLRKFT-NH2组合的优化的DR2857.0220PHHTALROAILCWGELMTLAHBVcore50-69865.0115YKMKMVHAAHAKMKMOVAKM核心延伸F050.0320GFYTTGAVRQIFGDYKTTICPLP91-110F089.0115QNILLSNAPLGPQFP酪氨酸酶56-70F098.0320AAYAAQGYKVLVLNPSVAATHCVNS31242-1261F098.0420GYKVLVLNPSVAATLGFGAYHCVNS31248-1267F098.0514GYKVLVLNPSVAATHCVNS31248-1261F098.0619SYVNTNMGLKFRQLLWFHIHBV核心87-105F098.1012GLKFRQLLWFHIHBV核心94-105F134.0420TLHGPTPLLYRLGAVQNETTHCVNS41-20F134.0520NFISGIQYLAGLSTLPGNPAHCVNS4151-170F134.0821GEGAVQWMNRUAFASRGNHVHCVNS4293-313(1914-1934)IA-p517KPVSQMRMATPLLMRPM小鼠非变异链85-101Tr-28p124LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM人非变异链80-10327.027915EYLVSFGVWIRTPPAHBVNUC11727.028015GVWIRTPPAYRPPNAHBVNUC12327.028115RHYLHTLWKAGILYKHBVPOL14527.028315VPNLQSLTNLLSSNLHBVPOL40927.028815WVTVYYGVPVWKEATHIV1ENV4727.029315YYGVPVWKEATTTLFHIV1ENV5127.029415VPVWKEATTTLFCASHIV1ENV5427.029515LSGIVQQQNNLLRAIHIV1ENV71127.029615QQHLLQLTVWGIKQLHIV1ENV72827.029715QHLLQLTVWGIKQLQHIV1ENV72927.029815LLQLTVWGIKQLQARHIV1ENV73127.030415QGQMVHQAISPRTLNHIV1GAG17127.030715SPEVIPMFSALSEGAHIV1GAG19727.031015QEQIGWMTNNPPIPVHIV1GAG27627.031115GEIKRWIILGLNKIHIV1GAG29427.031215YKRWIILGLNKIVRMHIV1GAG29727.031315KRWIILGLNKIVRMYHIV1GAG29827.031415WIILGLNKIVRMYSPHIV1GAG30027.031515VKNWMTRTLLVQNANHIV1GAG34827.032215GTVLVGPTPVNIIGRHIV1POL15327.032415PVNIIGRNLLTQIGCHIV1POL16127.032615GRNLLTQIGCTLNFPHIV1POL16627.032815TLNFPISPIETVPVKHIV1POL17627.032915NFPISPIETVPVKLKHIV1POL17827.034115FRKYTAFTIPSINNEHIV1POL30327.034415SPAIFQSSMTKILEPHIV1POL33527.034515PAAIFQSSMTKILEPFHIV1POL33627.034915QKLVGKLNWASQIYAHIV1POL43727.035015VGKLNWASQIYAGIKHIV1POL44027.035115NREILKEPVHGVYYDHIV1POL48527.035315IPEWEFVNTPPLVKLHIV1POL59327.035415WEFVNTPPLVKLWYQHIV1POL69627.036015EQLIKKEKVYLAWVPHIV1POL70527.036115EKVYLAWVPAHKGIGHIV1POL71127.036415HSNWRAMASDFNLPPHIV1POL75827.037015ASGYIEAEVIPAETGHIV1POL82227.037215AEHLKTAVQMAVFIHHIV1POL91127.037315KTAVQMAVFIHNFKRHIV1POL91527.037715QKQITKIQNFRVYYRHIV1POL95627.037915KLLWKGEGAVVIQDNHIV1POL98227.038115ENRWQVMIVWQVDRMHIV1VIF227.038215VEAIIRILQQLLFIHHIV1VPR5727.038415FNVVNSSIGLIMVLSPfCSP41327.038715MNYYGKQENWYSLKKPfCSP5327.038815MRKLAIISVSSFLFVPfCSP227.039015NSSIGLIMVLSFLFLPfCSP41727.039215SSVFNVVNSSIGLIMPfCSP41027.039315MKILSVFFLALFFIIPfEXP1127.039815FILVNLLIFHINGKIPfLSA11127.040015HILYISFYFILVNLLPfLSA1327.040215LLIFHINGKIIKNSEPfLSA11627.040315LVNLLIFHINGKIIKPfLSA11327.040615NLLIFHINGKIIKNSPfLSA11527.040815QTNFKSLLRNLGVSEPfLSA19427.041215AYKFVVPGAATPYAGPfSSP251427.041515NVKYLVIVFLIFFDLPfSSP2627.041715VKNVIGPFMKAVCVEPfSSP222327.041815WENVKNVIGPFMKAVPfSSP22201186.0415CSVVRRAFPHCLAFSHBVPOL5341186.0615FVQWFVGLSPTWVLSHBVENV3421186.1015LAQFTSAICSWRRAHBVPOL5261186.1515LVPFVQWFVGLSPTVHBVENV3391186.1815NLSWLSLDVSAAFYHHBVPOL4221186.2515SFGVWIRTPPAYRPPHBVNUC1211186.2615SPFLLAQFTSAICSVHBVPOL5221186.2715SSNLSWLSLDVSAAFHBVPOL4201188.0115DKELTMSNVKNVSQTPfLSA1811188.1315AGLLGNVSTVLLGGVPfEXP1821188.1616KSKYKLATSVLAGLLPfEXP1711188.3215GLAYKFVVPGAATPYPfSSP25121188.3415HNWVNHAVPLAMKLIPfSSP2621188.3515IGPFMKAVCVEVEKTPfSSP22271188.3815KYKIAGGIAGGLALLPfSSP24941188.4515RHNWVNHAVPLAMKLPfSSP261F091.1515IKQFINMWQEVGKAMYHIV1ENV566F107.0315LQSLTNLLSSNLSWLHBVPOL412F107.0415PFLLAQFTSAICSVVHBVPOL523F107.0915KYKLATSVLAGLLGNPfEXP173F107.1015LAGLLGNVSTVLLGGPfEXP181F107.1115RHPFKIGSSDPADNAPfEXP1107F107.1415ANQLVVILTDGIPDSPfSSP2153F107.1715KFVVPGAATPYAGEPPfSSP2516F107.2315VFNVVNSSIGLIMVLPfCSP41235.009315VGPLTVNEKRRLKLIHBVPOL9635.009615ESRLWVDFSQFSRGNHBVPOL38735.010015LCQVFADATPTGWGLHBVPOL68335.010615VVVVATDALMTGYTGHCV143735.010715TVDFSLDPTFTIETTHCV146635.012515AETFYVDGAANRETKHIVPOL61935.012715EVNIVTDSQYALGIIHIVPOL67435.013115WAGIKQEFGIPYNPQHIVPOL87435.013315GAVVIQDNSDIKVVPHIVPOL98935.013515YRKILRQRKIDRLIDHIVVPU3135.017115PDSIQDSLKESRKLNPfSSP216535.017215KCNLYADSAWENVKNPfSSP22111280.0215IGTVLVGPTPVNIIGHIVPOL1521280.0315KVYLAWVPAHKGIGGHIVPOL7121280.0415TKELQKQITKIQNFRHIVPOL9521280.0615AGFFLLTRILTIPQSHBVENV1801280.0815GFFLLTRILTIPQSLHBVENV1811280.0915GTSFVYVPSALNPADHBVPOL7741280.1215IIFLFILLLCLIFLLHBVENV2441280.1315KFAVPNLQSLTNLLSHBVPOL4061280.1515LHLYSHPIILGFRKIHBVPOL5011280.1615LLCLIFLLVLLDYQGHBVENV2511280.2115VGLLGFAAPFTQCGYHBVPOL6371280.2215FYFILVNLLIFHINGPfLSA191280.2315KSLLRNLGVSENIFLPfLSA1981280.2515RGYYIPHQSSLPQDNPfLSA116691283.0215VYLLPRRGPRLGVRAHCV核心341283.1015GHRMAWDMMMNWSPTHCVE13151283.1115CGPVYCFTPSPVVVGHCVNS1/E25061283.1215VYCFTPSPVVVGTTDHCVNS1/E25091283.1315GNWFGCTWMNSTGFTHCVNS1/E25501283.1415FTTLPALSTGLIHLHHCVNS1/E26841283.1615SKGWRLLAPITAYAQHCVNS310251283.1715DLYLVTRHADVIPVRHCVNS311341283.2015AQGYKVLVLNPSVAAHCVNS312511283.2115GYKVLVLNPSVAATLHCVNS312531283.2215VLVLNPSVAATLGFGHCVNS312561283.2415GARLVVLATATPPGSHCVNS313451283.2615DVVVVATDALMTGYTHCVNS314361283.3015FTLGTHIDAHFLSQTHCVNS315671283.3115YLVAYQATVCARAQAHCVNS315911283.3315LEVVTSTWVLVGGVLHCVNS416581283.3415TWVLVGGVLAALAAYHCVNS416641283.3615AKHMWNFISGIQYLAHCVNS417671283.3715IQYLAGLSTLPGNPAHCVNS417771283.4415MNRLIAFASRGNHVSHCVNS419211283.5015SYTWTGALITPCAAEHCVNS524561283.5515GSSYGFQYSPGQRVEHCVNS526411283.5715LELITSCSSNVSVAHHCVNS528131283.6115ASCLRKLGVPPLRVWHCVNS529391298.0215VGNFTGLYSSTVPVFHCVPOL531298.0315TNFLLSLGIHLNPNKHCVPOL5681298.0415KQCFRKLPVNRPIDWHCVPOL6151298.0615KQAFTFSPTYKAFLCHCVPOL6611298.0715AANWILRGTSFVYVPHCVPOL7641298.0815PDRVHFASPLHVAWRHCVPOL8241298.1015IRPVVSTQLLLNGSLHIV1ENV3331298.1115RSELYKYKVVKIEPLHIV1ENV6371298.1315DRFYKTLRAEQASOEHIV1GAG3331298.1615KVILVAVHVASGYIEHIV1POL813F125.0217LVNLLIFHINGKIIKNSPfLSA113F125.0416RHNWVNAVPLAMKLIPfSSP6权利要求1.一种组合物，它包含诱导CTL应答的分离的肽和含有9个残基基序的T辅助细胞肽，其中所述基序N末端起首位是Y、F、W、L、I、V、M，所述基序N末端起第6位是S、T、C、A、P、V、I、L、M。2.根据权利要求1所述的组合物，其中的T辅助细胞肽由约10至24个残基构成。3.根据权利要求1所述的组合物，其中的T辅助细胞肽由病毒抗原衍生而得。4.根据权利要求3所述的组合物，其中的病毒抗原来自HIV、HBV或HCV。5.根据权利要求1所述的组合物，其中的T辅助细胞肽由寄生虫衍生得到。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述的抗原是恶性疟原虫。7.根据权利要求1所述的组合物，其中诱导CTL应答的肽与T辅助细胞肽相连。8.一种在患者体内诱导CTL应答的方法，该方法包括将患者的细胞毒性T细胞与诱导CTL应答的分离的肽及含有9个残基基序的T辅助细胞肽接触，其中所述基序N末端起首位是Y、F、W、L、I、V、M，所述基序N末端起第6位是S、T、C、A、P、V、I、L、M。9.根据权利要求8所述的方法，其中的接触步骤通过给予患者包含CTL应答的肽和T辅助细胞肽的编码核酸的药物组合物来进行。10.根据权利要求8所述的方法，其中诱导CTL应答的肽与T辅助细胞肽相连。11.一种组合物，它包含表VIII中列出的肽。12.一种在患者体内诱导辅助性T细胞应答的方法，该方法包括将辅助性T细胞与权利要求11中的肽接触。13.根据权利要求12所述的方法，其中的接触步骤通过给予患者包含所述肽的药物组合物来进行。14.根据权利要求12所述的方法，其中的接触步骤通过给予患者包含编码所述肽的核酸的药物组合物来进行。全文摘要本发明基于HLADR4w4、DR1和DR7的肽结合特异性。结合于这些DR分子的肽具有一基序,该基序的特征是在1位上为大芳香族残基或疏水残基(Y、F、W、L、I、V、M)以及在6位上为小的、不带电荷的残基(S、T、C、A、P、V、I、L、M)。此外,确定了等位基因特异性的二级效应和二级锚位,这些结果被用于推导等位基因特异性算法。通过联合利用这些算法,鉴别出具有简并DR1、4、7结合能力的肽。文档编号A61K38/00GK1251042SQ98803631公开日2000年4月19日申请日期1998年1月23日优先权日1997年1月23日发明者A·塞特,J·悉尼,S·索思伍德申请人:埃皮缪纳股份有限公司