专利名称：分离的存活的寄生虫肠细胞的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及分离的存活的寄生虫细胞及其用途。具体地说，本发明涉及采用从分离的存活的寄生虫细胞获得的免疫原性物质用来预防或治疗寄生虫侵袭或感染的疫苗。
背景技术：
寄生虫感染普遍存在于马和畜牧业中。估计由于寄生虫感染而导致的损失达几亿美元(Gibbs和Herd，1986)。寄生虫感染可能表现出临床或亚临床症状。尽管临床性寄生虫感染表现出的更显著的症状，但是亚临床寄生虫感染却更普遍，它会使饲料效率和繁殖能力降低，并且易患疾病。这些影响因动物年龄、存在的寄生虫类型、营养和环境应激反应、管理系统、其它疾病状肽的存在、遗传史和其它各种因素而复杂化(Gibbs和Herd，1986；Hwakins，1993)。
在美国，对于寄生虫的控制侧重于使用抗蠕虫药，服用这些药品每年要花费几十亿美元(Lanusse和Prichard，1993)。传统上控制的实质是治疗；治疗动物防止其死亡而不是防止其受感染。严重的疾病和死亡率虽有所下降，但是由于牧场或马厩受污染而导致重复感染，治疗期间的亚临床损失却始终存在。
最近，一种更好的预防性控制线虫的方法已经较为普及，它依靠的是单用抗蠕虫药或与放牧/牧场管理规程结合的策略(Williams，1986；Miller，1993；Stromberg和Corwin，1993)。这些方案的目标是减少牧场受感染性幼虫污染，而不是针对成年寄生虫，因而减少了接触寄生虫的危险。而这又减少了牲畜群中的亚临床寄生现象。尽管抗蠕虫药提供了许多经济上的优点，但是它们的使用也有一些明显的缺点会产生显著的抗药性，并且持久存在的残余药物和生态毒性有潜在危害(Waller，1993)。
使抗蠕虫药效率下降的原因是产生了抗药性，这在反刍动物中已有详细记载。这种现象首次报道于1957年，在捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)中发现对酚噻嗪有抗性(Drudge，1957)。即使yong更新的抗蠕虫药，仍存在抗药性问题。尽管这主要是马和小反刍动物中存在的问题，但是也已报道牛寄生虫也有某种抗药性。胃线虫属抗左旋咪唑的抗药性(Lyons，1981；Geerts，1987；Williams，1991；Williams，1991)、抗莫仑太尔缓释丸剂的抗药性(Borgsteede 1988)、对左旋咪唑的副抗药性(side-resistance)(Borgsteede，1991)、毛圆线虫(Trichostrongylusaxei)和肿孔古柏线虫(Cooperia oncophora)抗奥芬达唑的抗药性(Eagleson &Bowie，1986；Jackson，1987)均已有记载。在用于控制线虫的所有类型的抗蠕虫药中均会发生抗药性。交叉抗药性、多重抗药性和副抗药性已有报道(Craig，1993)。据信，抗药性的产生是由于不同制剂之间的迅速“轮转”所激惹。一旦除去了选择压力，脱离抗药性返祖或选择是缓慢的(Kelly & Hall，1979)。
针对牛肠胃寄生虫的疫苗开发在总体上产生了次优的结果。由于反刍动物的肠胃线虫的生长繁殖不受免疫系统的影响，因此，模拟免疫平衡的疫苗不可能有很高的效率。能通过不同于模拟天然免疫力的机制来诱导保护力的疫苗理论上来说会更成功(Willadsen，1993)。
由于所在的生理位置，肠道组织中“隐藏”的抗原通常不暴露于宿主免疫系统或为其“发现”，因此它们通常不引起免疫应答反应。用各种寄生虫“隐藏”抗原的分离制剂对宿主进行接种已经显示出有可能诱导致死性免疫应答。
首先用按蚊(Anopheles)的肠组织作为生产疫苗的抗原来源。用蚊子中肠(midgut)的异种细胞组分匀浆物对家兔进行注射，吸食该家兔血液的蚊子的死亡率比吸食对照家兔血液的蚊子死亡率高(Alger & Cabrera，1972)。用异种细胞组分匀浆物免疫接种入牛和豚鼠(该细胞组分含有从部分喂饱的安氏革蜱(Dermacentor andersoni)的肠抽提出的抗原)。吸食接种动物血的蜱吸饱血和产卵量明显减少(Allen & Hemphreys，1979)。在用美洲花蜱接种的小牛中获得类似的成功(McGowan，1981)。这些成功以及抗杀螨剂蜱类的出现激励了对牛特异性蜱微小牛蜱(Boophilus microplus)的研究工作。
用部分喂饱的蜱的粗提物对牛免疫，结果减少了蜱的数量(Johnston，1986)。这种保护力与涉及蜱攻击部位过敏性反应而获得的天然抵抗力不同，这种不是一种对免疫接种的应答反应(Kemp，1986)。吸食免疫小牛血的蜱的肠组织组织病理学研究表明，吸食蜱天然感染小牛血的蜱没有受到伤害(Agbede & Kemp，1986)。另外，注射了蜱肠膜粗提物和佐剂的小牛具有的抗体水平明显高于自然感染小牛。用肠膜抗原粗提物接种小牛，然后用寄生虫攻击，结果未显示出任何明显的回忆性应答反应，尽管攻击剂量足以在首次做试验的动物体内产生低而显著的抗体应答(Opdebeech & Daly，1990)。这些观察结果支持了这样一个观点用肠膜接种和天然蜱感染不会引起相同的免疫应答反应。
用纯化的蜱粗提物进行实验，结果证明了免疫保护性抗原与寄生虫肠膜有关(Opdebeeck，1988；Willadsen，1988；Willadsen，1989)。对该抗原作进一步的特征分析，结果揭示了它是膜结合糖蛋白，称为Bm86。用该抗原对宿主动物免疫会减少蜱的存活、吸饱血量和繁殖能力。该抗原的抗体迅速抑制了蜱肠道中寄生消化性细胞(与基膜分开的大管腔侧肠细胞)的胞吞活性。克隆该抗原并在大肠杆菌中表达成包涵体。吸食经这些包涵体接种过的小牛血的蜱明显受到破坏，但未被杀死(Rand，1989)。
针对微小牛蜱的中肠膜沉淀抗原而产生的单克隆抗体在攻击研究中有99％以上的保护力。在进行常规的SDS-PAGE时，这些抗原分离成一条主要条带和5条次要的条带，这表明几种抗原均具有单克隆抗体所识别的表位。这些抗原被认为与Bm86不同，因为用这些抗原进行接种会导致蜱死亡(Lee & Opdebeeck，1991)。
这些抗原可能是寄生虫生命周期多个阶段中共有的，在不同阶段中，共同的反应表位可能在不同蛋白上(Maizels，1987)。由于抗体水平与蜱肠抗原免疫所提供的保护水平有关(Opdebeeck，1998；Lee & Opdebeeck，1991)，用抗肠抗体纯化幼虫和成虫抗原抽提物。纯化的幼虫和成虫抗原二者提供的保护力均超过80％，因此保护性抗原可能是这两个阶段共有的。发现蜱卵膜抽提物对攻击性感染有免疫原性，但没有保护力。抗卵膜和抗肠膜抗体有交叉反应，识别卵和蜱肠中的共同抗原。
由于蜱肠膜接种的以及蜱自然感染的牛血清中的抗蜱抗体与成年蜱唾液腺和肠抗原以及幼虫抗原反应，因此认为微小牛蜱的肠抗原并不是真正的“隐藏”抗原(Opdebeeck & Daly，1990)。然而已明确，当自然感染的牛的抗血清与Bm86反应时，它是通过对蜱没有有害作用的交叉反应性糖类表位而发生(Willadsen &McKenna，1991)。因此，肠抗原Bm86是“隐藏”的，它的多肽表位起提供免疫保护力的作用、也有建议将“隐藏”抗原作为控制猫蚤(包括栉首蚤属)(Ctenocephalides feli)感染的手段。用含猫蚤中肠抗原的细胞组分匀浆物对家兔免疫，将产生的免疫球蛋白喂给猫蚤，结果显示有有害作用。用粗提抗原对狗进行免疫，再用蚤攻击，结果存活的蚤比对照动物少，且存活的雌蚤产卵较少(Heath，1994)。
捻转血矛线虫属(一种经济上很重要的羊体内食血线虫)也已成为疫苗开发的目标。注射Freund完全佐剂诱导的非特异性免疫应答提供了一些抵抗捻转血矛线虫的保护作用(Bautista-Garfias，1991)。而角质层胶原接种没有保护性，尽管它有免疫原性(Boisvenus，1991)。相反，成虫和第三期幼虫的可溶性抗原证实是弱的免疫原(Cuquerella，1991)。
扭曲蛋白(contortin)是一种胞外聚合蛋白，它与线虫肠道上皮胞质膜的肠腔表面松散地结合。用从全虫(whole worm)匀浆物制得的富含扭曲蛋白的抽提物进行接种，这在幼羊羔中有保护作用。接种动物体内的线虫数量少于对照动物中所见数量(Munn，1987)。血清抗体可使富含扭曲蛋白的抽提物的几个组分沉淀。
用成年线虫和第三期(L3)幼虫的肠组织粗提物接种，在山羊体内提供了类似的保护作用(Jasmer & McGuire，1991)。在免疫组中，蠕虫数量和排卵数均有所减少。免疫血清的抗体识别7种肠蛋白，其中一些是完整的膜蛋白。这一抗原制备物可能含有显著量的扭曲蛋白(Munn，1993b)。免疫组织化学证实了抗原来自寄生肠细胞群，并证明了和胃线虫属胃线虫(Ostertagia ostertagi)中的微绒毛(microvillar)蛋白以及一些马的小圆线虫有交叉反应性。Smith(1993)证实了Suffolk幼羊羔经捻转血矛线虫肠抽提物免疫后，回收的线虫数量减少。对捻转血矛线虫表现出有天然免疫力的羊血清不和肠膜蛋白反应，这证实了这些蛋白的“隐藏”特征。用接种羊的免疫血清被动传递使接受血清的动物排卵减少。从这些动物回收的线虫微绒毛包裹有宿主抗体暗示抗体起着效应物机制。在肠膜中没有观察到病变。微绒毛的包裹可能中和了蠕虫所需的蛋白(即酶)从而导致蠕虫死亡，或者包裹可能机械地阻闭了营养物的吸收，从而有效地使线虫饿死。
第四(L4)和第五(L5)期捻转血矛线虫幼虫中的抗原H11是该线虫的一种主要的微绒毛完整膜蛋白。用H11和富含H11的制备物(含有少量外周膜蛋白P1)对Merino幼羊羔接种，结果导致线虫和线虫排卵平均数减少。注意到排卵推迟，这暗示效应物机制可能作用于寄生虫成年之前的阶段(Munn，1993a)。虫数和排卵数的减少与抗H11的血清抗体滴度相关(Smith，1993；Tavernor，1992a，b)。已从DNA测序推导出H11有酶活性，并通过试验和特异性抑制剂研究(Munn，1993)得以确证。H11的活性被接种动物的血清抗体抑制。产生的大多数抗体靶向H11(Munn，1993)，且抑制水平与保护力水平有关(Munn，1993)。和扭曲蛋白一样，宿主免疫球蛋白看来是效应物机制。宿主抗体早在感染7天后便与寄生虫肠道结合，在第7至14天之间观察到线虫死亡。比感染后7天更年幼的幼虫显然对免疫反应不敏感。用细流(注射)接种攻击经抗原H11免疫的羊羔，大多数羊羔得到保护，没出现攻击试验对照动物中观察到的贫血和排卵。它们象未感染对照一样有效生长，并且在细流感染(trickle infection)期间获得了天然免疫力。用对苯并咪唑有抗药性或敏感的捻转血矛线虫品种攻击的动物同样受到H11接种的保护(Smith & Smith，1993)。雌性寄生虫比雄性减少得更快，这就说明了排卵减少的原因。
用富含H11的全虫抽提物接种，结果显示保护性活性主要与H11相关。另一组分，P1或H45也是保护性组分，但其含量比H11多得多。用富含H11的抽提物(含有P1)免疫为Dorse羊羔和Clun Forest羊提供了保护(Tavernor，1992a；Munn，1993b)，但是发现在Clun Forest羊中线虫减少更多。保护力的这一差别可能是由于(动物)品种、抗原量或羊羔的年龄而致。直接比较用富含H11的无扭曲蛋白抗原(Munn，1993b)和富含扭曲蛋白的抗原(Munn，1987)接种所得到的保护力，用富含H11的无扭曲蛋白制备物获得的保护(即虫数和产卵数的减少值)力平均值与用富含扭曲蛋白的制备物获得的最佳保护力相等，即使采用更少量的H11蛋白也一样。因此，H11比扭曲蛋白更有效。用100mgH11抗原就可获得足够的保护，而经证实用更大量的抗原也不会获得更大的保护(Tavernor，1992a)。用95％纯的H11接种使线虫数量减少高达93％，产卵数减少94.6％。
在用环绕胃线虫(Ostertagia circumcincta)和细颈线虫(Nematodirus battus)的攻击研究中没有表现出交叉保护。这可能反映了抗原性的不同，或是因为线虫摄入宿主免疫球蛋白的量不足以引起致死性伤害(Smith，1993)。针对捻转血矛线虫的肠表面表位的单克隆抗体所识别的表位也位于第三期(L3)幼虫的体壁、角质层区域和内部器官上的表位，以及胃线虫属胃线虫、蛇形毛圆线虫(Trichostrongyluscolubrformis)、马的小圆线虫和Caenorhabditis elegans的肠和组织中(Jasmer，1992)。
用外源凝集素作为配体来纯化全虫抽提物的微绒毛糖蛋白，从肠细胞的完整膜组分中分离获得另一种保护性组分。含有糖蛋白复合物的该血矛线虫半乳糖组分(或H-gal-GP)很容易凭借SDS-PAGE、其外源凝集素结合特异性以及其较低的等电点，与H11或P1分离开来。在并排比较研究中，H-gal-GP的保护性比H11低，线虫减少数量不如H11大，但是产卵减少数却相似。象H11一样，H-gal-GP对雌虫比雄虫更有效。文献中的比较结果显示，H-gal-GP比H45复合物更有效。H-gal-GP和H45诱导的保护力之间的差别可能是由于所用特定免疫方案的缘故。
从植物寄生虫(毛虫阶段)建立异质细胞系已有描述(Manousis & Ellar，1990)。这些作者称，这是该技术首次成功用于线虫。异质(非特异性)细胞群的存活不超过3个月。添加有胎牛血清(FBS，10％v/v)的生长培养基使细胞群的繁殖时间刚超过5个月。Kurti等(1988)描述了从蜱(安氏革蜱、扇头蜱(Rhipicephalusappendiculatus)、血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)和微小牛蜱)胚胎获得的异质性细胞系在含10％FBS的生长培养基中繁殖，但是没有试图通过选择性的试验技术来繁殖特定细胞系。在关于寄生虫细胞系繁殖的另一篇描述中，将全部寄生虫匀浆化作为原料，因此并没有打算选择性地培育特定细胞系(Hobbs等，1993)。将寄生虫匀浆物转移到含有水老鼠(buffalo rat)肝“饲养”细胞层的组织培养板孔中，采用“无”血清的生长培养基。改良类似DMEM的生长培养基，使其含有更少的KCl和葡萄糖，就能维持活细胞系四周或更长时间。将幼虫细胞置于经照射过的水老鼠肝(BRL)细胞的饲养层上可延长细胞团的存活几个星期至6个月之久。牛内皮或小鼠胚胎(3T3)的饲养层效果较差。Kurtti和Munderloh(1984)描述了从幼虫组织、成虫卵巢和胚胎组织生产蚊虫细胞，从而可培育蚊虫细胞的异质性混合物几年之久。Munderloh等(1994)描述了从受孕蜱卵繁殖异质性细胞群。这些研究者叙述了将细胞长期保藏在液氮中很困难。细胞在含有胎牛血清(FBS 20％v/v)的组织培养生长培养基中繁殖。原代培育开始到第一次亚培育之间的时间间隔为6-12个月。
从上述研究可以看出，寄生虫细胞表达的抗原显示了在羊和牛体内提供保护性免疫力的潜力。不幸的是，这些组分是通过显微解剖人工从寄生虫肠道中收获得到的。因此，要获得足量的免疫原性蛋白，劳动量是非常大的，且成本很高。而且，很难获得足够纯的抗原并鉴定出可用于疫苗的抗原。已经从寄生虫建立起来的细胞系是异质的、不分化的群体，它很难在组织培养环境下维持较长的时间。因此，需要可在培养中维持较长时间的寄生虫细胞的均质群体。
本发明通过提供了能在培养中维持较长时间的寄生虫细胞均质的群体以及产生该均质群体的方法而满足了这一需求。
发明概述本发明提供了一种均质的寄生虫细胞群，其中细胞非蚊虫细胞，能在体外长时间培养。还提供了该细胞的组分，包括细胞和非细胞组分。本发明还提供了与细胞或细胞亚组分特异性结合的抗体和抗独特型抗体本发明还提供了一种治疗或预防动物寄生虫的方法，该方法包括给予动物免疫原性量的本发明的寄生虫细胞或从该细胞获得的组分，从而治疗或预防动物寄生虫。
本发明还提供了筛选有抗蠕虫药活性的化合物的方法，该方法包括使化合物和本发明的细胞接触，并测定化合物是否对细胞有不利影响。
本发明还提供了一种检测动物体内存在寄生虫的方法，该方法包括使本发明的寄生虫细胞或从该细胞获得的组分与动物的含抗体样品接触，并检测样品中的抗体是否与细胞或细胞组分结合，有结合就表示动物体内有寄生虫。
另外，本发明还提供了一种检测动物体内存在寄生虫的方法，该方法包括使本发明的抗体与可能含有寄生虫抗原的动物样品接触，检测是否有抗体和抗原结合，有结合存在就表示动物体内存在寄生虫。
另外，本发明还提供了一种体外培养寄生虫细胞群的方法，该方法包括，在使寄生虫的角质层分解和/或退化从而产生细胞芽的条件下，在寄生虫培养基中培养寄生虫；破坏培养物，使细胞芽从角质层上断下；和在细胞培养基中培养寄生虫细胞芽。
本发明还提供了一群寄生虫细胞，该细胞不包括蚊虫细胞，能在体外长时间培养，它通过体外培养寄生虫细胞群的方法来产生，该方法包括，在使寄生虫角质层分解和/或退化从而产生细胞芽的条件下，在寄生虫培养基中培养寄生虫；破坏培养物，使细胞芽从角质层上断下；和在细胞培养基中培养寄生虫细胞芽。
最后，本发明提供一群能在体外长时间培养的分化的线虫细胞。
本发明的其它各种目的和优点可从下列描述中明显看出。
附图简述
图1显示了在组织培养(体外)环境中繁殖的寄生虫细胞。A团簇表示已经从幼虫角质层鞘中突出的寄生虫细胞芽。B细胞团簇的直径大于单个幼虫，这表明从幼虫突出后的细胞芽有体外增殖。
发明详述本发明将在下列实施例中有更具体地描述，这些实施例只是起描述作用，因为本领域技术人员显然能对其作多种改进和变化。权利要求中所用的“一个”可包括多个。
本发明提供了一种均质的寄生虫细胞群，该细胞非蚊虫细胞，能在体外长时间培养。“均质”指细胞基本上只有一个类型。例如，均质的群体可由100-80％范围内任何一个数值(例如，100％、＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、79％，在较佳的范围内，尤其是90％、9l％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％)的一类细胞组成。均质群中一种细胞类型的细胞百分数可用本领域标准方法(例如荧光激活细胞分拣法(Harlow和Lane，1988))来测定。“可以长时间培养”指细胞能传代、冷冻和重建，这样细胞能以均质的群体维持无限期。例如，本发明的细胞以均质的细胞群已维持了三年。
由于这些细胞以悬浮培养方式来维持，因此当观察到组织培养瓶底部有大量细胞沉积时，最好对这些细胞进行传代。本发明的细胞可通过将一个培养瓶中的细胞分到另一个组织培养瓶中或在原来的瓶中添加额外的细胞培养基来进行传代。另外，本发明的细胞可根据本领域中已知的培养细胞的低温保藏标准技术将活细胞长时间冷冻保藏。例如，可离心含有细胞的培养液使细胞沉淀，并弃去上清液。然后将细胞沉淀物重悬于冷冻培养液中(例如IPL-41或SF-900培养基或IPL-4和SF-900的50/50混合物中，培养基中(例如)含有10％(v/v)DMSO，并添加了阿米卡星(2.5mg/ml)和苯唑西林(2.5mg/ml))。然后将培养液和细胞转移到冷冻小管中，置于-96℃1小时。然后将冷冻小管置于液氮中持续保藏直至重建。
为了重建细胞，例如，将含有细胞的冷冻小管从液氮中取出，用酒精对小管外部消毒。将小管置于室温水浴(RT25℃)中融化。在小管内加入2毫升细胞培养液以稀释DMSO，并低速(200-300xg)离心使细胞沉淀。倾弃上清液，加入新鲜培养液，再次沉淀细胞。再倾弃上清液，将细胞重悬于约有90％新鲜培养液和10％用过培养液的组织培养液中，并转移到组织培养瓶中。从幼虫培养出的细胞群或冷冻保藏后重建获得的细胞群可传代无限次数，并可作为活细胞无限期地维持(即维持数年)下去。
本发明中获得或使用的寄生虫细胞可以是在成虫或幼虫中发现的任何类型的细胞。例如，这些细胞可以包括，但不局限于，肠、食管分泌性的、肌肉、神经和生殖细胞，例如子宫细胞。特别可用于治疗和预防寄生虫的是肠细胞。
如下文更详细描述的那样，这些细胞(例如)可用于治疗、预防和诊断目的。针对这些目的的任何一种，细胞可用完整的、部分或全部裂解的形式，以及与或不与培养细胞的培养基一起使用。因此，从寄生虫细胞可获得不同的细胞组分。例如从其余培养基和细胞成分可分离出膜结合抗原作为膜组分，并用于各种用途。其它细胞组分可包括(但不局限于)全细胞组分、亚细胞细胞器组分、酶组分、遗传物质(如RNA、DNA)等。另外，也可使用不含细胞的、培养过细胞的培养液，因为某些细胞组分已经释放到培养液中，它们可作为非细胞组分来收集和分析。含有和不含细胞的(裂解或不裂解的细胞)的培养基可用于治疗、预防或诊断用途，以使细胞与培养基之比以及裂解与不裂解细胞之比最优。最优化涉及根据本领域标准程序进行体外和/或体内效率试验，以测定或鉴定能产生治疗、预防或诊断最优结果的那些培养基细胞之比和裂解细胞不裂解细胞之比(例如，Smith，1993)。
本发明的细胞可用本领域中的任何标准方式(例如洗涤剂溶解和机械破碎)(Travenor等，1992)来裂解。用标准的细胞分级技术从细胞裂解物中分离出各种细胞组分，这些技术(例如)有凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、高压液相层析(HPLC)等，这些均是本领域中熟知的(例如，Travenor等，1992；Munn等，1993；McKerrow等，1990；Gambel等，1990)。
或者，可通过用离子洗涤剂(如十二烷基硫酸钠)或非离子洗涤剂(如TritonX-100(平均分子式C34H6O11)或乙基苯基-聚乙二醇(NP-40，Shell Oil Company))处理细胞来获得寄生虫细胞的蛋白组分。这样获得的蛋白组分可如上所述测试其免疫原性、特异性和生物化学酶活性。寄生虫细胞的其它免疫原性特异性决定簇可用(例如)上述标准方法来获得。
根据本领域的标准方法，可以分离和纯化获得本发明的细胞产生的蛋白和蛋白片段，并可对这些蛋白和蛋白片段产生的氨基酸序列和核酸序列进行测定。编码这些蛋白和蛋白片段的核酸可按照本领域熟知的分子遗传学程序克隆到载体中并在细胞中和/或转基因动物中表达(例如参见，Sambrook等，1989)。
在从细胞培养中取出的裂解或未裂解的细胞或培养基、从细胞获得的细胞组分中可以加入其它成分。因此，本发明提供了包含这些成分的组合物，它们可以包括有效量的细胞、细胞组分或非细胞组分，以及药学上可接受的载体，另外还可包括其它医药用制剂、药物制剂、载体、佐剂、稀释剂等。“药学上可接受”指物质在生物或其它方面并非是不合意的，即该物质可以和所选化合物一起给予个体而不会引起明显的不希望产生的生物效应，或以有害的方式与药物组合物所含任何其它成分相互作用。制备剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或是显而易懂的(例如参见，Martin，最新版；Arnon，1987)。载体自然应选择能最大程度地减少活性组分的降解和在受治疗对象体内不引起不良副作用的载体。
在另一个实例中，组合物可包括佐剂来增强活性组分的治疗或预防效果。佐剂可根据标准技术根据所用的特定抗原、给药方式和对象(Arnon，1987)来加以选择。例如，组合物可包括Freund完全佐剂，Freund不完全佐剂、氢氧化铝或已知增强抗原免疫原性的其它任何佐剂。
可用来生产寄生虫均质细胞群的寄生虫例子可包括(但不局限于)，线虫、吸虫、蠕虫、环节动物和绦虫，以及节肢动物和蛛形动物种类(例如，蜱、螨、虱和蚤)。特别有用的均质的寄生虫细胞系从线虫获得。用于本发明的线虫例子可包括(但不局限于)，古柏属(Cooperia)，结节属(Oesophagostomum)，胃线虫属(Ostertagia)，血矛属(Heamonchus)，恶丝属(Dirofilaria immitis)和网尾属(Dictyocaulus)。可用于本发明的有经济意义的寄生虫可包括，例如，野牛古柏线虫(Cooperia bisonis)，Cooperia cuticei，Cooperia mcmasteri，肿孔古柏线虫，小栉古柏线虫(Cooperia pectinata)，斑点古柏线虫(Cooperia punctata)，胸叉古柏线虫Cooperia spatulata)，Cooperia surnabada，螺形网尾线虫(Dictyocaulus viviparus)，捻转血矛线虫，Haemonchus placei，相似血矛线虫(Haemonchun similis)，辐状结节线虫(Oesophogostomum radiatum)，野牛胃线虫(Ostertagia bisonis)，Ostertagiaorloffi，胃线虫属胃线虫，Trichostrongylus axei，蛇形毛圆线虫，Trichostrongyluslongispicularis，片形吸虫(Fasciola magna)，片形獐耳细辛属(Fasciola hepatica)，美洲花蜱(Amblyomma americanum)，卡延花蜱(Amblyomma cajenense)，海湾花蜱(Amblyomma maculatum)，具环牛蜱(Boophilus annulatus)，白纹革蜱(Dermacentoralbopictus)，安氏革蜱(Dermacentor andersoni)，西海湾革蜱(Dermacentoroccidentalis)，变异革蜱(Dermacentor variabilis)，Ixodes cookei，Ixodes pacificus，全沟硬蜱(Ixodes scapularis)，牛皮痒螨(Chorioptes bovis)，牛痒螨(Psororgatesbos)，羊痒螨(Psoroptes ovis)，疥螨(Sarcoptes scabiei)，哥伦比亚结节线虫(Oesophogostomum columbianum)，Oesophogostomum venulosum，Ostertagiacircumcincta，西方胃线虫(Ostertagia occidentalis)，三叉胃线虫(Ostertagiatrifurcata)，Trichostrogylus capricola，细颈线虫(Nematodirella longispiculata)，异常细颈线虫(Nematodirus abnormalis)，Nematodirus davtiani，Nematodirus spathiger，蛔虫(Ascaris Suum)，Hyostromgylus rubidus，短刺结节线虫(Oesophagostomumbrevicaudum)，多齿结节线虫(Oesophagostomum dentatum)，Oesophagostomumgeorgianum，四羽结节线虫(Oesophagostomum quadrispinulatum)，圆线虫(Strongyloides ransomi)，西方圆线虫(Strongyloides westeri)，鞭虫属(Trichurissuis)，无齿圆线虫(Strongylus edentatus)，马圆线虫(Strongylus equinus)，普通圆线虫(Strongylus vulgaris)，西方圆线虫(Strongylus westeri)，犬恶丝虫和犬蛔虫(Ascaris canis)。
本发明还提供了特异性结合本发明的寄生虫细胞或细胞组分的抗体或配体。在本文中，抗体可包括免疫反应性抗体片段。这些抗体可用本领域熟知的标准技术来制得(例如参见，Harlow & lane，1988)。针对抗原(如从本发明的完整细胞或细胞裂解物纯化的细胞组分获得)的单克隆或多克隆抗体可用作诊断试剂来检测动物组织或体液中的抗原，还可通过使用亲和捕获和其它抗原纯化技术来纯化寄生虫抗原。本发明的抗体还可用于治疗用途来治疗或预防动物寄生虫。
抗体可直接从受免疫动物纯化获得，或者，产生抗体的脾细胞可从动物获得以便进行杂交瘤生产。脾细胞与无限增殖的细胞系融合，并作为杂交瘤维持分泌抗体。同样，特异性地与抗原反应的纯化的多克隆抗体也在本发明的范围内。多克隆抗体可用标准的免疫和纯化程序来获得(Harlow和lane，1988)。
利用配体或抗体与可检测物结合，就可检测配体或抗体与抗原的反应。这种可检测物可通过由眼检测到沉淀或颜色变化、通过显微镜肉眼检测、或用分光光度计、放射性测定等自动检测。可检测物的例子包括荧光素和罗丹明(用于荧光显微术)、辣根过氧化物酶(用于光学显微术或电子显微术和生化检测)、生物素-链霉亲和素(用于光学或电子显微术)和碱性磷酸酶(用于生化检测颜色变化)。所用的检测方法和可检测物可从上述清单中选出，或根据适用于这些选择的标准指标从其它合适的例子中选出(Harlow和Lane，1988)。
本发明还提供了与抗体特异性结合的抗独特型抗体。这种抗-独特型抗体可自然地用作免疫原来提供抗寄生虫的治疗或预防作用。抗-独特型抗体代表了原始抗原的影像(image)，它可在疫苗制备中起作用，用来诱导对病原性抗原的免疫应答，从而避免用病原或病原性抗原本身来免疫(Harlow & Lane，1988)。
本发明还提供了一种治疗或预防动物(包括人)寄生虫的方法，该方法包括给予动物免疫原性量的寄生虫细胞或从该寄生虫细胞获得的组分，借以治疗或预防动物寄生虫。术语“动物寄生虫”指寄生虫通过感染或侵袭动物、附着于动物、或食取动物的血液或其它组织或体液(无论该动物是死是活)而发生的寄生虫和动物之间的相互作用或联系。
寄生虫细胞、细胞组分或非细胞组分可用本领域熟知的方法来测试其免疫原性(Harlow & Lane，1988，Arnon，1987)。简言之，制备各种浓度的具有潜在免疫原性的细胞或特异性的细胞组分，以各种浓度给予动物，并用标准程序测定动物对每一浓度的免疫应答反应(例如抗体的产生或细胞介导的免疫力)。给予免疫原的量和类型取决于动物的种类、大小和状态。然后，可使经此免疫原接种的动物接触寄生虫，以测试特异性免疫原的潜在疫苗效果。通过测定接种动物的血清、其它体液以及淋巴细胞与其它密切相关的寄生虫的交叉反应性，就可确定潜在免疫原的特异性。一旦确定了免疫原性，给予特定动物的免疫原的量就可根据本领域已知的标准程序来优化(Harlow & Lane，1988，Arnon，1987)。
在一个较佳的实例中，免疫原可包括“隐藏抗原”，该抗原由寄生虫产生，它在寄生虫上或体内的解剖学位置是在动物(包括人)寄生虫的典型环境下，动物的免疫系统不能直接到达该抗原(例如表达在寄生虫肠细胞上的蛋白)。但如果动物被寄生虫“隐藏抗原”的免疫原有效攻击，就可在动物体内诱导出细胞和/或体液免疫应答，该应答对免疫原有治疗或保护作用，从而可抗寄生虫。例如，如果来自寄生虫肠细胞的抗原适当地提呈给动物并诱导体液和/或细胞免疫应答，则具有该抗原的寄生虫随后的摄食可能引起促进寄生虫的死亡，其机制是通过直接对寄生虫的细胞毒性效应或由于抗体结合而干扰了寄生虫肠道营养物的吸收、或这两种机制的结合。
另外，在一个较佳的实例中，本发明的免疫原或抗原可与不同种类寄生虫的免疫原或抗原交叉反应；即，这些抗原或免疫原是不同种类寄生虫之间“共有”的。这些共同的抗原或免疫原可根据本领域中鉴别交叉反应性抗原的标准血清学方案来鉴别与其它种寄生虫抗原或免疫原有无免疫学交叉反应。用于这些交叉反应研究的抗体可根据本文所述的方法来生产。可选择抗原，根据分子量的相似性、Con-A结合亲和力、酶活性等，用本文提供的方法来测定它们的免疫学交叉反应能力。
免疫原的给药方式可根据动物的种类、大小和状态而不同。本发明的治疗性或预防性免疫原通常是肠胃外给药，可以是皮下注射或肌内注射。当然，免疫原性量可以分开的剂量给予，或给予动物的多个部位。例如，免疫原可以单剂给予，或间隔不同时间(例如间隔1、2或4周)给予两剂。需要时，还可在不同间隔(例如两周间隔)时加强免疫，以维持所需的治疗或预防效果。免疫还可以“细流接种”方式给予对象，例如，每隔一天通过皮下或肌内给予对象50-100μg免疫原，时间为14-30天。
肠胃外给药的特征通常是注射。可注射物可以制成常规的形式，或是液体溶液或悬液(在注射前适合溶解或悬浮在液体中的固体形式)、或是乳剂。最近关于肠胃外给药的修改方法涉及使用缓慢释放或持续释放的系统，这样就可维持恒定的免疫原水平。例如参见，美国专利No.3,710,795。
动物可以是可能或已经需要治疗或预防寄生虫的任何动物。典型的动物可选自，例如，人、牛、马、猪、山羊、绵羊、犬、猫和禽类。相应地，动物可以是需要控制寄生虫场所的野生动物，例如，在有野生动物的动物园中和/或在寄生虫会从野生动物传播给家畜或人的场所。
本发明还提供了治疗或预防动物寄生虫的方法，该方法包括给予动物本发明的抗体。相应地，本发明提供了一种治疗或预防动物寄生虫的方法，该方法包括将本发明的抗体的抗独特型抗体给予动物。具体地说，从本发明的寄生虫细胞群收获全细胞或抗原组分，随后根据本文提供的方法进行纯化。这些抗原可用根据生产抗体分泌型杂交瘤的熟知程序来生产单克隆抗体和多克隆抗体，后者是用抗原来免疫动物(例如小鼠、家兔)，用熟知的程序(如亲和层析)纯化从动物血清获得的抗体。然后这些抗体可用作第二抗原的来源，根据本文所述的相同程序来生产抗独特型抗体。
本发明还提供了筛选具有抗蠕虫活性的化合物的方法，该方法包括使化合物与本发明的细胞接触，并测定化合物是否对细胞有有害的影响。成功筛选化合物的唯一要求是确定均质的寄生虫细胞培养物存活的细胞数，这样就能确定受化合物影响的细胞数目。因此，组合物还可包括并非来自均质的寄生虫细胞群的细胞。本文所用的术语“有害的影响”可包括可发现的、已知在生理上并非组织培养中正常细胞典型的任何影响，例如病理性(例如，致细胞病变、形成合胞体、生化功能改变、不能产生或表达抗原、与组织培养底物附着或不附着、细胞变圆或变平、细胞单层的破坏、细胞异常聚集、呈多层生长、异常细胞包涵体等)的寄生虫细胞的状态或外观上的改变或寄生虫细胞死亡。
在筛选方法中，化合物可以是抗体或其它分子，包括合成的、有机或天然产生的分子(Baron等，1989；DeClercq，1989)。这些有机分子可以具有在体外或体内抑制寄生虫的活性定点性质。另外，根据本发明的方法，可以鉴别和筛选出干扰寄生虫生命周期任何阶段的分子。
化合物可这样来筛选，使各种浓度的感兴趣的化合物与本发明的细胞接触。浓度可以根据经验来选择，或能从本领域中关于该化合物在其它用途中的使用情况的知识来选自。如果将化合物加入组织培养环境中的细胞内，则还可根据本领域的标准程序来评价例如pH、温度和辅助化合物这些参数，以测定它们对于所研究化合物在细胞内产生有害作用的效率的影响。在化合物与细胞接触适当时间后，就可检测细胞的这些有害影响(如致细胞病变、细胞死亡等)。然后，可在寄生虫全虫中测试显示出对本发明细胞有有害影响的那些化合物是否对于生物体整体有有害影响，或将那些化合物给予测试动物以测试化合物治疗或预防动物寄生虫的能力。
本发明还提供了检测动物体内有无寄生虫存在的方法，该方法包括使本发明的寄生虫细胞或从该细胞衍生出的、含有寄生虫抗原的组分与含有抗体的动物样品接触，并检测样品中的抗体是否与细胞或组分中的抗原结合，结合存在则表明动物体内存在寄生虫。
熟知的检测方法(例如免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹)可以很方便地实现对寄生虫抗原或抗体特异性相互反应的检测。用于本文所述的检测方法的具体试剂和步骤以及类似的免疫试验可根据标准指标选自本领域已有的那些试验(Harlow和Lane，1988)。
检测抗体与寄生虫细胞和细胞组分特异性反应的方法的一个例子可以这样来进行，使来自对象的含抗体样品与一定量的本发明的寄生虫细胞或细胞组分接触，然后检测抗体与寄生虫细胞的反应。本发明的抗体检测方法的一个具体实例是ELISA。简言之，使纯化的寄生虫细胞或细胞裂解物与基质(如膜、玻珠、平板)结合；用合适的封闭剂封闭非特异性的蛋白，然后与来自对象的样品接触，以使抗体被寄生虫抗原捕获。然后加入与被抗原捕获的抗体结合的第二抗体。该第二抗体可包括能产生有色反应产物的酶部分，通过加入合适的酶底物并观察和/或测定有色反应产物，就可检测该产物。
本发明还提供了一种检测动物体内寄生虫存在与否的方法，该方法包括使本发明的抗体与可能含有寄生虫抗原的动物样品接触，然后检测抗体与寄生虫抗原的结合是否存在，结合存在就表明动物体内有寄生虫。
检测寄生虫抗原的方法的一个例子是，使对象的体液或组织样品与一定量的本发明的纯化抗体接触，并检测抗体与寄生虫抗原的反应。本发明的抗原检测方法的具体实例可以是ELISA。简言之，使抗体与基质(如膜、玻珠、平板)结合；用合适的封闭剂封闭非特异性的蛋白，然后与来自对象的样品接触，以使抗体捕获寄生虫抗原。然后加入第二抗体，该抗体与抗体所捕获的抗原结合。该第二抗体可包括能产生有色反应产物的酶部分，通过加入合适的酶底物并观察和/或测定有色反应产物，就可检测该产物。
如本文所考虑的，抗体可包括与寄生虫抗原结合的任何配体，例如完整的抗体、抗体片段或与寄生虫抗原反应的其它任何试剂或化合物。本方法的对象样品可包含任何可含有寄生虫抗原的组织或体液或含寄生虫抗原的细胞，例如活检材料、血液、血浆、血清、唾液和尿。其它可能的体液例子包括痰、粘液、精液、胃液、关节液、腔液等。
另外，本发明还提供了一种体外培养寄生虫细胞群的方法，该方法包括在使寄生虫角质层分解和/或降解从而产生细胞芽的条件下，在寄生虫培养基(例如含抗生素的IPL-41培养基)中培养寄生虫；破坏培养物，使细胞芽从寄生虫角质层上断下；和在细胞培养基(例如含抗生素的IPL-41/SF900混合培养基，或单用含抗生素的SF900培养基)中培养寄生虫细胞芽。该方法还可包括在Percol密度梯度上纯化细胞芽、在PBS中清洗细胞和将细胞接种到细胞培养基中。细胞芽在Percol密度梯度上的纯化可在细胞芽已经开始在寄生虫角质层中和/或外表形成后不久进行，随后可从梯度上取出细胞芽并置于细胞培养基中。细胞芽在Percol密度梯度上的纯化还可在它们已从寄生虫培养基转移到细胞培养基中后进行。这些密度梯度纯化步骤的任一种或两种均可进行。在Percol密度梯度中还可形成一层，该层由仅仅形成部分细胞芽的寄生虫或还未形成细胞芽的寄生虫组成。可将这些寄生虫从梯度中取出并放回到寄生虫培养基中，使其形成细胞芽再收获进行培育。可重复该步骤，直至能形成细胞芽的所有寄生虫已经形成细胞芽。本发明的寄生虫培养方法还可包括将细胞芽从细胞培养基转移到新鲜细胞培养基中。
在该培养方法中，较佳的是在破裂步骤之前每个寄生虫平均产生至少两个外来细胞芽。另外，破裂宜温和，例如在锥形管中低速离心(200-400xg)，然后通过人工移液管来顺次吸打。另外较佳的是，降解可逐渐进行，例如，通过直接显微镜检查监测发现，寄生虫角质层的降解或分解可在两至三个星期内发生。然而，某些种类的寄生虫需要较短或较长的降解时间，这可通过直接显微镜检查来评价降解过程。
用来培养寄生虫(尤其是幼虫)的培养基可以是IPL-41培养基或组成类似的其它培养基，其中加入的抗生素浓度至少为50-100mg/ml。例如，寄生虫培养基可以是IPL-41培养基，其中加入了浓度至少约为50-100mg/ml的氨基糖苷抗生素(例如氨羟丁卡那霉素A)以及浓度至少约为50-100mg/ml的β内酰胺和/或头孢霉素抗生素(例如苯异甲恶唑青霉素)。培养基中还可加入抗霉菌剂(例如约50μg/ml的两性霉素)。寄生虫培养基还可含有酵母抽提物作为非血清蛋白源。
细胞培养基可以是IPL-41、SF900、IPL-41和SF900以任何比例的混合物，或组成类似的其它培养基，培养基中加入的抗生素浓度至少为2.5mg/ml。例如，细胞培养基可以是SF900培养基，其中加入了浓度约为2.5mg/ml的氨羟丁卡那霉素A和浓度约为5.0mg/ml的苯异甲恶唑青霉素。培养基中还可加入抗真菌剂(例如约50μg/ml的两性霉素)。寄生虫培养基还可含有酵母抽提物作为非血清蛋白源。
含有本发明细胞的组织培养瓶中可装入高达总体积容量33-80％的培养基。培养瓶可以密封，并在添加培养基(即每隔大约一周)时手工振摇(通气)。
本发明的方法还可包括根据本领域中已知的器官解剖程序从L1-L5期任一期幼虫中解剖出器官，并在允许产生细胞芽的条件下将解剖获得的器官置于培养基(例如含抗生素的IPL-41培养基)中；破坏培养物，使细胞芽从解剖获得的器官上断下；和在细胞培养基(例如含抗生素的IPL-41/SF900混合培养基，或是含抗生素的SF900培养基)中培养寄生虫细胞芽。本文所述的适用于从培育的寄生虫的均质寄生虫细胞群的相同考虑、改进和其它步骤同样适用于解剖的器官。
本发明的均质细胞群的存活率可用本领域中熟知的活体染色方法来测定，例如在下文实施例中所述的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基-溴化四唑；Sigma)染色方法(Coyne等，1993(a)；Coyne等，1993(b))。均质寄生虫细胞群的细胞类型可用本领域熟知的各种方法来鉴别。例如，可用显微镜来查看培养中的细胞，从形态学上确定群体中的所有细胞是否是同一类型。细胞类型还可通过测定或检测细胞特异性标记物(如膜抗原或酶)的表达来进一步鉴定。细胞表面抗原的表达可用本领域熟知的的各种免疫细胞化学程序(例如免疫荧光术、流式细胞计数(荧光激活细胞分拣)、免疫染色、免疫印迹等)来检测。细胞类型还可通过采用酶特异性底物对细胞特异性酶作生化测定和通过电子显微镜来鉴定。聚合酶链反应(PCR)方法也可通过检测细胞特异性核酸的存在来鉴定细胞类型。在下文提供的实施例中，可以找到怎样鉴定本发明的寄生虫细胞群的细胞类型的具体实施例。
本发明还考虑可通过各种机制来增强寄生虫细胞群与组织培养瓶表面附着的方法，这些方法包括(但不局限于)避免瓶内细胞含量的破坏、用瓶塞密封组织培养瓶、添加含液体抽提物的组织生长培养基、在组织培养环境下37℃持续培育和/或每周内不断添加生长培养基。这些方法的潜在用途包括用附着的寄生虫细胞群作为生物学工具来筛选新的和常规的药物制剂(如抗蠕虫药)的效率。
本发明还提供了一群寄生虫细胞，该细胞不包括蚊虫细胞，能在体外长时间培养，其生产方法是在使寄生虫角质层分解和/或降解从而产生细胞芽的条件下，在寄生虫培养基(例如，含抗生素的IPL-4培养基)中培养寄生虫；破坏培养物，使细胞芽从寄生虫角质层上断下；和在细胞培养基(例如，含抗生素的IPL-41/SF900混合培养基，或单用含抗生素的SF900培养基)中培养寄生虫细胞芽。该方法产生的寄生虫细胞群可以是均质的寄生虫细胞群(其中寄生虫细胞基本上是本文确定的一种细胞类型)或异质的寄生虫细胞群(其中寄生虫细胞基本上不是一种细胞类型)。该方法产生的细胞群可以是任何类型的寄生虫细胞，最好是寄生虫肠细胞。这些细胞可在本文所述的所有的相同条件下裂解、分级和/或提供在药学上可接受的载体中。另外，这些细胞的抗原可以如本文所述的那样分离和纯化，并如本文所述那样用作疫苗制剂中的免疫原和用来生产抗体和抗独特型抗体。这些细胞的蛋白的氨基酸和核酸序列可如本文所述那样进行测定，这些细胞的蛋白的基因可克隆到合适的表达系统中并表达。
用本文所述方法从中获得细胞群的寄生虫可以是上述任何寄生虫，较佳的是线虫，更佳的是选自古柏属(Cooperia)，结节属(Oesophagostomum)，胃线虫属(Ostertagia)，血矛属(Heamonchus)，恶丝属(Dirofilaria)和网尾属(Dictyocaulus)。
最后，在一个特定的实例中，本发明提供了一群能在体外长时间培育的、分化的线虫细胞。本文所用的术语“分化的”指细胞来源于发育的寄生虫(例如L1-L5期的幼虫和/或成虫)的器官/组织系统，它通过测定已知仅幼虫和成虫才表达的抗原和/或酶活性的表达来确定。这些抗原和/或酶活性的表达可根据本文实施例中提供的程序来检测。
线虫细胞群可以是均质的线虫细胞群(其中线虫细胞基本上为本文确定的一种细胞类型)、或异质的线虫细胞群(其中线虫细胞基本上不是一种细胞类型)。该方法产生的线虫细胞群可以是任何类型的线虫细胞，最好是线虫肠细胞。这些细胞可在本文所述的所有相同条件下裂解、分级和/或提供在药学上可接受的载体中。另外，这些细胞的抗原可以如本文所述的那样分离和纯化，并如本文所述那样用作疫苗制剂中的免疫原和用来生产抗体和抗独特型抗体。此外，这些细胞的蛋白的氨基酸和核酸序列可如本文所述那样进行测定，这些细胞的蛋白的基因可克隆到合适的表达系统中并表达。
从中获得线虫细胞群的线虫可以是任何线虫，最佳的是线虫选自古柏属(Cooperia)，结节属(Oesophagostomum)，胃线虫属(Ostertagia)，血矛属(Heamonchus)，恶丝属(Dirofilaria)和网尾属(Dictyocaulus)。
在下列实施例中将更具体地描述本发明，这些实施例只是描述性的，因为本领域技术人员显然可在其中作各种改动和变化。
实施例寄生虫细胞群的制备、纯化和繁殖将古柏属、血矛属(例如捻转血矛线虫)、结节属、胃线虫属(例如胃线虫属胃线虫)、网尾属(例如胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparous))和恶丝属(例如犬恶丝虫)线虫的寄生L3阶段幼虫用作体外制备均质寄生虫细胞群的来源。选自L3期幼虫的根据是，在该发育阶段，寄生虫肠胃道的细胞较其它类型细胞占优势，因为此时幼虫的其它器官系统仍然非常不成熟。因此，从L3期幼虫的细胞芽获得的细胞是肠细胞的可能性大大增加。然而，在本发明中，可采用任何一期的寄生虫幼虫(例如L1、L2、L4、L5)作为原材料。
初步幼虫制备除去细菌和除去粪便植物残渣活的幼虫群体摄食宿主肠腔的细菌菌群和植物残渣作为营养物来源消化。出于这个原因，将活的幼虫制备物悬浮在添加了抗生素和抗真菌制剂(氨苄青霉素、苯异甲恶唑青霉素、两性霉素)的生理盐水中，4℃培育24-48小时，以便在组织培养程序前对制备物去污。用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH7.4)洗涤经抗生素处理过的幼虫，并在Percol密度梯度上(S.G.1.025，1.050，1.075，1.100)与粪便残渣分离。用移液管收获浓集在分层谱带中的幼虫群，用光学显微术确认它们的身份。然后将收获的幼虫悬浮在PBS中并低速离心(200xg)。用移液管吸取含有残余Percol密度梯度液的上清液并弃去。清洗幼虫除去所有Percol密度梯度液是必需的，因为它对组织培养基的配制有不利影响。按需重复Percol密度梯度的分离步骤，以获得没有污染性粪便植物物质、纯度渐增的、富含幼虫的制备物。通常，存在最少量的残渣，这些残渣单靠Percol密度梯度纯化是不能与幼虫分离的。幼虫制备物可通过采用低速(200-300xg)离心和/或重力沉降的差速离心来进一步纯化。
有效地分离粪便植物残渣和收获活的幼虫群体的另一种方法包括采用细孔金属筛分隔或多层布。在该步骤中，收集活泼迁移到细孔金属筛或布层另一侧的幼虫进行培养(Baerman technique；Ivens等，1978)。
在组织培养(体外)环境中繁殖寄生虫细胞群将已经除去细菌菌群和粪便植物物质污染并且除去残余Percol密度梯度液的幼虫接种到组织培养瓶中，培养瓶含有无血清生长培养基(例如Grace′s、IPL-41(古柏属、血矛属、结节属)、或SF-900(胃线虫属))，培养基中添加了氨羟丁卡那霉素A(50-100mg/ml)、苯异甲恶唑青霉素(50-100mg/ml)和两性霉素(50μg/ml)。在添加抗生素和抗真菌剂后，幼虫培养基的最终pH约为4.5，在5.9％CO2和润湿空气条件下。通过轻微搅拌使组织培养瓶周期性地通气。37℃培育幼虫培养物14至21天，在此期间，幼虫的角质层逐渐退化，并且可观察到细胞穿过个别幼虫角质层中的缺陷而突起(细胞“发芽”)。培养基的抗生素浓度和pH水平似乎直接影响该过程的进展程度以及该过程进展的速度。
已经证明，与受评价的其它配方相比，用IPL-41组织培养基有最优的细胞“发芽”。这一改良的组织培养基的相对较低的pH可能模拟了许多幼虫群体已经适应了的皱胃(abomasal)环境。细菌菌落可能潜在地促进了寄生虫细胞群(肠道细胞)在组织培养环境中的繁殖，这是由于完整的寄生虫将这些生物作为营养物来源来摄食。如果组织培养瓶被细菌生长过度“污染”，则在培养瓶中可加入额外的抗生素制剂。然后将生长培养基接种到MacConkey′s、Mueller-Hinton和血琼脂板上，筛拣生长培养基有无污染性细菌生长。
定时在倒置显微镜下观察培养瓶，以检测穿过幼虫角质层中缺陷的细胞“发芽”。当已出现“发芽”时，通过连续移液结合低速离心，使幼虫培养物温和破裂。该过程似乎轻轻地切下细胞“芽”，并使角质层稍稍崩溃。结果，寄生虫细胞从柱状角质层管腔内被“压出”或挤出。该方法允许平缓地收获可原位繁殖的寄生虫细胞而不会过度破坏。从角质层和其它非存活性残渣中进一步分离出活细胞可这样来进行将幼虫培养物置于Percol密度梯度液上，离心梯度液，以使细胞芽和其它物质分离，从梯度液中分离出细胞芽，在PBS中清洗细胞芽，再次将细胞芽接种到含有添加了氨羟丁卡那霉素A(2.5mg/ml)、苯异甲恶唑青霉素(5.0mg/ml)和两性霉素(50μg/ml)的细胞培养基(例如IL-41/SF900混合培养基或单用SF900培养基)中。
当将新鲜细胞培养基周期性地以固定间隔时间灌输到组织培养瓶中时，寄生虫细胞表现出最优的体外繁殖。因此，按需加入培养基，通常为大约1周间隔，这取决于肉眼直接观察和在倒置显微镜下检查所估计的繁殖水平。例如，开始时将细胞芽转移到75cm2组织培养瓶中，并加入大约15毫升细胞培养基。约隔1周后，加入少量新鲜培养基，振荡培养瓶通气。重复这一步骤直至培养基体积达到约50毫升，此时将细胞和培养基转移到250cm2组织培养瓶中，加入新鲜培养基使开始体积约为60毫升。约隔1周后加入培养基并振荡，直至培养基体积达到大约225毫升。然后将细胞和培养基转移到500cm2组织培养瓶中，相隔约1周时边振荡边加入新鲜的培养基，直至培养基体积达到约450毫升。此时，将细胞如本文所述那样分到多个培养瓶内。
一旦组织培养瓶的容量已经超过(通过培养基体积测得)且显微镜中观察到大量细胞沉淀在组织培养瓶底部时，通过无菌技术将细胞从瓶上“刮”下，再转移(传代)到更大的组织培养瓶或以50/50或33/33/33分到两个或三个烧瓶中。在任何一种“分置”情况下，每个组织培养瓶中均应加入额外的新鲜细胞培养基。已经发现，如果当寄生虫细胞在传代时，组织培养瓶中所有培养基均被新鲜的细胞培养基所代替(这在哺乳动物组织培养中是常见的)，寄生虫细胞会表现出繁殖和抗原表达延迟或终止。因此，当细胞在传代时，加入组织培养瓶中的新鲜细胞培养基的比例通常为33至50％“用过的(spent)”细胞培养基和67至50％的新鲜细胞培养基，但是，只要用过的培养基的百分数至少占10-15％，就可采用任何比例的用过培养基。
迟缓繁殖速度时的刺激寄生虫细胞有时呈现迟患生长和繁殖速度模式。在这些情况中，可采用几种程序来刺激细胞分裂和繁殖。已经建立的有效程序例子包括(a)低速离心，并将沉淀重悬在同一个“用过的”生长培养基中；(b)在液氮中冷冻保藏较短时间(例如至少48小时)，然后重新培养在新鲜的细胞培养基中；(c)将细胞从组织培养瓶表面无菌“刮下”(d)避免组织培养瓶暴露在环境空气下数天；(e)将组织培养瓶以对角线倾斜状放置；和(f)将松散的细胞沉淀接种到“用过的”培养基中然后进行低速(200-300xg)离心。
细胞裂解、分级和抗原样品制备200xg离心寄生虫细胞，形成细胞沉淀，弃去培养基，将细胞沉淀重悬于添加EDTA(2-5mM)和抑酶肽(3mg/ml)的0-4℃(冰浴)Triton X-100(1-5％)中。25℃培育细胞1小时并间以轻微振荡，然后500xg离心。收获所得上清抽提物。
过度加工寄生虫细胞沉淀会破坏它们的完整性并/或改变重要的抗原和/或酶活性组分的收获量。寄生虫细胞群的沉淀理想地应是一次4℃低速(如200xg)离心较短时间。收获寄生虫细胞群的离心程序应只进行一次。如果需要第二离心程序以将寄生虫细胞收集到单个集合沉淀中，则应收获所得的“第二”上清进行分析而不要弃去。这一预防措施的根据是，发现与膜结合的抗原(例如氨基肽酶-M)显然很容易从寄生虫细胞外表面上“沥滤(leach)”下来。
在离心过程中应当只用“用过的”或新鲜的细胞培养液来体外悬浮和收获寄生虫细胞。采用缓冲系统(例如PBS和Tris-HCl，传统认为它们在生理上对哺乳动物细胞群是温和的)看来会过度破坏和大量减少收获的细胞量。
细胞活力的确认和体外繁殖速度的评估。将等份(300μl)寄生虫细胞转移到48孔微量滴定板的各个孔中。在每个孔中加入60μl等份MTT(Sigma)活力染色剂，使平板在37℃润湿恒温箱中培育12小时。然后对微量滴定板离心，用移液管吸出所得上清液，用酸性异丙醇25℃脱色寄生虫细胞20分钟。用移液管将所得上清液转移到96孔微量滴定板中。用计算机-集成微量滴定板读数器读取每个孔的450nm吸光值。在不同时间下重复上述试验，以估计在组织培养环境下繁殖的寄生虫细胞的大致繁殖速度(倍增时间)。
在活细胞胞质溶胶中，MTT试剂被还原成藏青色甲(formazone)晶体，然后它在分光光度计测定450nm吸光度之前用酸性异丙醇溶解甲。哺乳动物细胞和细菌分别在大约3-4小时和15分钟内将MTT试剂还原成甲晶体。寄生虫细胞在8-12小时内将MTT试剂还原成胞内甲晶体。
体外细胞群均质性的验证在倒置显微镜下检查寄生虫细胞群并从形态进行评价，以确定细胞群的均质性。检查细胞的形状和大小是否均一性、细胞中是否出现细颗粒，培养瓶中是否有不同大小的聚集物或团块存在。发现本发明的寄生虫细胞均有均一的大小和形状，所有细胞都含有细颗粒，所有观察细胞的外观相似。因此，根据本发明细胞的形态特征的这些观察结果，看来所有细胞均是-种细胞类型，这就证明了培养的寄生虫细胞由均质的细胞群组成。
活力的确认和繁殖速度的评估如下所述，用MTT活力染色剂测定本文所述的体外繁殖的胃线虫属和血矛线虫属细胞的增殖速度胃线虫属 瓶16天内增加8.9倍瓶214天内增加3.5倍血矛线虫属瓶16天内增加1.5倍瓶2增加1.49倍瓶3增加1.90倍这些数据表明本发明的寄生虫细胞是存活的，并且能在本文所述的培养条件下增殖。
用SDS-PAGE分析表面膜抗原用非变性SDS-PAGE(10％丙烯酰胺，20伏恒压，4℃)按照标准技术(Laemmli，1970)分析“用过的”生长培养基和TritonX-100(1-5％)洗涤剂溶解的寄生虫细胞抽提物样品。按照标准方法对凝胶进行银染，以鉴定均质细胞群的寄生虫细胞所产生的膜结合抗原。
SDS-PAGE分析下面显示了体外繁殖的寄生虫细胞群所表达的膜结合抗原表观分子量的评估结果(用kDa表示)。MW(kDA) 12 14 18 20 29 32 40 50 60 70 80寄生虫胃线虫属 M H L L L H M HM - -血矛属 M M M M - H M HM M H结节属 H - M - - - - H- L -古柏属 M M L L H L L LH M HH＝与同一泳道(样品)中鉴别出的其它蛋白组分相比，表达水平高M＝与同一泳道(样品)中鉴别出的其它蛋白组分相比，表达水平中等L＝与同一泳道(样品)中鉴别出的其它蛋白组分相比，表达水平低本发明的寄生虫细胞表达的其它膜结合抗原包括下列血矛属、古柏属 120kDa血矛属、古柏属、结节属 180kDa这些实验发现的作用是(a)部分鉴定了目前体外繁殖的细胞系的特征；(b)证明了长时间体外繁殖的寄生虫细胞群中膜结合抗原的表达损失相对最少；和(c)鉴定到可能是本文所述牛寄生虫四个属的每一属所表达的“共享”抗原的膜结合蛋白/糖蛋白。这些“共同”的膜结合抗原可提供一种方式在受攻击宿主体内诱导对这些寄生虫的“交叉反应”保护性免疫力。
Western印迹分析微丝虫膜结合抗原用去污剂(例如Triton X-100，Thesit)进行抽提，从微丝虫细胞群中收获膜结合抗原。根据分子量用SDS-PAGE分离组分中的蛋白。根据标准印迹程序(Harlow和Lane，1988；BioRad目录和手册)将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。将针对犬恶丝虫(Dirofilaria immitus)成虫表达的抗原的单克隆抗体(目录号# DFI 023-40470；Capricorn Products，Inc.，Scarborough，ME)加入硝酸纤维素膜中。然后，在膜上加入与辣根过氧化物酶(HRPO)(PierceChemicals)偶联的抗小鼠第二抗体，并在膜上加入H2O2，以产生可检测的颜色反应。
SDS-PAGE Western印迹分析针对犬恶丝虫(Dirofilaria immitus)成虫表达的抗原的单克隆抗体表现出对微丝虫细胞群溶解的含膜结合抗原组分有结合亲合力。这些实验发现表明，从微丝虫幼虫培养出的细胞已在组织培养环境中成功繁殖，且培养的细胞是能继续表达被单克隆抗体结合的抗原的微丝虫细胞。
用明胶SDS-PAGE检测蛋白水解酶组分用非变性(非还原性)明胶SDS-PAGE(0.1％明胶，10％丙烯酰胺，20伏恒压，4℃)(McKerrow等，1990；Gambel等，1996)分析“用过的”生长培养基和寄生虫细胞的Triton X-100抽提物样品有无蛋白水解酶活性。用Triton X-100(2.5％)液清洗凝胶(3次，每次20分钟)，并在添加了CaCl2(1mM)的Tris-HCl(0.1M，pH7.0)中37℃培育24-48小时。用考马斯亮蓝450(0.1％)(Sigma)对明胶SDS-PAGE胶25℃染色3小时，然后甲醇-乙酸(35∶10 v/v)(用水配制)中脱色。
当针对明胶SDS-PAGE背景的透明区域被考马斯亮蓝450阳性染色(使明胶基质的酶促降解明显)时，就检测到有蛋白水解酶活性。在胃线虫细胞中，在大约分子量大于200kDa、116-150kDa、63-75kDa和45kDa的各蛋白组分中检测到有蛋白水解酶活性。位于116-150kDa以及63-75kDa之间的蛋白水解组分看上去非常稀薄。在捻转血矛线虫细胞中，在分子量约为30kDa的蛋白组分中检测到蛋白水解酶活性。这些结果与已知的寄生虫幼虫全虫的明胶SDS-PAGE图形相符，这证明了本发明的胃线虫属和血矛属细胞是幼虫细胞，且培养中的细胞正在产生蛋白水解酶。
测定氨基肽酶-M蛋白水解活性的试验氨基肽酶-M是寄生虫肠细胞内产生的一种酶(McMichael-Phillips等，1995)，因此，对氨基肽酶M活性进行试验以进一步鉴定均质寄生虫细胞群的细胞类型。在加工用来测定氨基肽酶-M活性的寄生虫细胞群时要采取预防措施，因为该酶似乎会在加工时“沥滤”出外膜。
将用过的培养基、清洗过的全细胞和机械破碎的全细胞或细胞沉淀的TritonX-100抽提物的实验样品(50μl)与MOPS缓冲液(50mM，pH7.0，100μl)合并，并在96孔微量滴定板中25℃培育15分钟，以使酶在该缓冲液中平衡。培育期末，在各个孔中加入酶特异性底物试剂亮氨酸-对硝基酰苯胺(paranitroanalide)(pNA)和甲硫氨酸-pNA(2mM，100μl)。在润湿恒温箱中37℃培育滴定板不同时间(0-48小时)，通过测定蛋白水解释放的pNA(检测405nm分光光度计吸光度)以确定氨基肽酶-M的存在。另外，在微滤装置(Amicon，Inc.，Beverly，MA)中对用过的培养基和Triton X-100样品进行分子量分级，并如上所述那样进行制备。阴性对照包括在含有实验样品、缓冲液和酶底物的孔中加入金属(锌)螯合剂、1，10菲咯啉(10mM，4μl)，因为氨基肽酶被归类为锌金属蛋白酶。阳性对照包括猪的氨基肽酶-M(Sigma，St Louis，MO)、缓冲液和酶底物。
氨基肽酶-M的表达。氨基肽酶M的分光光度计测定结果表明，该酶活性存在于本发明胃线虫和捻转血矛线虫、结节属、犬恶丝虫和古柏属寄生虫细胞群的全细胞制备物中，“用过的”培养基样品和洗涤剂溶解的膜结合抗原组分中。在测定前先根据分子量对样品分级的实验结果表明，氨基肽酶活性存在于分子量约为45-50kDa和大于100kDa的组分中。在金属螯合剂1，10菲咯啉的存在下，任何实验样品中均没有检测到氨基肽酶-M活性。
这些数据表明，本发明的胃线虫属和血矛属细胞是肠细胞，根据是这些细胞表达了具有氨基肽酶-M活性的蛋白，且表达这一活性的蛋白的分子量与从寄生虫肠细胞中抽提出的已知表达氨基肽酶-M活性的蛋白类似(McMichael-Phillips等，1995)。
测定磷酸化酶活性的试验除了氨基肽酶-M外，测定已知在寄生虫肠细胞内产生的另一种酶—磷酸化酶(磷酸水解酶)(Gambel等，1980；Knowles和Oakes，1979；Gambel & Mansfield，1996；Gambel等，1996；Barrett，1981)，以进一步鉴定均质细胞群的细胞是否是寄生虫肠细胞。为了检测本发明寄生虫细胞中的磷酸化酶活性，进行上述检测氨基肽酶-M活性的程序，只是用磷酸化酶的特异性底物对硝基苯基磷酸代替氨基肽酶-M的底物。通过测定405nm吸光度来检测黄色(表示从底物中酶促释放出发色物质)的产生，来确定具有磷酸化酶活性的实验样品。阴性对照含有酒石酸(1mM)作为磷酸化酶抑制剂。
磷酸化酶的表达检测培养的胃线虫、胎生网尾线虫、捻转血矛线虫、古柏属、结节属和犬恶丝虫细胞实验样品中的磷酸化酶活性。由于已知该酶由寄生虫肠细胞表达，因此这些数据进一步证实了本发明的寄生虫细胞是肠细胞。
其它酶标记的测定根据上述程序进一步测定非肠细胞类型的寄生虫细胞中产生的酶，以进一步对本发明的培养的寄生虫细胞特性作分析。例如，在第四期幼虫的排泄-分泌产物中都检测到磷脂酶C、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶C、二肽肽酶和N-乙酰葡糖胺酶(Gamble和Mansfield，1996)，而在寄生虫肠细胞中没有检测到。用于筛选的其它酶以及所用的特异性底物如下酶标志 酶特异性底物磷脂酶-C 对硝基苯基磷酸胆碱胰凝乳蛋白酶 琥珀酰-苯丙氨酸对硝基酰苯胺组织蛋白酶C甘氨酸-苯丙氨酸对硝基酰苯胺二肽肽酶IV 甘氨酸-脯氨酸对硝基酰苯胺N-乙酰-β-D-葡糖胺酶 对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-葡糖酰胺(glucosamide)其它寄生虫细胞酶标志的表达的检测用上述各自酶特异性底物测定本发明的胃线虫属和血矛属细胞的磷脂酶C、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶C、二肽肽酶和N-乙酰葡糖胺酶的表达，所有均产生阴性结果。这些结果进一步证实了本发明的胃线虫属和血矛属寄生虫细胞是肠细胞，其根据是没有细胞表现出任何磷脂酶C、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶C、二肽肽酶或N-乙酰葡糖胺酶活性，这与肠细胞中预计的结果以及这些细胞中检测到的氨基肽酶-M和磷酸化酶活性与排泄-分泌产物无关的结果相符。这些数据还表明本发明的细胞群不含表达这些酶的细胞类型，这进一步证明了本发明的细胞群是均质的。
与伴刀豆球蛋白A外源凝集素的配体结合分析用96孔斑点印迹装置结合负压力(BioRad)，将“用过的”组织培养液和Triton X-100洗涤剂溶解的抽提物的试验样品施加到硝酸纤维素膜上。使硝酸纤维素膜在含牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶的封闭缓冲液(Tris 100mM配，pH7.4)中25℃培养2小时，以最大程度地减少非特异性结合。以Tris-HCl(50mM，pH7.0)液清洗硝酸纤维素膜(3次，每次20分钟)。在硝酸纤维素膜上加入生物素化的伴刀豆球蛋白A(Con-A；10μg/ml)(EYLabs)，25℃放置90分钟。用Tris-HCl(50mM，pH7.0)清洗除去残余的生物素化的Con-A(3次，每次20分钟)。将Tris-HCl(50nM，pH7.0)配的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(链霉亲和素-HRPO；从0.5mg/ml原液配成2μl/ml)(Pierce Chemical Co.)加到硝酸纤维素膜上，25℃放置90分钟。再次用Tris-HCl清洗膜(3次，每次20分钟)，最后加入H2O2(2μl/ml的30％溶液)(作为辣根过氧化物酶的酶活性催化剂)，产生可检测的反应。
外源凝集素(生物素化Con-A)斑点印迹分析通过硝酸纤维素膜上产生的可见反应产物来检测用过的培养液和Triton X-100组分的试验样品与Con-A的结合。这些试验的结果证明，“用过的”生长培养基和体外繁殖的寄生虫细胞的TritonX-100洗涤剂抽提物中所含的蛋白均表现出对生物素化的Con-A试剂有明显的结合亲合力。
“用过的”生长培养液以及膜结合抗原的配体亲和凝胶抽提物将“用过的”生长培养基和膜结合抗原的试验样品施加到缓冲液A配的偶联有Con-A的Sepharose上，该缓冲液(pH5.2)由乙酸钠(5mM)、氯化锰(1mM)、氯化钙(1mM)、氯化钠(0.1mM)和叠氮钠(0.02％)组成。在用缓冲液A彻底清洗Sepharose Con-A凝胶后，用缓冲液B将结合蛋白组分从凝胶中替换出来(该缓冲液B(pH5.2)由甲基-α-D-吡喃葡糖苷(0.5M)和甲基-甘露糖苷(0.2M)组成)，随后收集到所得上清液中。然后用SDS-PAGE在还原条件下分析这些样品的各部分，以确定寄生虫细胞中Con-A结合蛋白的大约分子量。
此外，还根据上述程序测定了具有Con-A结合亲合力的蛋白组分有无氨基肽酶-M活性。
Con-A结合蛋白的SDS-PAGE胃线虫属胃线虫和捻转血矛线虫细胞中具有Con-A结合亲合力的蛋白的分子量大约为大于200kDa、100-116kDa、50-55kDa、40-45kDa和29-33kD。而且，显示出这些Con-A结合组分具有氨基肽酶-M活性。这些数据的含义是从寄生虫肠细胞收获的相似分子量的类似蛋白均具有氨基肽酶-M活性和Con-A结合亲合力(McMichael-Phillips等，1995)。
片形獐耳细辛属和片形吸虫细胞群的繁殖。本发明的方法还用来产生能在体外长时间培养的、源自片形獐耳细辛属和片形吸虫后囊蚴的细胞群。这些细胞群生长和维持在添加了牛胎牛血清(10％-20％v/v)或酵母蛋白抽提物的RPMI-1640生长培养基中。因此，本发明提供了一种能在体外长时间培养的片形獐耳细辛属均质细胞群以及一种能在体外长时间培养的片形吸虫均质细胞群。
尽管本方法已经参照某些实例的具体细节进行了描述，但是并不意味着这些细节应被认为是对本发明范围的限制，除非它们达到包括在所附权利要求范围内的程度。
在本申请中，引述了各种出版物。这些出版物的公开内容全部纳入本申请作为参考，以便更全面地描述本发明所属领域的状况。
参考文献1.Agbede RIS，Kemp DH.″用从成年雌性蜱获得的抽提物对牛免疫以抗微小牛蜱；以接种的牛为食的蜱的组织病理学″，International Journal of Parasitology1986；1635-41。
2.Alger NE，Cabrera EJ.″以经蚊抗原免疫的家兔为食的Anopheles stephensi的死亡率的增加″Journal of Economic Entomology 1972；65165-168。
3.Allen JR，Humphreys SJ.″豚鼠和牛的抗蜱免疫″Nature(London)1979；280491-4934.Baker NFRA，Fisk RB，Bushnell RB，Oliver MN.″加利福尼亚州中放牛的灌溉牧场季节性出现感染性线虫幼虫″Am J Vet Res 1981；421188-1191。
5.Bautista-Garfias CR，Flores-Hernadez O，Quiroz-Romero H.″用Freund完全佐剂对羊抗捻转血矛线虫的非特异性抵抗力″Parasite Immunology 1991；13565-569。
6.Boisvenus RJ，StiffMI，Tonkinson LV，Cox GN.″用捻转血矛线虫的角质层胶原蛋白和肽免疫接种的羊体内的保护性研究″Parasite Immunology1991；13227-240。
7.Borgsteede FHM.″采用胃线虫属胃线虫株对morantel酒石酸盐的抵抗力的进一步研究″International Journal of Parasitology 1988；18499-502。
8.Borgsteede FHM.″采用胃线虫属胃线虫株对morantel酒石酸盐的抵抗力的进一步研究″International Journal of Parasitology 1991；21867-870。
9.Bremner KC.″Haemonchus placei(Place)Ransom(线虫毛圆线虫科)的寄生生命周期″Australian Journal of Zoology 1957；4146-151。
10.Brunsdon RN.″蠕虫防治的原理″Veterinary Parasitology 1980；6185-215。
11.Canals A，Gasbarre LC.″胃线虫属胃线虫躯体和代谢抗原的分离和部分鉴定″International Journal for Parasitology 1990；201047-1054。
12.Craig TM.″得克萨斯海湾沿岸牛肠胃道线虫的季节性传递″J Am VetMed Assoc 1979；174844-847。
13.Craig TM.″抗蠕虫药抗药性″Veterinary Parasitology 1993；46121-131。
14.Cuquerella M，Gomez-Munoze MT，Alunda JM.″Manchego羊羔对捻转血矛线虫感染的血清IgG应答和成虫抗原的初步鉴定″Veterinary Parasitology 1991；38131-143。
15.Drudge JH，Leland SE，Wyant ZN.″羊线虫对酚噻嗪I作用的应答反映中的品系差异。关于捻转血矛线虫纯感染的研究″Am J Vet Res 1957；18317-325。
16.Durie PH.″牛的寄生性胃肠炎感染性圆线虫幼虫在牧场上分布和存活″Australian Journal of Agriculture 1961；121200-1211。
17.Durie PH.″牛的寄生性胃肠炎牛牧场上圆线虫幼虫群体的季节性波动以及它们在放牧动物感染中的重要性″Australian Journal of Agricultural Research1962；13767-777。
18.Eagleson JS，Bowie JY.″澳大利亚牛体内Trichostrongylus axei的奥芬达唑耐药性″Veterinary Record 1986；119604-612。
19.Fitzsimmons WM，Harness E.″试图通过血液灌输来替换由于Haemonchusplacei感染的血液损失″Veterinary Record 1969；8449-50。
20.Gasbarre LC.″对牛肠胃道线虫免疫力的基因控制″Veterinary Parasitology1990；37257-272。
21.Gasbarre LC，Leighton EA，Davies CJ.″宿主基因对于牛体内针对肠胃道线虫感染的抗体应答的影响″Veterinary Parasitology 1993；4681-9122.Geerts S，Brandt J，Kumar V，Biesemons L.″牛体内的胃线虫在牛体内对左旋咪唑怀疑有抗药性″Veterinary Parasitology 1987；2377-82。
23.Gennari SM，Vieira Bressan CR，Rogero JR，MacLean JM，Duncan JL.″牛体内Haemonchus placei感染的病理生理学″Veterinary Parasitology 1991；38163-172。
24.Gibbs HC，Herd RP.″牛体内的线虫病重要性、涉及的种类、免疫力和抵抗性″Verterinary Clinics of North AmericaFood Animal Practice 1986；2211-224。
25.Harness E，Fitzsimmons WM.″牛体内的实验型Haemonchus placei感染在感染三个水平上的血液图″Journal of Comparative Pathology 1970；80173-179。
26.Harness E，Sellwood SA，Young ER.″小牛体内的实验型Haemonchusplacei感染贫血以及幼虫数量对虫生长的影响″Journal of ComparativePathology 1971；81129-136。
27.Harness E，Smith K，Bland P.″牛线虫Haemonchus placei中的结构变化可能与宿主免疫应答有关″Parasitology 1973；66199-205。
28.Hawkins JA.″牛体内寄生虫控制的经济效益″Veterinary Parasitology1993；46159-173。
29.Heath AW，Arfsten A，Yamanaka M，Dryden MW.″针对猫跳蚤Ctenocephalides felis的疫苗接种″Parasite Immunology 1994；16187-191。
30.Jackson RA，Townsend KG，Pyke C，Lance DM.″牛体内有奥芬达唑抗药性的肿孔古柏线虫的分离″New Zealand Veterinary Journal 1987；35187-189。
31.Jasmer DP，McGuire TC.″寄生虫肠抗原诱导的对以血液为食的线虫(捻转血矛线虫)的保护性免疫力″Infection and Immunity 1991；594412-4417。
32.Jasmer DP，Perryman LE.″捻转血矛线虫的种系发育保守的肠表面抗原及其诱导保护性免疫力的效率″Proc 37th Annual AAVP Meeting 1992年8月2日-4日。
33.Johnston LAY，Kemp DH，Pearson RD.″用从成年雌性蜱获得的抽提物对牛免疫以抗微小牛蜱诱导的免疫力对蜱群体的作用″，International Journal ofParasitology 1986；1627-34。
34.Kelly JD，Hall CA.″动物蠕虫对抗蠕虫药的抗药性″Advances inPharmacology and Chemotherapy 1979；1689-128。
35.Kemp DH，Agbede RIS，Johnston LAY.″用从成年雌性蜱获得的抽提物对牛免疫以抗微小牛蜱吸食接种牛血的寄生虫的饲养和存活″，International Journalof Parasitology 1986；16115-120。
36.Kimaro EE，Opdebeech JP.″用从微小牛蜱的卵和肠抽提出的抽提物接种的牛的蜱侵袭″Veterinary Parasitology 1994；5261-70。
37.Krecek RC，Groeneveld HT，van Wyk JA.″时间、日期、季节和底层对灌溉牧场上捻转血矛线虫和Haemonchus placei第三期幼虫的影响″VeterinaryParasitology 1991；4087-98。
38.Lanusse CE，Prichard RK.″抗反刍动物蠕虫药的药物特性和临床效率之间的关系″Veterinary Parasitology 1993；49123-158。
39.Lee RP，Opdelbeeck JP.″用单克隆抗体从微小牛蜱肠中分离出保护性抗原″Immunology 1991；72121-126。
40.Leighton EA，Murrel kD，Gasbarre LC.″基因控制牛体内线虫释放卵速度的证据″Journay of Parasitology 1989；75498-504。
41.Levine ND.″天气、气候和反刍动物线虫幼虫的个体生态学″Advances inVeterinary Science 1963；8215-256。
42.Levine ND.″家畜和人的线虫寄生虫″Burgess Publishing Company 1980；第2版162-163。
43.Lyons ET，Tolliver SC，Drudge JH，Hemken RW.″左旋咪唑对牛奶场小牛体内皱胃线虫和肺蠕虫的效率初步测试表明对胃线虫属胃线虫的活性减少″AmJ Vet Res 1981；421228-1230。
44.Maizels RM，Kennedy MW，Meghi M.″寄生性线虫Toxocara canis的不同表面抗原和分泌抗原上有共同的糖类表位″Journal of Immunology 1987；139207-214。
45.Mayhew RL.″关于牛肠胃道寄生虫的研究V。对胃蠕虫的免疫力，注意潜伏期时间″Am J Hygiene 1941；33103-111。
46.McGowan MJ，Barker RW.″以经美洲花蜱(AcariIxodidae)抽提物免疫的牛血为食的蜱获得成功″J Med Entomol 1981；18328-332。
47.Miller JE.″美国中南到西南地区的母牛-小牛生产系统中的线虫寄生观察情况″Veterinary Parasitology 1993；46289-295。
48.Munn.EA.″抗捻转血矛线虫疫苗的开发″Parasitology Today 1993；9338-339。
49.Munn EA.″用从捻转血矛线虫成虫抽提出的蛋白组分对幼羊羔接种″Parasitology 1987；94385-397。
50.Munn EA.Smith TS，Graham M，Greenwood CA.″用成虫寄生虫的膜结合蛋白对Merino羊羔接种以抗血矛线虫病″Parasitology 1993；106-63-66。
51.Munn EA，Smith TS，Graham M，Travenor AS.″完整的膜蛋白在羊羔的抗捻转血矛线虫接种中的潜在价值″International Journal for Parasitology1993；23261-269。
52.Opdebeeck JP，Daly KE.″受侵袭和接种的Herford牛对牛蜱微小牛蜱的抗原的免疫应答″Veterinary Immunology and Immunopathology 1990；2599-108。
53.Opedbeeck JP，Wong JYM，Dobson C.″用通过免疫亲和层析从蜱幼虫和成虫纯化出的抗原保护Hereford牛以抵抗微小牛蜱″Immunology 1989；67388-393。
54.Opdebeeck JP，Wong JYM，Jackson LA.″用来自蜱中肠的可溶性膜结合抗原免疫和保护Hereford牛以抵抗微小牛蜱″Parasite Immunology 1988；10405-410。
55.Rand KN，Moore T，Sriskantha A，Spring K.″来自牛蜱微小牛蜱的保护性抗原的克隆和表达″Proceedings National Academy of Science USA 1989；869657-9661。
56.Roberts FHS.″小牛对胃蠕虫Haemonchus placei(Place，1893)Ransom，1911侵袭的反应″Australian Journal of Agriculture Research 1957；8740-767。
57.Ross JG.″血矛属感染牛产生的可检测抗体与血清球蛋白组分缔合″Nature 1961；1901019-1020。
58.Ross JG.″Nigerian zebu牛中蠕虫病的进一步观察血清学应答″BritishVeterinary Journal 1962；11866-70。
59.Ross JG.″感染牛的Haemonchus placei的幼虫阶段在免疫力中的作用″Journal of Helminthology 1963；37359-368。
60.Ross JG.″幼虫阶段的Haemonchus placei的免疫原性活性″Nature1963；1971221-1222。
61.Smith WD.″用捻转血矛线虫肠膜蛋白免疫的羊羔中的保护力″Researchin Veterinary Science 1993；5494-101。
62.Smith TS，Munn EA，Graham M.″作为抗捻转血矛线虫的保护性抗原的完整膜蛋白H11的纯化和评价″International Journal for Parasitology 1993；23271-280。
63.Smith WD，Smith SK.″评价用捻转血矛线虫的肠膜蛋白对羊免疫所提供的保护″Research in Veterinary Science 1993；551-9。
64.Smith WD，Smith SK，Murray JM.″用捻转血矛线虫完整膜组分的保护性的研究″Parasite Immunology 1994；16231-241。
65.Soulsby EJL.″驯化动物的蠕虫、节肢动物和原生动物″第7版，1982；WB Saunders233-235。
66.Stromberg BE，Corwin RM.″美国中西部的母牛-小牛生产系统中的胃线虫属胃线虫的兽疫学″Veterinary Parasitology 1993；46297-302。
67.Travernor AS，Smith TS，Langford CF.″Clun Forest羊对捻转血矛线虫的膜糖蛋白接种的免疫应答″Parasite Immunology 1992；14671-675。
68.Manousis T，Ellar D.In-Vitro Cell Development Biology 1990261105-1114。
69.Kurtti，TH，Ulrike G.Munderloh GG.等，J.Med Entomol 1988；25256-261。
70.Hobbs，DJ，Fryer，SE，Duimstra，Jr等，J.Parasitol.1993；79913-921。
71.Kurtti，TJ，Munderloh UG.1984.″蚊虫细胞培养″Advances in Cell Culture259-302页，第3版。
72.Munderloh，UG，Wang YLM，Chen C.Kurtti TJ，J.Parasitol 1994；80553-543。
73.Arnon，R.(编辑)Synthetic Vaccines I93-103，CRC Press Inc.，Boca Raton，Florida，1987。
74.Martin，E.W.，编辑，Remington′s Pharmaceutical Sciences，最新版，MackPublishing Co.，Easton，PA。
75.Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，1988。
76.Baron等，Microb.Pathog 7237-247，1989。
77.DeClercq，E.Antiviral Res.121-20，1989。
78.Miller，PS Bioteehnology 9358-366，1991。
79.Cowsert等，Antimicrob.Agents and Chemotherapy 37171-177，1993。
80.Laemmli，Nature，227680-685，1970。
81.McKerrow，J.H.，等，1990.Exp.Parasitol.70134-143。
82.Gamble H.R.等，1996.J.Parasitol.82197-202。
83.Gamble H.R.和Mansfield，L.S.，1996.J.Parasitol.62291-305。
84.Barret，J.″寄生虫蠕虫的生物化学″208页，McMillan Publishers，Ltd.，London，1981。
85.Coyne，C.等，1993(a).Am.J.Vet.Res.54845-855。
86.Coyne，C.等，1993(b).Am.J.Vet.Res.54305-314。
87.Travenor，A.S.，等，1992.Parasitology 14645-655。
88.Munn，E.A.等，1993.Parasitology 10663-66。
89.Gambel，H.R.等，1980.J.Parasitol.66434-438。
90.McMichael-Phillips等，1995.PCT申请WO 95/12671。
91.Ivens，V.R.，等，1978.″美国家养动物的主要寄生虫″，254-255页。伊利诺伊斯大学(Urbana)农业和兽医学院。
权利要求
1.一种均质的寄生虫细胞群，该细胞群不包括蚊虫细胞，能在体外长时间培养。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中寄生虫细胞是肠细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞，其中至少一部分细胞已经裂解。
4.一种组合物，它包含权利要求1-3任一所述的细胞。
5.根据权利要求4所述的组合物，它进一步还包含药学上可接受的载体。
6.一种从权利要求4所述的组合物获得的非细胞组分。
7.一种从权利要求1所述的细胞获得的细胞组分。
8.一种组合物，它包含权利要求7所述的组分和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求7所述的细胞组分，其中该组分基本上是膜结合抗原。
10.根据权利要求1所述的细胞，其中寄生虫是线虫。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中线虫选自古柏属，结节属，胃线虫属，血矛属，恶丝属和网尾属。
12.根据权利要求1所述的细胞，其中寄生虫选自片形獐耳细辛属和片形吸虫。
13.一种抗体，它与权利要求1所述的细胞特异性结合。
14.一种抗独特型抗体，它与权利要求13所述的抗体特异性结合。
15.一种抗体，它与权利要求7所述的组分特异性结合。
16.一种抗独特型抗体，它与权利要求15所述的抗体特异性结合。
17.一种治疗或预防动物寄生虫的方法，该方法包括给予动物免疫原性量的权利要求1所述的寄生虫细胞或从该细胞获得的组分，借此治疗或预防寄生虫牵连动物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中寄生虫细胞是肠细胞。
19.根据权利要求17所述的方法，其中寄生虫牵连动物是侵袭或感染动物。
20.根据权利要求17所述的方法，其中寄生虫牵连动物是摄取动物的血液或体液为食。
21.根据权利要求17所述的方法，其中寄生虫是线虫。
22.根据权利要求21所述的方法，其中线虫选自古柏属，结节属，胃线虫属，血矛属，恶丝属和网尾属。
23.根据权利要求17所述的方法，其中寄生虫选自片形獐耳细辛属和片形吸虫。
24.根据权利要求17所述的方法，其中动物选自人、牛、马、猪、山羊、绵羊、犬、猫和禽类。
25.一种治疗或预防动物寄生虫的方法，该方法包括给予动物权利要求13或15所述的抗体。
26.一种治疗或预防动物寄生虫的方法，该方法包括给予动物权利要求14或16所述的抗独特型抗体。
27.一种筛选有抗蠕虫药活性的化合物的方法，该方法包括使化合物与权利要求1所述的细胞接触，并测定化合物对细胞是否有有害的作用。
28.根据权利要求27所述的方法，其中细胞在一组合物中。
29.根据权利要求28所述的方法，其中组合物包含并非来自均质群的细胞。
30.根据权利要求27所述的方法，其中有害作用是细胞死亡。
31.一种检测动物体内存在寄生虫的方法，该方法包括使权利要求1所述的寄生虫细胞或从该细胞获得的组分与动物的含抗体样品接触，并检测样品中的抗体是否与细胞或组分结合，有结合就表示动物体内存在寄生虫。
32.一种检测动物体内存在寄生虫的方法，该方法包括使权利要求13或15任一所述的抗体与可能含有寄生虫抗原的动物样品接触，并检测抗体是否和抗原结合，有结合就表示动物体内存在寄生虫。
33.一种体外培养寄生虫细胞群的方法，该方法包括(a)在使寄生虫角质层分解和/或退化从而产生细胞芽的条件下，在寄生虫培养基中培养寄生虫；(b)破坏培养物，使细胞芽从角质层上断下；和(c)在细胞培养基中培养寄生虫细胞芽。
34.根据权利要求33所述的方法，该方法进一步还包括在Percol密度梯度上纯化寄生虫细胞，在磷酸缓冲盐溶液中清洗细胞和将细胞接种到细胞培养基中。
35.根据权利要求33所述的方法，其中寄生虫细胞是肠细胞。
36.根据权利要求33所述的方法，该方法进一步还包括在步骤(c)后将细胞芽从细胞培养基中转移到新鲜的细胞培养基中。
37.一种寄生虫细胞群，该细胞不包括蚊虫细胞，能在体外长时间培养，按权利要求33所述的方法产生。
38.根据权利要求37所述的细胞，其中寄生虫细胞是肠细胞。
39.根据权利要求37所述的细胞，其中至少一部分细胞已经裂解。
40.一种组合物，它包含权利要求37至39任一所述的细胞。
41.根据权利要求40所述的组合物，它进一步还包含药学上可接受的载体。
42.一种从权利要求40所述的组合物获得的基本上是非细胞组分。
43.一种从权利要求37所述的细胞获得的细胞组分。
44.一种组合物，它包含权利要求43所述的组分和药学上可接受的载体。
45.根据权利要求43所述的细胞组分，其中该组分基本上是膜结合抗原。
46.根据权利要求37所述的细胞，其中寄生虫是线虫。
47.根据权利要求46所述的细胞，其中线虫选自古柏属、结节属、胃线虫属、血矛属、恶丝属和网尾属。
48.根据权利要求37所述的细胞，其中寄生虫选自片形獐耳细辛属和片形吸虫。
49.一群能在体外长时间培养的分化的线虫细胞。
50.根据权利要求49所述的细胞，其中线虫细胞是肠细胞。
51.根据权利要求49所述的细胞，其中至少一部分细胞已经裂解。
52.一种组合物，它包含权利要求49至51任一所述的细胞。
53.根据权利要求52所述的组合物，它进一步还包含药学上可接受的载体。
54.一种从权利要求52所述的组合物获得的基本上是非细胞组分。
55.一种从权利要求49所述的细胞获得的细胞组分。
56.一种组合物，它包含权利要求55所述的组分和药学上可接受的载体。
57.根据权利要求55所述的细胞组分，其中该组分基本上是膜结合抗原。
58.根据权利要求49所述的细胞，其中线虫选自古柏属、结节属、胃线虫属、血矛属、恶丝属和网尾属。
全文摘要
本发明提供一种均质的寄生虫细胞群,其中细胞并非蚊虫细胞,能在体外长时间培养。还提供了来自该细胞的细胞和非细胞组分。还提供了治疗或预防动物寄生虫的方法,包括给予动物免疫原性量的本发明寄生虫细胞或从该细胞获得的组分,从而治疗或预防动物寄生虫。还提供了一种检测动物体内存在寄生虫的方法,该方法包括使本发明的寄生虫细胞或细胞组分或本发明的抗体与动物的合抗体样品或含抗原样品接触,并检测样品中的抗体是否与本发明的细胞或组分结合、或样品中的抗原是否与本发明的抗体结合,有结合就表示动物体内存在寄生虫。另外,本发明提供了一种体外培养寄生虫细胞群的方法,该方法包括在使寄生虫角质层分解和/或退化从而产生细胞芽的条件下,在寄生虫培养基中培养寄生虫;破坏培养物,使细胞芽从角质层上断下;和在细胞培养基中培养寄生虫细胞芽。最后还提供了一群能在体外长时间培养的分化的线虫细胞。
文档编号A61P33/00GK1251130SQ98803662
公开日2000年4月19日 申请日期1998年2月20日 优先权日1997年2月20日
发明者C·P·科因 申请人:密西西比州立大学