用于监测对抗smad7疗法的反应性的方法
【专利摘要】公开了用于监测患者对使用抗SMAD7疗法的治疗敏感还是有抗性的方法。所述方法是基于来自于所述患者的样本中CCR9+FOXP3+T细胞、CCR9+IFN-γ+T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FOXP3+T细胞、IFN-γ+T细胞和/或IL17A+T细胞的量的测定。T细胞群体的测量可以通过流式细胞术、免疫组织化学和/或ELISA来测定。
【专利说明】用于监测对抗SMAD7疗法的反应性的方法
[0001]对相关申请的参考
[0002]本申请要求2011年9月15日提交的欧洲申请EP 11425234.9的利益和2011年12月16日提交的美国申请61/576，556的利益，所述申请的全部公开内容在此通过引用并入本申请用于所有目的。
【背景技术】
[0003]炎症性肠病(IBD)是胃肠道的慢性炎性障碍，在美国有大约一百万人患有此病。IBD的两种最常见形式是克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。尽管CD能够影响整个胃肠道，但它主要影响回肠(小肠的远端或下部)和大肠。UC主要影响结肠和直肠。当前用于CD和UC两者的治疗包括氨基水杨酸酯类(例如5-氨基水杨酸、柳氮磺胺吡啶和美沙拉嗪)、抗生素(例如环丙沙星和甲硝唑)、皮质类固醇(例如布地奈德或泼尼松)、免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤或甲氨喋呤)和肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂(例如英夫利昔单抗(Remicadeu))。患者对这些疗法的反应随疾病严重性而变，并且它可以随活动性炎症和缓解的循环而变。此外，目前用于IBD的许多疗法伴有不良的副作用。
[0004]尽管CD和UC的病因未知，但两者都被认为是肠粘膜的炎性疾病。最近的研究证实，TGF-β I起到能够控制粘膜性肠炎的强力免疫调节剂的作用。TGF-β I结合含有两个亚基TGF-β IRl和TGF-β 1R2的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体异源二聚体。在配体结合后，TGF-β IRl受体被组成性活化的TGF-β 1R2受体磷酸化，并通过属于SMAD家族的蛋白将信号传导到细胞核。激活的TGF-β IRl直接磷酸化SMAD2和SMAD3蛋白，然后它们与SMAD4相互作用。SMAD2/SMAD3/SMAD4复合体易位到细胞核，并调节某些基因的转录。
[0005]其他研究证实，另一种SMAD蛋白SMAD7也在炎症中发挥作用。SMAD7这种细胞内蛋白已被证明干扰SMAD2/SMAD3与TGF-β IRl的结合，阻止这些蛋白的磷酸化和活化。此夕卜，SMAD7蛋白的表达增加与TGF-β I介导的信号传导的抑制相关。来自于IBD患者的粘膜样本具有高水平的SMAD7和低水平的磷酸化SMAD3的特征，表明在这些患者中TGF-β I介导的信号传导受损。
[0006]最近的研究聚焦于将SMAD7作为治疗患有IBD的患者的祀点。这样的疗法包括抗SMAD7反义疗法。就此而言，需求一种基于预测性生物标志物的方法，能用于鉴定患者可能(或不可能)对使用抗SMAD7疗法产生反应(respond)。
【发明内容】
[0007]本发明部分地基于下述发现:在来自于患有炎症性肠病(IBD)(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)的患者(例如人类患者)的生物(例如血液或组织)样本中，某些T细胞群体的调节(例如CCR9+FoxP3+T细胞增加，CCR9+IFN-gamma阳性(IFN- y +) T细胞减少，CCR9+IL17A+T细胞减少，FoxP3+T细胞减少，IFN- y +T细胞减少和/或IL17A+T细胞减少)与对使用抗SMAD7疗法的治疗的敏感性相关。
[0008]应该认识到，能够事先或在开始治疗后不久预测IBD患者是否可能对使用抗SMAD7疗法的治疗具有反应性(responsive)是有益的。本文中所描述的细胞群体的调节，能预测抗SMAD7疗法对患有IBD的患者的治疗效果。有益的是，本发明的方法将最终帮助医生选择有效的疗法，并改善患者疾病状态、更好的医疗护理和患者总成本的降低。
[0009]因此，第一方面，本发明提供了一种用于确定患有炎症性肠病(IBD)的患者对使用至少一种抗SMAD7疗法的治疗的反应性的方法，所述方法包括:
[0010]在从所述患者获得的至少一个样本中，测定选自由CCR9+FOXP3+T细胞，CCR9+IFN- Y +T 细胞，CCR9+IL17A+T 细胞，FoxP3+T 细胞，IFN- y +T 细胞和 IL17A+T 细胞所组成的组的至少一种细胞群体的量，
[0011]其中在所述至少一个样本中，相对于所述至少一个细胞群体的已知对照水平，细胞群体CCR9+FOXP3+T细胞的量的增加和/或细胞群体CCR9+IFN- y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- Y +T细胞和IL17A+T细胞中至少一个细胞群体的量的减少，预测所述患有IBD的患者对所述抗SMAD7疗法的反应性。
[0012]应该认识到，“确定患者的反应性”包括:预测或监测患有IBD的患者对使用至少一种抗SMAD7疗法的治疗的有效性或反应性。
[0013]适合情况下，所述样本是生物样本。
[0014]在本发明方法的优选实施方式中，鉴定两种或更多种下列调节，以帮助确定所述患者对所述疗法的反应性:
[0015]CCR9+FoxP3+T细胞的量的增加，表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性；
[0016]CCR9+IFN- Y +T细胞的量的减少，表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性；
[0017]CCR9+IL17A+T细胞的量的减少，表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性；
[0018]FoxP3+T细胞的量的减少,表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性；
[0019]IFN- Y +T细胞的量的减少表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性；
[0020]IL17A+T细胞的量的减少表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性。
[0021]在第一优选实施方式中，所述细胞群体是CCR9+FoxP3+T细胞。在第二优选实施方式中，所述细胞群体是CCR9+IFN- Y +T细胞。在第三优选实施方式中，所述细胞群体是CCR9+IL17A+T细胞。在第四优选实施方式中，所述优选的细胞群体是FoxP3+T细胞。在第五优选实施方式中，所述细胞群体是IFN- Y +T细胞。在第六优选实施方式中，所述细胞群体是IL17A+T细胞。其他优选的细胞群体是FoxP3+⑶103+T细胞、⑶103+T细胞或整合素α4β7+Τ细胞中的任一种。
[0022]适合情况下，本发明的方法可以在体外进行。
[0023]优选地，在本发明的方法中，在量测定步骤之前，可以进行从患有IBD的患者获得所述样本的步骤。所述样本可以通过抽血或进行组织活检来获取。
[0024]适合情况下，在从所述患者获得所述至少一个样本时，所述患者可以正接受至少一种抗SMAD7疗法。
[0025]优选地，在本发明的方法中，CCR9+FoxP3+T细胞的量增加、CCR9+IFN- Y +T细胞的量减少、CCR9+IL17A+T细胞的量减少、FoxP3+T细胞的量减少、IFN- y +T细胞的量减少或IL17A+T细胞的量减少的鉴定,表明所述患者可能进入缓解。
[0026]适合情况下，所述至少一种细胞群体的量可以使用本领域技术人员已知的试剂/方法，通过流式细胞术、免疫组织化学(例如ELISA)和/或RNA/DNA分析来确定。
[0027]应该认识到，可以使用选自由抗CCR9抗体，抗FoxP3抗体，抗IFN-y抗体和抗IL17A抗体所组成的组来进行所述流式细胞术和/或免疫组织化学。
[0028]或者，细胞的量可以通过测量编码选自由CCR9、FoxP3、IFN- Y和IL17A所组成的组的至少一种标志物的RNA的量来确定。
[0029]优选地，对照是指对照水平，其为在施用至少一种抗SMAD7疗法之前从所述患者(患有IBD)获得、或在施用至少一种抗SMAD7疗法后立即获得的至少一种细胞群体的量的基线水平。“施用后立即”是指在治疗开始的第一天/当天。
[0030]在相关方面中，本文公开了一种用于监测患有IBD并正经历使用抗SMAD7疗法的治疗的患者，以确定所述患者是否对所述疗法具有反应性，和/或确定疗法是否应该继续的方法。所述方法包括:(a)在从患有IBD并正接受抗SMAD7疗法的患者获得的样本中，测定 CCR9+FoxP3+T 细胞、CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN-y+Τ细胞和IL17A+T细胞中至少一种细胞的量；以及(b)将所述样本中的量分别与CCR9+FoxP3+T 细胞、CCR9+IFN- y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- Y +T 细胞和IL17A+T细胞中至少一 种细胞的对照水平进行比较。如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量增加，或者如果与对照相比在从所述患者获得的样本中 CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞和 IL17A+T 细胞中至少一种细胞的量减少，则患者可以被鉴定为对疗法具有反应性(例如敏感)和/或可能继续对使用抗SMAD7疗法的治疗产生反应。或者，如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量减少，或者如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞和 IL17A+T 细胞中至少一种细胞的量增加，则患者可以被鉴定为对疗法不具有反应性(例如有抗性)和/或不可能继续对使用抗SMAD7疗法的治疗产生反应。
[0031]在另一方面，本文公开了一种鉴定患有IBD的、对使用抗SMAD7疗法(例如抗SMAD7反义寡核苷酸)的治疗可能具有反应性或具有反应性的患者的方法。所述方法包括:(a)测定在从患有IBD的患者获得的样本中，CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN- y +T细胞、0^9+几174+1'细胞、？(《?3+1'细胞、正^￥+1'细胞和IL17A+T细胞中至少一种细胞的量；以及(b)将所述样本中的量分别与CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN- y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- Y +T细胞和IL17A+T细胞中至少一种细胞的对照水平进行比较。如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量增加，或者如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN-Y+T细胞和IL17A+T细胞中至少一种细胞的量减少，则患者可以被鉴定为对使用抗SMAD7疗法的治疗可能产生反应或具有反应性(例如敏感)。或者，如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量减少，或者如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- y +T细胞和IL17A+T细胞中至少一种细胞的量增加，则患者可以被鉴定为对使用抗SMAD7疗法的治疗不可能产生反应或者不具有反应性(例如有抗性)。
[0032]换句话说，提供了一种用于确定患有炎症性肠病(IBD)的患者对至少一种抗SMAD7疗法的反应性的方法，所述方法包括:
[0033](a)测定在从患有IBD的患者获得的样本中，CCR9+FoxP3+T细胞的量；
[0034](b)将所述样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量与CCR9+FoxP3+细胞的对照水平进行比较，
[0035]其中CCR9+FoxP3+T细胞的量的增加，表明所述患者对所述抗SMAD7疗法可能产生反应或具有反应性；和/或
[0036](a)测定在从患有IBD的患者获得的样本中，CCR9+IFN- Y +T细胞的量；
[0037](b)将所述样本中CCR9+IFN- Y +T细胞的量与CCR9+IFN- Y +细胞的对照水平进行比较，
[0038]其中CCR9+IFN- Y +T细胞的量的减少，表明所述患者对所述抗SMAD7疗法可能产生反应或具有反应性；和/或
[0039](a)测定在从患有IBD的患者获得的样本中，CCR9+IL17A+T细胞的量；
[0040](b)将所述样本中CCR9+IL17A+T细胞的量与CCR9+IL17A+细胞的对照水平进行比较，
[0041]其中CCR9+IL17A+T细胞的量的减少，表明所述患者对所述抗SMAD7疗法可能产生反应或具有反应性；和/或
[0042](a)测定在从患有IBD的患者获得的样本中，FoxP3+T细胞的量；
[0043](b)将所述样本中FoxP3+T细胞的量与FoxP3+T细胞的对照水平进行比较，
[0044]其中FoxP3+T细胞的量的减少，表明所述患者对所述抗SMAD7疗法可能产生反应或具有反应性；和/或
[0045](a)测定在从患有IBD的患者获得的样本中，IFN- Y +T细胞的量；
[0046](b)将所述样本中IFN- Y +T细胞的量与IFN- Y +细胞的对照水平进行比较，
[0047]其中IFN-Y+T细胞的量的减少，表明所述患者对所述抗SMAD7疗法可能产生反应或具有反应性；和/或
[0048](a)测定在从患有IBD的患者获得的样本中，IL17A+T细胞的量；
[0049](b)将所述样本中IL17A+T细胞的量与IL17A+细胞的对照水平进行比较，
[0050]其中IL17A+T细胞的量的减少，表明所述患者对所述抗SMAD7疗法可能产生反应或具有反应性。
[0051 ] 在相关方面中，提供了至少一种抗体，该抗体针对CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞和 IL17A+T 细胞以及FoxP3+⑶103+T细胞、⑶103+T细胞和整合素α 4 β 7+T细胞中的至少一种的细胞标志物，并用于在人类或动物体上实施的诊断方法中。
[0052]适合情况下，所述诊断方法可用于预测或监测患有炎症性肠病(IBD)的患者对使用至少一种抗SMAD7疗法的治疗的反应性，或确定患有炎症性肠病(IBD)的患者对使用至少一种抗SMAD7疗法的治疗的适合性，以确定所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性，和/或确定所述患者是否可能进入缓解。
[0053]在相关实施方式中，提供了一种试剂盒，包含下列组分中的至少一种:用于鉴定细胞群体的抗CCR9抗体、抗FoxP3抗体、抗IFN- Y抗体和/或抗IL17A抗体，或用于检测编码 CCR9+FoxP3+T 细胞、CCR9+IFN- y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T细胞和IL17A+T细胞中至少一种细胞的蛋白质细胞标志物的RNA的表达的试剂。
[0054]适合情况下，所述试剂盒还包含使用FACS技术来鉴定、分拣和计数细胞的至少一种缓冲剂、试剂和详细说明书。
[0055]理想情况下，在本发明的试剂盒中，所述抗体是针对CCR9蛋白的第一抗体、针对FoxP3蛋白的第一抗体和与报告酶偶联的第二抗体，并且所述试剂盒至少还任选地包含使用IHC技术来鉴定细胞群体的缓冲剂、试剂和详细说明书。
[0056]适合情况下，在本发明的试剂盒中，包括针对CCR9蛋白的捕获抗体、针对FoxP3蛋白的检测抗体和/或与报告酶偶联的第二抗体；并且还任选地包含使用ELISA技术来鉴定细胞群体的缓冲剂、试剂和详细说明书。
[0057]在本文中设想了所公开的方法、用途和试剂盒，能够用于为对抗SMAD7疗法可能具有反应性或具有反应性的患者进行抗SMAD7疗法的个体化治疗。
[0058]在本文中还设想了所公开的方法、用途和试剂盒能够用于确定患者在患有IBD后是否有可能进入缓解。例如，如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量增加，和/或如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN-y+Τ细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞和 / 或 IL17A+T 细胞的量减少，则患者可 以被鉴定为可能进入缓解。
[0059]正如上面提到的，从患者获得的样本可以是血液样本，例如分离的外周血单核细胞样本。或者，从患者获得的样本可以是组织样本。例如，组织样本可以源自于患者的胃肠道(例如来自于患者的小肠)。
[0060]对照或对照水平样本可以包括在使用抗SMAD7疗法的治疗之前从所述患者获得的样本(例如血液或组织样本)。对照样本提供了在治疗之前本发明的至少一种细胞群体的量的基线水平，其可用于监测所述患者对治疗的反应。对照或对照水平样本可以在首次施用抗SMAD7疗法的当天(例如治疗方案的第I天)从所述患者获得。在其他实施方式中，对照或对照水平样本可以在抗SMAD7疗法开始至少一天之前(例如治疗方案的第O天)从患者获得。
[0061]在某些实施方式中，通过流式细胞术来测定样本中CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞和 IL17A+T 细胞中至少一种细胞的量。在其他实施方式中，通过免疫组织化学或ELISA测定法来进行测定。FACS、免疫组织化学和ELISA测定法可以使用选自由抗CCR9抗体、抗FoxP3抗体、抗IFN- Y抗体和抗IL17A抗体所组成的组的至少一种抗体来进行。在另一种实施方式中，通过测量编码选自由CCR9、FoxP3、IFN- Y和IL17A所组成的组的至少一种标志物的RNA的量来测定细胞群体的量。在某些实施方式中，抗SMAD7疗法是抗SMAD7反义寡核苷酸。所述抗SMAD7反义寡核苷酸疗法可以是选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、EQID NO:8和SEQ ID NO:9所组成的组的抗SMAD7反义寡核苷酸。在示例性实施方式中，SMAD7反义寡核苷酸包含SEQ ID NO:6。[0062]通过参考下面的图、详细描述和权利要求书，可以更充分地理解本发明的上述方面和实施方式。
【专利附图】
【附图说明】
[0063]图1 (A)提供了 SMAD7的核酸序列(SEQ ID NO:1)，⑶提供了 SMAD7的氨基酸序列(SEQ ID NO:2) ο
[0064]图2是示出了应征者的筛选结果和参加的患者的组群划分的流程图。
[0065]图3显示了与参加试验的患者相关的人口统计学和临床特征。
[0066]图4示出了不良反应事件的不同类型、不良反应事件在试验期间的频率及与GED0301的关联。
[0067]图5(A和B)是免疫组织化学分析的照片，其示出SMAD7在患有克罗恩病的患者的人类肠腺滤泡和派尔集合淋巴结中表达。在B中，箭头示出了 SMAD7在细胞核和细胞质中的表达。图A，放大倍数100倍；图B，放大倍数200倍。
[0068]图6示出了从⑶患者分离的、保持未刺激的(Unst)或用Smad7正义(Sense)或GED0301 (AS)寡核苷酸处理过的PBMC，以百分数计对(A)CCR9+或(B) β 7+群体中IFN- Y或IL-17A细胞的影响。
[0069]图7显示了在基线和临床试验的第8天和第28天时，对各种标志物检测为阳性的T细胞的比例。
[0070]图8 显示了示出在第 0、8、28 和 84 天后，(A) IFN- Y +、(B) IFN- y +CCR9+、(C)IL-17A+、(D) CCR9+IL-17A+, (E)FoxP3+和(F)FoxP3+CCR9+T 细胞的百分率的图。
[0071]图9示出了在基线、临床试验的第8天和第28天时每个组群的平均CDAI值，以及在每个时间点处整个患者组的平均CDAI值。
【具体实施方式】
[0072]公开了用于监测患者对使用抗SMAD7疗法的治疗是否具有反应性(例如敏感或有抗性)的方法。所述方法部分地基于下述发现:在来自于患有IBD例如克罗恩病或溃疡性结肠炎的患者的血液样本中，某些T细胞群体的调节(例如CCR9+FoxP3+T细胞增加，CCR9+IFN-gamma 阳性(IFN- y +) T 细胞减少，CCR9+IL17A+T 细胞减少，FoxP3+T 细胞减少，IFN- Y +T细胞减少和/或IL17A+T细胞减少)与对使用抗SMAD7疗法的治疗的敏感性相关。
[0073]正如在本文中所述，对患有IBD并正接受或已接受使用抗SMAD7疗法的治疗的患者的一种或多种T细胞群体进行监测，以确定患者是否对所述疗法具有反应性和/或确定疗法是否应该继续。在一方面，方法包括:(a)测定在从患有IBD并正接受抗SMAD7疗法的患者获得的样本中，CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN-Y+T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- Y +T细胞和/或IL17A+T细胞的量；以及(b)将所述样本中的量分别与 CCR9+FoxP3+T 细胞、CCR9+IFN- y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T细胞和/或IL17A+T细胞的对照水平进行比较。如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量增加，或者如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞和 / 或 IL17A+T 细胞的量减少，则患者可以被鉴定为对疗法具有反应性(例如敏感)和/或可能继续对使用抗SMAD7疗法的治疗产生反应。
[0074]或者，如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量减少，或者如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN-y+Τ细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- Y +T细胞和/或IL17A+T细胞的量增加，则患者可以被鉴定为对治疗不具有反应性(例如有抗性)和/或不可能继续对使用抗SMAD7疗法的治疗产生反应。
[0075]在另一方面，对患有IBD的患者的一种或多种T细胞群体进行监测，以鉴定患者是否可能对使用抗SMAD7疗法的治疗产生反应。方法包括:(a)测定在从患有IBD的患者获得的样本中，CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN-Y+T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- Y +T细胞和/或IL17A+T细胞的量；以及(b)将所述样本中的量分别与 CCR9+FoxP3+T 细胞、CCR9+IFN- y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T细胞和/或IL17A+T细胞的对照水平进行比较。如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量增加，和/或者如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- Y +T 细胞和/或IL17A+T细胞的量减少，则患者可以被鉴定为对使用抗SMAD7疗法的治疗可能产生反应或具有反应性(例如敏感)。
[0076]或者，如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量减少，和/或如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- Y +T细胞和/或IL17A+T细胞的量增加，则患者可以被鉴定为对使用抗SMAD7疗法的治疗不可能产生反应或者不具有反应性(例如有抗性)。
[0077]在某些实施方式中，还可以测量FoxP3+⑶103+T细胞、⑶103+T细胞和/或整合素α 4β 7+T细胞的量。对疗法具有反应性的患者显示出，这些细胞群体的量在疗法期间与治疗前水平相比一致。
[0078]在其他实施方式中，所公开的方法可用于确定患者是否可能在患有IBD后进入缓解。例如，如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量增加，和/或如果与对照相比在从所述患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN-Y+T细胞和/或IL17A+T细胞的量减少，则患者可以被鉴定为可能进入缓解。
[0079]为方便起见，将在说明书、实施例和随附的权利要求书中的某些术语收集在本部分中。
[0080]当在本文中使用时，“CCR9”(趋化因子(C-C基序)受体9，也称为CDwl99、GPR-9-6、GPR28、C-C CKR_9、G 蛋白偶联受体 28)是指由 Entrez GeneID N0.10803 所指定的
基因及其等位基因突变体编码的人类蛋白。
[0081]当在本文中使用时，“FoxP3” (叉头框P3，也称为JM2、AIID、DIETER、IPEX、MGC141961、MGC141963、PIDX、XPID)是指由 Entrez GeneID N0.50943 所指定的基因及其等位基因突变体编码的人类蛋白。
[0082]当在本文中使用时，“IFN-gamma”或“IFN-Y ”(干扰素Y，也称为IFNG、IFG、IFI)是指由Entrez GeneID N0.3458所指定的基因及其等位基因突变体编码的人类蛋白。
[0083]当在本文中使用时，“IL17A” (白介素17A，也称为CTLA8、IL-17、IL-17A、IL17、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原8、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白8、细胞毒性T淋巴细胞相关丝氨酸酯酶8)是指由Entrez GeneID N0.3605所指定的基因及其等位基因突变体编码的人类蛋白。
[0084]当在本文中使用时，“⑶103”(⑶103抗原，也称为整合素ae、粘膜淋巴细胞抗原I a肽、HUMINAE整合素a -1EL ;整合素a -E、HML-1抗原和MGC141996)是指由EntrezGeneID N0.3682所指定的基因及其等位基因突变体编码的人类蛋白。
[0085]当在本文中使用时，“α 4β 7”(整合素a 4 β 7，也称为肠归巢受体β亚基和ITGB7)是指由Entrez GeneID N0.3695所指定的基因及其等位基因突变体编码的人类蛋白。
[0086]当在本文中使用时，“SMAD7”(也称为CRCS3、FLJ16482、MADH7、MADH8、MAD (果蝇细胞信号转导分子(mothers against decapentaplegic))同源物7、MAD同源物8、SMAD、细胞信号转导分子(mothers against DPP homolog) 7、细胞信号转导分子(mothers againstDPP homolog)8)是指由Entrez GeneID N0.4092所指定的基因及其等位基因突变体编码的人类蛋白。
[0087]当在本文中使用时，“克罗恩病活动指数”或“CDAI”是指由Best等在胃肠病学(GASTROENTEROLOGY), 70:439-44 (1976)所描述的、用于评估患有CD的患者的进展的测量值或指数。150或更低的CDAI分值一般与不活动的疾病相关，并且与更高的分值相比指示更好的预后。高于150的分值一般与活动的疾病相关，并且高于450的分值与极为严重的疾病相关。CDAI分值可用于确定患者对疗法的反应情况，并可用于鉴定处于缓解中的患者。在某些实施方式中，基准临床反应是指患者显示出CDAI分值至少降低100点。在临床试验中，150或更低的CDAI分值一般与缓解相关。
[0088]当在本文中使用时，“溃疡性结肠炎疾病活动指数”或“UCDAI”是指由Sutherland等，胃肠病学(Gastroenterology)，92:1894-98 (1987)所描述的、用于评估患有UC的患者的进展的测量值或指数。UCDAI是关于UC症状包括排粪频率、直肠出血、结肠内衬外观和医生对疾病活动的评定的一系列指标。这些指标的每一个被给出从O至3的数字，其中3表示最高疾病活动。在临床试验中，缓解通常被定义为I或更低的UCDAI分值，并且改善为比试验开始时的分值降低了 3点或更多。UCDAI可以在临床试验中用于确定患者对疗法产生反应的程度，并且可用于鉴定处于缓解中的患者。其他常用的、用于度量UC患者疾病严重性的指数包括:Truelove and Witts指数、St.Mark’s指数、简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)、Lichtiger指数、溃疡性结肠炎症状分值(UCSS)和Mayo临床分值。
[0089]当在本文中使用时，对治疗“反应”或“产生反应”意味着患有克罗恩病的患者表现出:(a) CDAI分值的降低，例如CDAI分值降低20点、30点、40点、50点、60点、70点、80点、90点、100点或更多点；(b)低于150的CDAI分值；和/或(c)诱导病情缓解。对于患有UC的患者来说，对治疗“反应”或者“产生反应”意味着患者表现出:(a)UCDAI分值的降低，例如UCDAI分值降低I点、2点或更多点；(b) I或更低的UCDAI分值；和/或(c)诱导病情缓解。
[0090]抗SMAD7 疗法
[0091]抗SMAD7疗法包括针对SMAD7的靶向疗法(例如抗SMAD7反义疗法和针对SMAD7的抗体)。反义寡核苷酸是与编码靶蛋白(例如SMAD7)的信使RNA(mRNA)互补的、短的合成寡核苷酸序列。反义寡核苷酸序列与mRNA杂交产生双链杂交体，其能够引起遍在(ubiquitary)催化性酶例如降解DNA/RNA杂交体链的RNase H的活化,从而防止蛋白翻译。
[0092]在某些实施方式中，抗SMAD7反义寡核苷酸可以靶向人类SMAD7mRNA(例如SEQ IDNO:1)的位点 403、233、294、295、296、298、299 和 / 或 533 (即分别为核苷酸 403、233、294、295、296、298、299 和 533)。
[0093]在某些实施方式中，反义寡核苷酸可以源自于下列抗SMAD7反义寡核苷酸5’ -GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3’ (SEQ ID NO:3)。
[0094]在本文中设想了靶向SMAD7的反义寡核苷酸可以包含混合骨架，其中CpG对中的胞嘧啶残基被5’ -甲基胞嘧啶(缩写为Me-dC)取代。也可以将甲基膦酸酯键(缩写为MeP)置于反义寡核苷酸的5’和/或3’末端处。
[0095]IE向SMAD7的不例性反义寡核苷酸疗法包括但不限于5’ -GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3’ (SEQ ID NO:4)，其中X是包含选自由胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶或2’ -O-甲基胞嘧啶核苷所组成的组的含氮碱基的核苷酸，并且其中Y是包含选自由鸟嘌呤和5-甲基鸟嘌呤或2’-0_甲基鸟嘌呤核苷所组成的组的含氮碱基的核苷酸，只要核苷酸X或Y中的至少一个包含甲基化的含氮碱基即可；
[0096]5，-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3，(SEQ ID NO:5)，其中 X 是 5-甲基-2，-脱氧胞
苷-5’ -单磷酸；
[0097]5，-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3，(SEQ ID NO:6)，其中 X 是 5-甲基-2’ -脱氧胞
苷-5’ -单磷酸；
[0098]5，-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3，(SEQ ID NO:7)，其中 X 是 5-甲基-2，-脱氧胞
苷-5’ -单磷酸，并且Z是2’ -脱氧鸟苷甲基膦酸酯；
[0099]5，-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3，(SEQ ID NO:8)，其中 X 是 5-甲基-2，-脱氧胞
苷-5’ -单磷酸，并且Z是2’ -脱氧鸟苷甲基膦酸酯；
[0100]5，-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3，(SEQ ID NO:9)，其中 X 是 5-甲基-2’ -脱氧胞苷-5’ -单磷酸。(参见例如美国专利Nos.7，807，818和6，159，697，其各自通过引用并入本文。)
[0101]在示例性实施方式中，抗SMAD7反义疗法可以被配制在可药用载体中，并口服给药于患有IBD的患者。
[0102]血液样本
[0103]来自于患者的血液样本可以使用本领域公知的技术来获得。血液样本可以包括外周血单核细胞(PMBCs)或去除RBC的全血。PBMC可以使用不同的密度梯度(例如聚蔗糖密度梯度)离心程序从全血样本中分离。例如，将全血(例如抗凝剂处理的全血)在分离介质中分层并离心。在离心步骤结束时，从顶部至底部目测观察到下列层:血浆/血小板、PBMC、分离介质和红细胞/粒细胞。可以收集PBMC层并对其进行洗涤以除去污染物。
[0104]组织样本
[0105]能够将来自于患者的组织样本(例如，从患者例如患有CD或UC的患者的小肠和/或大肠获得的组织样本)用作细胞来源、RNA来源、蛋白质来源或用于免疫组织化学(IHC)薄切片的来源，以用于测量样本中的CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN- y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- y +T细胞和/或IL17A+T细胞的量时。组织样本可以使用常规的活检仪器和程序来获得。内窥镜活检、切除活检和切取活检是可以由本领域技术人员用来获得胃肠组织样本的公认医学程序的实例。组织样本应该大得足以提供足够的细胞、RNA、蛋白质或薄切片，以用于通过流式细胞术、IHC或ELISA测量标志物基因(例如CCR9、FoxP3、IFN- Y和/或IL17A)表达水平，或可视化单个细胞，例如CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN-Y+Τ 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN-Y+T 细胞和 / 或 IL17A+T细胞的表达。
[0106]组织样本能够为足以用于细胞分拣、RNA提取、蛋白质提取或制备薄切片的任何形式。因此，组织样本能够是新鲜的、通过适合的低温技术保存的，或通过非低温技术保存的。用于处理临床活检样本的标准方法是将组织样本固定在福尔马林中，然后将其包埋在石蜡中。这种形式的样本通常被称为福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织。适用于后续分析的组织制备技术，对于本领域技术人员来说是公知的。
[0107]流式细胞术
[0108]细胞群体可以根据细胞表面标志物，通过流式细胞术进行分拣(例如荧光激活细胞分拣(FACS)分析)。通过FACS来分拣和计数细胞的方法是已被确立的，并且为本领域技术人员所知。参见例如Robinson “细胞计数法实验指南”(Current Protocols inCytometry), John Wiley &Sons Inc., New York。一般来说,可以将从血液样本或组织样本获得的细胞制备成单细胞悬液。然后将细胞用荧光标签(例如，针对待细胞群体上存在的细胞表面标志物的荧光标记的抗体)标记。荧光可以是直接或间接的。对于直接荧光来说，将荧光标签(例如荧光素、罗丹明或另一种荧光染料)共价连接于第一抗体上。对于间接突光来说，结合细胞表面上存在的标志物的第一抗体不用突光标签标记。第一抗体结合于目标细胞群体的细胞表面。通过洗涤步骤移除未结合的抗体。加入结合第一抗体的、带有荧光标签的第二抗体，并通过洗涤步骤除去任何未结合的抗体。
[0109]FACS分析能够使用活的或固定的细胞来进行。对于本领域技术人员来说，FACS仪器是可以获得的，并包括 FACScan、FACStar Plus 和 FACSCalibur (Becton-Dickinson)。对于本领域技术人员来说，FACS分析软件是可以获得的，并包括Flowjo、CellQuestPro (Becton-Dickinson)和WinMDI (用于流式细胞术的Windows多文档界面)。
[0110]本领域技术人员将会认识到，FACS分析能够使用单一抗体或多种抗体来进行，用于鉴定、计数和分拣不同细胞群体。例如，能够检测用单一抗体标记的细胞群体，并将其从不表达特定标志物的细胞中分拣出来(例如，FoxP3+T细胞群体能够通过针对FoxP3的特异性抗体来鉴定；IFN- Y +T细胞群体能够通过针对IFN- Y的特异性抗体来鉴定；并且IL17A+T细胞群体能够通过针对IL17A的特异性抗体来鉴定)。
[0111]装备有多个激光器和荧光检测器的FACS仪器允许使用多抗体标记，并且可以精确地鉴定目标细胞群体。为了实现检测，细胞能够用多种抗体标记，每种抗体标记有不同的荧光标签。例如,可以用APC标记的小鼠抗人类CCR9抗体和PE标记的抗人类FoxP3抗体同时标记血液样本，用于检测CCR9+FoxP3+T细胞群体。在另一种实施方式中，可以用APC标记的小鼠抗人类CCR9抗体和Alexa Fluor647小鼠抗人类IL17A抗体标记组织样本,用于检测CCR9+IL17A+T细胞群体。
[0112]可用于通过FACS分析来测定CCR9+FOXP3+T细胞群体、CCR9+IFN- y +T细胞群体和/或CCR9+IL17A+T细胞群体的示例性抗体包括:荧光标记的针对人类CCR9的抗体，例如别藻蓝蛋白(APC)标记的小鼠抗人类CCR9抗体(R&D Systems,目录号FAB179A和FAB1791A)、Alexa Fluor? 647小鼠抗人类CCR9抗体(BD Pharmigen,目录号557975)、荧光素标记的小鼠抗人类CCR9抗体(R&D Systems,目录号FAB179F)和藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人类CCR9 抗体(R&DSystems，目录号 FAB179P)。
[0113]可用于通过FACS分析来测定FoxP3+T细胞群体和CCR9+FoxP3+T细胞群体的示例性抗体包括:突光标记的针对人类FoxP3的抗体,例如藻红蛋白(PE)标记的抗人类FoxP3抗体(Miltenyi B1tec,目录号130-093-014)、别藻蓝蛋白(APC)标记的抗人类FoxP3抗体(Miltenyi B1tec,目录号 130-093-013)、Alexa Fluor? 647 小鼠抗人类 FoxP3 抗体(BDPharmigen,目录号 560045)、Alexa Fluor? 488 小鼠抗人类 FoxP3 抗体(AbD Serotec,目录号MCA2376A488)和FITC标记的小鼠抗人类FoxP3抗体(Abcam，目录号ab93512)。
[0114]可用于通过FACS分析来测定IFN- Y +T细胞群体和CCR9+IFN- Y +T细胞群体的示例性抗体包括:荧光标记的针对人类IFN- Y的抗体，例如FITC标记的小鼠抗人类IFN- Y抗体(Abeam,目录号ab47344)、藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人类IFN-Y抗体(Abeam,目录号ab47345，和R&D Systems,目录号IC285P)和荧光素标记的小鼠抗人类IFN- Y抗体(R&DSystems,目录号 IC285F)。
[0115]可用于通过FACS分析来测定IL17A+T细胞群体和CCR9+IL17A+T细胞群体的示例性抗体包括:荧光标记的针对人类IL17A的抗体，例如Alexa Fluor647小鼠抗人类IL17A抗体(eB1science,目录号51_7179_42)、藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人类IL17A抗体(R&D Systems,目录号IC3171P)和别藻蓝蛋白(APC)标记的小鼠抗人类IL17A抗体(R&DSystems,目录号 IC3171A)。
[0116]可用于通过FACS分析来测定CD103+T细胞群体和FoxP3+CD103+T细胞群体的示例性抗体:包括荧光标记的针对人类CD103的抗体，例如藻红蛋白标记的小鼠抗人类整合素a E单克隆抗体(Abcam，目录号ab33267)和FITC标记的小鼠抗人类⑶103单克隆抗体(AbD Serotec,目录号 MCA1416FT)。
[0117]可用于通过FACS分析来测定α 4 β 7+T细胞群体的示例性抗体包括:荧光标记的针对人类α4β 7的抗体，其可以从BD B1sciences获得。
[0118]在另一种实施方式中，通过用流式细胞术分拣细胞，然后测量从分拣的细胞群体中编码选自由CCR9、FoxP3、IFN- Y和IL17A所组成的组的至少一种标志物的RNA的量，来测定细胞群体的量。RNA分离和定量的方法在本领域中是公知的。
[0119]免疫组织化学
[0120]不同的细胞群体也可以通过免疫组织化学(IHC)来测定。具体来说，能够通过IHC来测定(例如可视化)给定细胞群体中CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN-Y+T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- y +T细胞和/或IL17A+T细胞的数量。例如，通过IHC测定CCR9+FoxP3+T细胞群体，需要:例如，至少一种针对CCR9蛋白的抗体，例如至少一种抗CCR9抗体；以及至少一种针对FoxP3的抗体，例如至少一种抗FoxP3抗体。在示例性实施方式中，将抗CCR9抗体和抗FoxP3+抗体用不同标记物例如不同的荧光标记物进行标记。在某些实施方式中，抗CCR9抗体和抗FoxP3抗体是不同的抗体，例如小鼠、大鼠、兔等的抗体，因此通过用例如荧光标记的第二抗体提供差异检测。[0121]对于IHC研究来说，例如能够将石蜡包埋、福尔马林固定的组织样本切成片，例如5微米的切片。通常，首先对组织切片进行这样的处理，以便恢复在收集和保存组织材料的最初过程中被固定的蛋白质的抗原结构。然后封闭载片以防止检测抗体的非特异性结合。然后，通过抗CCR9、抗FoxP3、抗IFN-gamma和/或抗IL17A抗体与相应蛋白的结合，检测例如CCR9.FoxP3.1FN- Y和/或IL17A蛋白的存在。将检测(第一)抗体直接或间接地连接到荧光标记物，例如通过特异性识别检测(第一)抗体的第二抗体或聚合物。通常在步骤之间，对组织切片进行洗涤并用非特异性蛋白例如牛血清白蛋白进行封闭。可以将样本用苏木精和/或曙红进行复染。
[0122]适用于IHC的抗CCR9抗体能够商购,例如来自于Enzo Life Sciences的山羊抗人类CCR9多克隆抗体(目录号ALX-210-847-C200)、来自于GenWay B1tech的兔抗人类CCR9多克隆抗体(目录号18-461-10269-0.05ml)、来自于Novus B1logicals的CCR9抗体(目录号NBP1-44201)和来自于R&D Systems的小鼠抗人类CCR9单克隆抗体(目录号MAB179)。
[0123]适用于IHC的抗FoxP3抗体能够商购,例如来自于Abb1tec的兔抗FoxP3多克隆抗体(目录号250655)、来自于Abgent的山羊抗 人类FoxP3多克隆抗体(目录号AF1438a)、来自于LifeSpan B1sciences的小鼠抗人类FoxP3单克隆抗体(目录号LS-C51576-40)和来自于MBL Internat1nal的小鼠抗人类FoxP3单克隆抗体(目录号M120-3)。
[0124]适用于IHC的抗IFN-Y抗体能够商购,例如来自于Abb1tec的兔抗IFN-Y多克隆抗体(目录号250707)、来自于B1Legend的小鼠抗人类IFN-Y单克隆抗体(目录号506512)、来自于R&D Systems的山羊抗人类IFN-Y单克隆抗体(目录号AF-285-NA)和来自于Cell Sciences的兔抗人类IFN-Y多克隆抗体(目录号CP2008)。
[0125]适用于IHC的抗IL17A抗体能够商购,例如来自于Proteintech Group的兔抗人类IL17A多克隆抗体(目录号13082-1-AP)和来自于R&D Systems的山羊抗人类IL17多克隆抗体(目录号AF-317-NA)。
[0126]适用于IHC的抗⑶103抗体能够商购，例如来自于Abcam的小鼠抗人类整合素-a E单克隆抗体(目录号ab33266)和来自于AbD Serotec的小鼠抗人类⑶103单克隆抗体(目录号P38570)。
[0127]抗整合素α 4 β 7抗体可以从BD B1sciences商购。
[0128]基于细胞的酶联免疫吸附测定法
[0129]在某些实施方式中，细胞群体可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来鉴定。具体来说，可以通过例如基于细胞的ELISA，来测定给定细胞群体中的CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞和 / 或 IL17A+T 细胞。例如，通过ELISA测定CCR9+FoxP3+细胞群体需要:至少一种针对CCR9蛋白的抗体，例如至少一种抗CCR9抗体；至少一种针对FoxP3蛋白的抗体，例如至少一种抗FoxP3抗体；和/或至少一种第二抗体，例如至少一种标记了的第二抗体。在示例性实施方式中，抗CCR9抗体和抗FoxP3抗体都是未标记的，或者用不同标记物例如不同荧光标记物进行标记。在某些实施方式中，抗CCR9抗体和抗FoxP3抗体是不同的抗体，例如小鼠、大鼠、兔等的抗体，因此通过标记例如荧光或酶联的第二抗体提供差异检测。
[0130]进行ELISA、例如基于细胞的ELISA，需要至少一种捕获抗体、至少一种检测抗体和/或至少一种酶联或荧光标记的第二抗体。例如，通过基于细胞的ELISA测定CCR9+FoxP3+细胞群体，可能需要抗CCR9多克隆抗体作为捕获抗体。将抗CCR9多克隆抗体固定化在固相载体例如聚苯乙烯微量滴定板上。然后加入从血液样本或组织样本获得的细胞，并使其与结合的抗体复合。用洗涤除去未结合的细胞。加入检测抗体，例如抗FoxP3单克隆抗体，并使其结合到细胞。将检测抗体直接或间接地与酶连接，例如通过特异性识别检测抗体的第二抗体。通常在每个步骤之间用清洗缓冲液例如温和的去污剂溶液，对结合有细胞的板进行洗涤。典型的ELISA操作还包括一个或多个封闭步骤，其包括使用非特异性结合的蛋白例如牛血清白蛋白来封闭蛋白质试剂与板间多余的非特异性结合。在最后的清洗步骤后，通过加入适合的酶底物进行显色，以产生可见的信号，其表明样本中CCR9+FoxP3+细胞的量。底物可以是例如显色底物或荧光底物。
[0131]ELISA方法、试剂和设备在本领域中是公知的，并且能够商购。
[0132]大量适用于ELISA的抗CCR9抗体能够商购，例如来自于Abcam的抗CCR9多克隆抗体(目录号ab38567)、来自于Enzo Life Sciences的山羊抗人类CCR9多克隆抗体(目录号ALX-210-847-C200)和来自于Novus B1logicals的兔抗人类CCR9多克隆抗体(目录号 H00010803-D01P)。
[0133]大量适用于ELISA的抗FoxP3抗体能够商购,例如来自于Abb1tec的兔抗FoxP3多克隆抗体(目录号250655)、来自于Abgent的山羊抗人类FoxP3多克隆抗体(目录号AF1438a)和来自于LifeSpan B1sciences的小鼠抗人类FoxP3单克隆抗体(目录号LS-C82119-100)。
[0134]大量适用于ELISA的抗IFN-Y抗体能够商购，例如来自于Abb1tec的兔抗IFN-y多克隆抗体(目录号250707)、来自于B1Legend的小鼠抗人类IFN-Y单克隆抗体(目录号507502)和来 自于Cell Sciences的兔抗人类IFN-Y多克隆抗体(目录号CP2008)。
[0135]适用于ELISA的抗IL17A抗体能够商购,例如来自于Proteintech Group的兔抗人类IL17A多克隆抗体(目录号13082-1-AP)和来自于R&D Systems的山羊抗人类IL17单克隆抗体(目录号MAB317)。
[0136]适用于ELISA的抗⑶103抗体能够商购,例如来自于Novus B1logicals的兔抗人类整合素a E抗体(目录号36520002)。
[0137]抗整合素α 4 β 7抗体能够从BD B1sciences商购。
[0138]在另一种实施方式中，通过用流式细胞术分拣细胞，然后测量从分拣的细胞群体中编码选自由CCR9、FoxP3、IFN- Y和IL17A所组成的组的至少一种标志物的RNA的量，来测定细胞群体的量。RNA分离和定量的方法在本领域中是公知的。
[0139]对照样本
[0140]对照样本可以包括在使用抗SMAD7疗法的治疗之前从患者获得的样本(例如血液或组织样本)。对照样本为监测患者针对治疗的进展提供基线。对照样本可以在抗SMAD7疗法首次给药的当天(例如治疗方案的第I天)从患者获得。在其他实施方式中，对照样本可以在开始抗SMAD7疗法之前一天(例如治疗方案的第O天)从患者获得。或者，对照样本可以在抗SMAD7疗法开始前2、3、4、5、6、7天或更多天从患者获得。例如，可以在治疗之前(例如对照样本)、治疗期间和/或治疗之后测量某些细胞样本的上调或下调，以监测患者对疗法例如抗SMAD7疗法的反应。[0141]在某些实施方式中，可以根据患者中某些细胞群体的长期监测为患者建立对照水平。在这样的情况下，设想了患者可以经历使用抗SMAD7疗法的多轮治疗。可以将在多轮治疗后检测到的某些细胞群体的量与所述患者之前的对照水平进行比较，以确定患者是否对疗法产生反应和/或可能对使用抗SMAD7疗法的进一步治疗产生反应。在其他实施方式中，可以根据从在一段时间内获得的(例如在数周、数月或数年时间段内获得的)多个基线样本测定的某些细胞群体的平均测量值，为某些细胞群体建立对照或基线水平。因此，可以将如本文所公开进行的任何检测或测定与以前或已建立的对照水平进行比较，并且可以不必从患者获取新的对照样本用于比较，例如如果患者正接受超过一轮使用抗SMAD7疗法的治疗的话。
[0142]数据解释
[0143]患者对使用抗SMAD7疗法的治疗的反应性，可以就在治疗之前从患者获得的对照样本来进行解释。如果与对照样本相比，在从患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量增力口，或者在从患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- Y +T细胞和/或IL17A+T细胞的量减少，则患者可以被鉴定为对使用抗SMAD7疗法的治疗敏感(例如有反应性或可能产生反应)。为了确定对治疗的敏感性，可以在疗法开始后第8天或更晚时间获取样本。在某些实施方式中，可以在第28、56和/或84天和/或更长时间获取样本。在其他实施方式中，可以在疗法开始后第8天之后，例如一周、两周、一个月、两个月、三个月、六个月和/或一年或更长时间获取样本，以监测对治疗的敏感性。
[0144]或者，如果与对照样本相比，在从患者获得的样本中CCR9+FoxP3+T细胞的量减少，或在从患者获得的样本中CCR9+IFN- Y +T细胞和/或CCR9+IL17A+T细胞的量增加，则可以将患者鉴定为对使用抗SMAD7疗法的治疗有抗性(例如无反应性或不可能产生反应)。为了确定对治疗的抗性，可以在疗法开始后第8天或更晚时间获取样本。在某些实施方式中，可以在开始治疗的28、56、84和/或更多天之后获取样本。在其他实施方式中，可以在疗法开始后第8天之后，例如一周、两周、一个月、两个月、三个月、六个月和/或一年或更长时间获取样本，以监测对治疗的敏感性。
[0145]检测试剂盒
[0146]本发明包括检测试剂盒，其包含用于进行本文公开的方法的某些组分。检测试剂盒可以在所公开的测定法的进行中提高方便性、速度和可重复性。例如，示例性的基于FACS的检测试剂盒可以包括:用于鉴定、分拣和计数细胞的抗体，例如抗CCR9抗体、抗FoxP3抗体、抗IFN-Y抗体和/或抗IL17A抗体。在其他实施方式中，检测试剂盒不仅含有抗体，而且含有使用FACS技术来鉴定、分拣和计数细胞的缓冲液、试剂和详细说明书。在某些实施方式中，试剂盒包括:检测实验指南，以及除了细胞和/或组织样本之外的所述检测所需的所有可消耗组分。
[0147]示例性的基于IHC的检测试剂盒可以含有用于通过IHC测定细胞群体的材料。例如，IHC试剂盒可以含有:针对CCR9蛋白的第一抗体，例如小鼠抗人类CCR9抗体；针对FoxP3蛋白的第一抗体，例如小鼠抗人类FoxP3抗体；以及与报告酶例如辣根过氧化物酶偶联的第二抗体。在其他实施方式中，检测试剂盒不仅含有抗体，而且含有使用IHC技术来鉴定细胞群体的缓冲液、试剂和详细说明书。
[0148]示例性的基于ELISA的检测试剂盒可以含有用于通过ELISA测定细胞群体的材料。例如，基于细胞的ELISA试剂盒可以含有:针对CCR9蛋白的捕获抗体，例如兔抗人类CCR9多克隆抗体；针对FoxP3蛋白的检测抗体，例如小鼠抗人类FoxP3单克隆抗体；和/或与报告酶例如辣根过氧化物酶偶联的第二抗体。在其他实施方式中，检测试剂盒不仅含有抗体，而且含有使用ELISA技术来鉴定细胞群体的缓冲液、试剂和详细说明书。
[0149]实施例
[0150]通过下面的实施例对本发明进行进一步说明。提供实施例仅仅是出于说明的目的，而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
[0151]实施例1:在⑶患者中评估抗SMAD7反义治疗的安全性和效能的I期临床试验
[0152]在I期临床试验中，征集了 15位患有活动⑶的患者，以评估抗SMAD7反义疗法用于治疗⑶的安全性和效能。首先从一组21位应征者中筛选患者，并将入选者指定到三个同等大小的组群之一(图2)。征集的患者在人口统计学或临床特征方面没有显著差异。然而，与其他两个组群相比，组群I的患者具有更长的患病期；并且，与组群3的患者相比，组群I和2的患者经历的肠切除术更频繁(图3)。患者接受40mg/天(N = 5 ;组群I)、80mg/ 天(N = 5 ;组群 2)或 160mg/ 天(N = 5 ;组群 3)的 GED-0301 共 7 天，GED-0301 为一种Smad7反义寡核苷酸(GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC，其中X是5-甲基-2’-脱氧胞苷5’-单磷酸(5-Me-dC) (SEQ ID NO:6))。
[0153]满足所 有下列判定标准的患者为入选合格:1.)在任何与研究相关的程序之前，由患者亲自签署姓名和日期的书面知情同意书；2.)18-45岁之间的男性或女性患者；3.)没有生育能力的女性患者；具有生育能力的女性患者，但在筛选时的妊娠测试为阴性，并且在研究期间使用有效的避孕方法；4.)在筛选访视时患有活动CD的患者，所述活动CD被定义为:在征集前至少一周内CDAI分值>220并< 400 ；5.)CD局限于末端回肠和/或右侧结肠；6.)在征集前90天内，没有使用抗TNF-α、其他生物制剂、免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤、巯基嘌呤、甲氨喋呤)治疗)患者具有类固醇抗性或类固醇依赖性；以及8.)能够理解并遵守研究的规程和限制。
[0154]如果满足下列任一判定标准，则患者被排除在研究之外:1.)妊娠或哺乳期女性；
2.)患有涉及胃和/或近端小肠的CD的患者，或者具有局限于横结肠和/或左侧结肠的损伤的患者；3.)在之前90天内，使用了第一剂免疫调节剂和生物制剂(例如硫唑嘌呤、巯基嘌呤、甲氨喋呤、英夫利昔单抗、阿达木单抗、那他珠单抗)；4.)存在局部并发症(例如脓肿、狭窄和瘘管)、发育异常和恶性肿瘤以及肠外表现；5.)以前因CD狭窄进行过内窥镜球囊扩张、狭窄成形术或手术切除；6.)经历过直肠结肠切除术的患者；7.)任何下述实验室变化:APTT>正常值上限(ULN)的1.5倍；血小板计数≤100, 000/mm3 ;血清肌酐〉ULN的1.5倍；总胆红素>ULN的1.5倍(不包括Gilbert综合征)；AST和ALT>ULN的1.5倍；QTc间隔对于男性来说>450msec，对于女性来说>470msec ；8.)有下述病症的当前或以前的相关病史:严重、重症或不稳定的(急性或渐进性)身体或精神疾病，包括感染、恶性肿瘤、可能需要治疗的疾病(例如肾或肝损伤)或使患者不能完全完成研究的疾病，或存在来自于研究药物或程序的过度风险的任何情况；9.)吸烟或以其他方式消费烟草制品的患者；10.)在过去一年中有酒精或其他物质滥用的历史；11.)潜在地表现出可靠性不高(例如智力状况不良)的患者；12.)已知对寡核苷酸或研究产品中的任何成分过敏；13.)在随机分组之前最近的12个月内，使用了另一种试验药或参加了临床试验的患者。[0155]通过将下列因素考虑在内，每日评估GED-0301的安全性:身体检查，体重(Kg)，生命体征(收缩压和舒张压、心率、呼吸率、体温)，ECG(12导程)，AE和SAE的收集。检查血液样本的下列指标:血红蛋白，红细胞压积，平均细胞体积，红细胞计数，总体和差异白细胞计数，MCH,血小板计数,凝血酶原时间，活化部分促凝血酶原时间,肌酐，BUN,葡萄糖,尿酸，蛋白，胆红素类，碱性磷酸酶，CPK, AST, ALT, y -GT, Na, K，胆固醇和甘油三酯，补体激活(通过监测Bb、C5a和C3a)。还进行尿液分析(pH、酮体、白细胞、蛋白、葡萄糖、细胞-细菌学检查)。
[0156]研究期间，在任何患者中未发现在生命体征上一致的实验室异常或变化。没有记录到补体因子的血清水平的显著增加。三个组群中的所有样本所产生的值均低于定量下限，例外的是来自于组群I的单个患者的一个样本(患者5，第7天，6小时)，其给出
11.2ng/ml GED0301 的结果。
[0157]没有记录到严重不良反应事件。在所报道的最常见事件为轻度的情况下，在11位患者中记录到25例不良反应事件(AE)(图4)。在14例病例(56% )中，调查人员将AE评定为与治疗无关。这包括实验室异常的14例AE中有11例为给药之前被记录在8位患者中。AE被认为在12例病例(48% )中与所研究药物不相关，在I例病例(4% )中可能与研究药物相关。这例在研究药物给药期间，血清甘油三酯计数升高。在治疗-紧急AE中不存在明显的剂量反应关系。组群2的一位患者在第84天有轻度疾病复发，而组群3的另一位患者经历了 2次需要使用类固醇每日治疗的腹痛和呕吐的严重发作。一位使用SOmg/天治疗的患者在第I天在GED0301给药几分钟后经历了高舒张压，并在第84天经历T波倒置(在心前导程中)。在由心脏病学家仔细检查后，这两个AE都被认为是由患者在前几个月内接受的布地奈德治疗所继发的。在一位具有过敏性疾病史的患者中，在第31天记录到过敏性鼻炎的发作。这个AE在单次给药抗组胺化合物后很快消解。
[0158]提名了独立安全性委员会(由毒理学、药物警戒学和临床炎症性肠病领域的专家构成)来监测和评估安全性参数。在第I天和第7天，在给药后0、2、6、12和24小时也获取血液样本，用于药物动力学分析并用于外周血单核细胞(PBMC)分离。通过评估在不同时间点(例如第8、28、60和90天)，达到缓解判定标准(CDAK150)或实现被定义为CDAI值比基线降低70个点或更多点的临床反应的患者的数量,来确立治疗效果。
[0159]实施例2:SMAD7在人类肠腺滤泡和派尔集合淋巴结中表达
[0160]肠样本从4位由于慢性活动疾病而经历手术切除、并且对医学治疗反应不良的CD患者获得。这些样本用于通过免疫组织化学来分析SMAD7。
[0161]将来自于患有⑶的患者的组织切片切割，脱石蜡化，并通过二甲苯和乙醇脱水。出于抗原修复的目的，将载片在PH6的0.0lM柠檬酸盐缓冲液中，在微波炉中孵育10分钟。为了封闭内源的过氧化物酶，然后将载片在室温下，在2% H2O2中孵育20分钟。在室温下与小鼠抗人类SMAD7抗体孵育I小时。在Tris缓冲盐水中漂洗后，将载片与偶联辣根过氧化物酶的兔抗小鼠抗体在室温下孵育30分钟。通过加入作为底物的二氨基联苯胺，将免疫反应性细胞可视化，并用苏木精对其进行轻微复染。作为阴性对照，使用纯化的正常的兔抗血清代替SMAD7第一抗体来处理组织切片。
[0162]这些研究显示，SMAD7在人类肠腺滤泡和派尔集合淋巴结中表达(图5)。这一观察表明，下调或敲减具有SEQ ID NO:6的SMAD7，可以使TGF-β I在这些结构中发挥作用，因此降低表达炎性细胞因子(例如IFN- Y )的T细胞的比例，并提高调节性T细胞(其在本文中被称为Treg)的百分率。
[0163]实施例3:在培养的T细胞中抗SMAD7反义寡核苷酸处理调节炎性细胞因子的表达
[0164]研究了在培养的CCR9阳性细胞中，GED0301对炎性细胞因子的表达的影响。为了确定GED0301接触(exposure)对CCR9阳性细胞的影响，将从5位未参与试验的、类固醇依赖性的活动CD患者中分离到的PBMC，重悬浮在添加有青霉素(100U/ml)和链霉素(100U/ml)的X-vivo无血清培养基(Lonza, Venders, Belgium)中，并在存在或不存在Smad7反义(GED0301)或正义寡核苷酸Oμg/ml)的情况下培养48小时。将Smad7反义和正义寡核苷酸与Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)合并，以便于有效转染培养的细胞。使用直接针对CCR9、β 7、IFN- Y和IL17A的抗体，通过流式细胞术对细胞进行染色和分析，以便测定在每种处理条件下，在CCR9+或β 7+群体内表达IFN-y或IL17A的T细胞的百分率。
[0165]分析来自于上述培养的PBMC的CCR9+和β 7+群体中IFN- Y和IL17A的表达，以便确定在CCR9+细胞中GED0301是否直接抑制炎性细胞因子的表达。用GED0301 (Smad7反义)处理⑶PBMC显著降低表达IFN- Y和IL-17A的CCR9+细胞的百分率(图6A)，而表达细胞因子β 7+的细胞的比例保持不变(图6Β)。例如，在未处理的细胞中，表达IFN-Y的CCR9+细胞的百分率为78.9±7.3 ;在用正义链处理的细胞中为78.3±7.3 ;并且在用GED0301处理的细胞中为54±7.2。类似地，在未处理的细胞中，表达IL-17A的CCR9+细胞的百分率为77.4±7.3 ;在用正义链处理的细胞中为74.3±6.4 ;并且在用GED0301处理的细胞中为53.9±5.7。相 反，未处理、正义链处理和GED0301处理的表达IFN-y的β 7+细胞的百分率分别为:13.1±1.2、11.7±0.7和11±0.8，并且未处理、正义链处理和GED0301处理的表达IL-17A的β 7+细胞的百分率为12.1±1.5、10.4±1.2和10.6±1.1。因此，培养的CCR9+⑶PBMC直接接触GED0301导致炎性细胞因子的表达降低。
[0166]实施例4:抗SMAD7反义寡核苷酸处理调节T细胞群体的表达
[0167]本实施例描述的研究调查了，以循环的CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN- Y +T细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞、IL17A+T 细胞、FoxP3+CD103+T 细胞和整合素α 4β 7+T细胞的比例，作为这些Treg细胞群体的活化状态，反映在肠的滤泡和派尔集合淋巴结中发生的免疫应答。在下述研究中，对于每个试验的组群，在第O日测量T细胞群体以测定每位患者的基线测量值。将GED-0301如上在实施例1中所述地给药7天，并在第8天、第28天再次测量T细胞群体，并且对于某些细胞群体来说在第84天再次测量。
[0168]对Treg的外周库(peripheral pool)的处理，已成为治疗免疫介导的疾病和移植的特别的焦点。以往的研究显示，抗TNFa抗体能增加外周血Treg的数量，并且该增加仅见于对抗TNFa疗法产生反应的患者。抗TNFa疗法对Treg的影响可能由TGF-β I介导。
[0169]研究了 SMAD7反义寡核苷酸疗法的效果，以确定
[0170]SMAD7反义寡核苷酸疗法正向调节Treg的数量是否为增加了 TGF-β I活性的结果。还研究了 SMAD7反义疗法的效果，以确定这样的治疗是否引起循环的FoXP3+Treg的数量变化，以及这种效果是否与效应分子Thl/Thl7细胞的百分率的变化相关。
[0171]此外，CCR9+T细胞在患有克罗恩病的患者的外周循环中富集，并具有粘膜T细胞的特征，包括活化表型、对CD2活化的反应性和制造炎性(例如IFN-Y)和调节性(例如IL10)细胞因子两者的能力。还研究了 SMAD7反义疗法的效果，以确定这样的治疗是否引起循环的CCR9+细胞数量的变化。
[0172]对于PBMC分离和流式细胞术分析来说，将血液样本(1mg)收集在含有肝素的管中，用RPMI1640 (1:1)稀释，并使用Ficoll-Paque通过密度梯度离心进行分析。为此目的，将管以1800rpm离心30分钟，收集得到的PBMC，并在RPMI1640中洗涤两次。
[0173]将PBMC重悬浮在添加有10%失活的FBS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)的RPMI1640中。使用下列抗体，通过流式细胞术对细胞进行表型表征:APC标记的抗人类CCR9抗体和PE标记的抗人类Foxp3抗体。所有抗体以1:50的最终稀释度使用。
[0174]还将PBMC接种在96孔U型底培养板中，并用12-肉豆蘧酸13-乙酸佛波醇酯(PMA，10ng/ml)、离子霉素(lmg/ml)和布雷菲德菌素A(10mg/ml)刺激。5小时后，使用上述抗体对细胞进行染色用于研究CCR9表达，并使用下列抗体用于研究IFN- Y和IL-17A表达:FITC抗人类IFN-Y抗体、Alexa Fluor647抗人类IL-17A抗体和PE-抗人类IL17A抗体。所有抗体以1:50的最终稀释度使用。在所有实验中均包括合适的同种型匹配的对照。FITC抗人类IFN- Y抗体从Beckton Dickinson获得,这里使用的所有其他抗体从EB1sciences获得。
[0175]值以中位值表示，各个组间的差异使用Mann Whitney U检验进行比较。使用Wilcoxon配对检验,确认统计学显著性(ρ〈0.05)。
[0176]研究了 GED0301治疗对炎性/反调节性淋巴细胞的比例的影响。正如在试验的第8和28天所监测到的，GED0301治疗没有显著改变循环的CD3+、CD4+、CD8+、CD25+、CD161+、⑶62L+、α4β7+或CCR9+细胞的百分率(图7)。类似地，在GED0301治疗后，没有观察到白介素(IL)-17Α+细胞、IL-1O+细胞、FoxP3+细胞、表达干扰素(IFN)-Y和IL-17A的α 4β 7+细胞或表达FoxP3的⑶103+细胞的比例的显著变化。
[0177]表I和Ia示出了接受7天的40mgGED_0301/天的组群I的结果。表I示出了在第0、8、28天时，给定的T细胞群体占总细胞群体的百分率。表Ia示出了在第0、8、28和84天时，CCR9+FoxP3+T细胞、FoxP3+T细胞和CD103+FoxP3+T细胞占总细胞群体的百分率。
[0178]表II示出了接受7天的80mg GED-0301/天的组群2的结果。表II示出了在第O、8和28天时，给定的T细胞群体占总细胞群体的百分率。表IIa示出了在第0、8、28和84天时，CCR9+FoxP3+T细胞、FoxP3+T细胞和CD103+FoxP3+T细胞占总细胞群体的百分率。
[0179]表III示出了接受7天的160mgGED-0301/天的组群3的结果。表III示出了在第0、8和28天时，给定的T细胞群体占总细胞群体的百分率。表IIIa示出了在第0、8、28和84天时，CCR9+FoxP3+T细胞、FoxP3+T细胞和CD103+FoxP3+T细胞占总细胞群体的百分率。
[0180]表IV示出了来自于组群1-3的总患者的合并结果。表IV示出了在第0、8和28天时，给定的T细胞群体占总细胞群体的百分率。表IVa示出了在第0、8、28和84天时，CCR9+FoxP3+T细胞、FoxP3+T细胞和CD103+FoxP3+T细胞占总细胞群体的百分率。
【权利要求】
1.一种用于确定患有炎症性肠病的患者对使用至少一种抗SMAD7疗法的治疗的反应性的方法，该方法包括: 在从所述患者获得的至少一个样本中，测定选自由下列细胞群体所组成的细胞群体组中的至少一种细胞群体的量:CCR9+FoxP3+T细胞，CCR9+IFN-Y+T细胞，CCR9+IL17A+T细胞，FoxP3+T细胞，IFN- Y +T细胞和IL17A+T细胞， 其中，在所述至少一个样本中，相对于所述至少一个细胞群体的已知对照水平，细胞群体CCR9+FoxP3+T细胞的量的增加和/或细胞群体CCR9+IFN- Y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN- Y +T细胞和IL17A+T细胞中至少一个细胞群体的量的减少，预测所述患有炎症性肠病的患者对所述抗SMAD7疗法的反应性。
2.如权利要求1所述的方法，其中，两种或更多种下列调节被鉴定以帮助确定所述患者的反应性: CCR9+FoxP3+T细胞的量的增加，表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性； CCR9+IFN- Y +T细胞的量的减少，表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性； CCR9+IL17A+T细胞的量的减少，表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性； FoxP3+T细胞的量的减少,表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性； IFN- Y +T细胞的量的减少,表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性； IL17A+T细胞的量的减少,表明所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其在离体的情况下进行。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中，在获得所述至少一个生物样本时，所述患者正接受至少一种抗SMAD7疗法。
5.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述炎症性肠病是克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其中，下列至少一项表明所述患者可能进入缓解:CCR9+FoxP3+T细胞的量增加、CCR9+IFN- y +T细胞的量减少、CCR9+IL17A+T细胞的量减少、FoxP3+T细胞的量减少、IFN- Y +T细胞的量减少或IL17A+T细胞的量减少。
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其中，所述至少一个样本是血液样本或组织样本。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述组织样本来自于所述患者的胃肠道。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其中，所述至少一种细胞群体的量通过流式细胞术、免疫组织化学和/或RNA/DNA分析来确定。
10.如权利要求9所述的方法，其中，使用选自由下列的抗体所组成的抗体组来进行所述流式细胞术和/或免疫组织化学:抗CCR9抗体，抗FoxP3抗体，抗IFN- Y抗体和抗IL17A抗体。
11.如权利要求1至10任一项所述的方法，其中，所述对照水平是在施用至少一种抗SMAD7疗法之前从所述患者获得、或在施用至少一种抗SMAD7疗法后立即获得的所述至少一种细胞群体的基线水平。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述至少一种抗SMAD7疗法是抗SMAD7反义疗法。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述抗SMAD7反义疗法是选自由SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 所组成的组的抗 SMAD7反义寡核苷酸。
14.一种试剂盒，包含下列组分中的至少两种:用于鉴定细胞群体的抗CCR9抗体、抗FoxP3抗体、抗IFN- Y抗体和/或抗IL17A抗体，或用于检测编码CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN- Y +T 细胞、CCR9+IL17A+T 细胞、FoxP3+T 细胞、IFN- y +T 细胞和 IL17A+T 细胞中的至少一种细胞群体的蛋白质细胞标志物的RNA的表达的试剂。
15.如权利要求14所述的试剂盒，还包含使用FACS技术来鉴定、分拣和计数细胞的至少一种缓冲剂、试剂和详细说明书。
16.如权利要求14所述的试剂盒，其中，所述抗体是针对CCR9蛋白的第一抗体、针对FoxP3蛋白的第一抗体和与报告酶偶联的第二抗体，并且所述试剂盒至少还任选地包含使用免疫组织化学来鉴定细胞群体的缓冲剂、试剂和详细说明书。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其中，包括针对CCR9蛋白的捕获抗体、针对FoxP3蛋白的检测抗体和/或与报告酶偶联的第二抗体；并且还任选地包含使用ELISA技术来鉴定细胞群体的缓冲剂、试剂和详细说明书。
18.至少一种抗体，该抗体针对CCR9+FoxP3+T细胞、CCR9+IFN-y +T细胞、CCR9+IL17A+T细胞、FoxP3+T细胞、IFN-Y+T细胞和IL17A+T细胞中的至少一种的细胞标志物，并用于在人类或动物体上实施的诊断方法中。
19.用于权利要求18中限定的用途的至少一种抗体，其中，所述诊断方法是:预测或监测患有炎症性肠病的患者对使用至少一种抗SMAD7疗法的治疗的反应性，或确定患有炎症性肠病的患者对使用至少一种抗SMAD7疗法的治疗的适合性，以确定所述患者可能对所述抗SMAD7疗法产生反应或具有反应性，和/或确定所述患者是否可能进入缓解。
20.参考随附的说明书、实施例和附图，基本上如前文中所描述的方法、试剂盒或用途。
【文档编号】G01N33/50GK104040349SQ201280056296
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2011年9月15日
【发明者】乔瓦尼·蒙泰莱奥内, 弗朗西斯卡·维蒂, 塞尔瓦托·贝利尼亚 申请人:诺格尔制药有限公司