用于生物活性化合物施用的轭合物的制作方法

专利名称：用于生物活性化合物施用的轭合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗所需的化合物以特定方式稳定并靶向靶组织的方法领域。特别 地，本发明基于载脂蛋白A能够靶向治疗所需化合物至所有那些表面结合位点对所述蛋白 具有高亲和力的组织。
背景技术：
应用大分子作为活性组分的新治疗形式的发展，催生了开发稳定并靶向所述分子 至其合适细胞靶标的有效形式的需求。要求特异性靶向靶组织的治疗实例包括，基于特异 性生长因子的使用或基于在靶组织中取代缺失或缺陷基因的基因的使用的疗法。那些不基 于病毒载体的组织特异性系统常常为其低或无的细胞特异性的问题所困扰。已经描述了基于内含治疗性化合物的脂质囊泡靶向治疗性化合物至肝细胞的不 同系统，并且其通过存在对肝细胞膜具有亲和性的囊泡表面分子而具有靶向作用。例如，W007130873公开了通过在所述胶囊表面整合被肝细胞内的脱唾液酸糖蛋 白、透明质酸、N-乙酰基半乳糖胺或甘露糖受体所识别的化合物的方式，靶向微囊泡至肝细 胞的方法。W002086091描述了通过在所述纳米囊泡中整合乙型肝炎病毒外壳蛋白的方式 靶向纳米囊泡至肝细胞的方法。W0200473684描述了基于表面含有ApoA-I的磷脂盘状囊 泡靶向部分疏水性化合物至肝细胞的方法。Lou等(World J. Gastroenterol. ,2005,11 954-959)描述了基于HDL容纳疏水性化合物如胆固醇的能力，应用高密度脂蛋白(HDL)作 为载体，靶向亲脂性抗癌化合物至肝细胞性肝癌细胞的方法。最后，Kim等(MolecularTherapy, 2007,15 :1145-1152)描述了基于包含干扰RNA 且表面具有ApaA-I的脂质体的靶向干扰RNA至肝细胞的方法。然而，这些方法具有以下缺 点由于所述化合物存在于囊泡或人工膜内部与磷脂的疏水部分相接触，它们仅能允许运 载疏水性化合物。可选地，可通过使用所述化合物与那些可为肝脏特异性捕获的试剂轭合的方式运 载亲水性化合物。例如，Kramer 等(J. Biol. Chem. ,1992,267 =18598-18604)描述了通过 所述化合物与胆汁酸轭合的方式靶向治疗性化合物(细胞生长抑制剂苯丁酸氮芥以及脯 氨酰-4羟化酶I-硝基苯-2-氧杂-1，3-叠氮-β - α -丙氨酸-苯丙氨酸-5-羟脯氨酸 (oxaproline)-甘氨酸抑制剂)至肝细胞的方法。然而，这种轭合方式仅允许运载至肝脏， 其阻止了施用治疗所需化合物至其它组织的应用。W004082720描述了通过在由乙型肝炎病毒外壳蛋白形成的伪病毒颗粒中整合所 述化合物的方式靶向治疗活性化合物至肝细胞的方法。然而，这些载体存在的问题在于具 有缩短的血浆半衰期，其要求持续不断地给药或高剂量给药以达到持续不变的治疗性血浆 水平。此外，形成伪病毒颗粒的病毒蛋白产生体液免疫应答。W08702061A描述了通过使用由载脂蛋白B或E受体结合区与活性组分形成的融合 蛋白，靶向化合物至表达LDL受体的组织的方法。干扰素的短半衰期的问题已经被W007021494解决，其描述了由白蛋白和干扰素形成的融合蛋白。这些融合蛋白的血浆半衰期约为14天。因此，需要用于特异性靶向治疗性化合物至肝细胞的合适载体，并且使轭合物达 到长的血浆半衰期。发明概述在第一方面，本发明涉及一种轭合物，其包括(i)Apo A分子或其功能等价变体，以及(ii)治疗所需的化合物其中组分⑴和(ii)共价结合。在第二方面，本发明涉及一种多核苷酸或基因构建体，其包括编码根据本发明的 轭合物的多核苷酸，其中治疗所需的化合物(ii)是与组分(i)形成单链的多肽。在接下来的方面，本发明涉及包含根据本发明的多核苷酸或基因构建体的载体， 并涉及包含根据本发明的多核苷酸、基因构建体或载体的宿主细胞，或包含根据本发明轭 合物的纳米脂质体颗粒。在另一方面，本发明涉及根据本发明的轭合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主 细胞或纳米脂质体颗粒在药物中的应用。在另一方面，本发明涉及根据本发明的轭合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主 细胞或纳米脂质体颗粒在治疗肝脏疾病或与免疫系统相关疾病中的应用。在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括(a)第一组分，选自由以下物质构成的组中根据本发明的轭合物、多核苷酸、基 因构建体、载体、宿主细胞、纳米脂质体颗粒或药物制剂，其中组分(ii)是一种TGF-βΙ抑 制肽，以及(b)第二组分，选自由以下物质构成的组中免疫刺激性细胞因子、编码所述细胞 因子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、TGF-β 1抑制肽、细胞毒素剂或其组合。在另一方面，本发明涉及本发明的组合物在药物以及特别是癌症治疗中的应用。


图 LIFNa 表达的动力学。用表达 ApoAI (Apo)、IFNa (IFN)、Apo-IFN(AF)或 IFN-Apo (IA)的质粒高压注射(hydrodynamic injection)BALB/c 鼠。在 6 小时后、第 1 天、 第3天、第6天以及第9天，采血并通过ELISA分析血清中的IFNa水平。典型实验每组 4只动物，平均值以及平均值的标准误差如图所示。通过重复测量方差分析和Bonferroni 检验分析结果。质粒AF和IA诱导的IFN α在第1天和第3天的水平，与质粒IFN诱导的 IFNa水平存在显著性差异(ρ < 0. 001)。图2. IFN a 1的肝脏mRNA的定量RT-PCR。每天向三只BALB/c鼠高压注射每种质 粒。在第1天、第3天和第6天，处死动物并提取肝脏。纯化肝脏mRNA，用定量RT-PCR检 测IFNal基因。典型实验的平均值以及平均值的标准误差如图所示。通过重复测量方差 分析和Bonferroni检验分析结果。质粒IFN a 1、AF和IA诱导的mRNA水平之间没有显著
性差异。图3.体温和血清新蝶呤水平。对BALB/c鼠施用编码具有IFNa的构建体的质 粒。在第3天采血，通过ELISA测量血清新蝶呤(A)水平。同时分析体温(B)。两个独立实验(N = 6只小鼠)的平均值以及平均值的标准误差如图所示。通过重复测量方差分析和 Dunnett，s检验分析结果，将IFNa组和ApoAI对照组相比较。_p < 0. 0001。图4. IFNa 1诱导基因的肝脏mRNA的定量RT-PCR。用表达IFNa 1的构建体的质粒 高压注射BALB/c鼠。在第3天，处死动物并提取肝脏。纯化肝脏mRNA，并对2’-5’0AS(A)， USP18 (B)，ISG15(C)和IRFl (D)基因进行定量RT-PCR0两个独立实验(N = 6只小鼠)的 平均值以及平均值的标准误差如图所示。以重复测量方差分析和Durmett’ s检验分析结 果，将IFNa组和ApoAI对照组相比较。*p < 0. 05 ;_p < 0. 0001。图5.脾细胞数量及活化的增加。BALB/c鼠通过高压注射接受具有IFNa的不同 构建体，6天后处死小鼠并分离脾脏。分析脾细胞的数目㈧以及CD4+T细胞(B)、CD8+T 细胞(C)、B细胞(D)和NK细胞(E)上的早期活化标记CD69的表达。典型实验每组7只动 物，平均值以及平均值的标准误差如图所示。以重复测量方差分析和Durmett’ s检验分析 结果，将 IFNa 组和 ApoAI 对照组相比较。*p < 0. 05 ；**p < 0. 001 ；< 0. 0001。图6.在表达IFNa的构建体存在下由基因疫苗接种诱导的特异性裂解的上升。 通过高压注射表达β-半乳糖苷酶的质粒和共施用表达具有IFN α的不同构建体的质粒作 为佐剂来免疫BALB/c鼠。7天后，静脉内注射加载细胞毒素肽以及高浓度CFSE的靶细胞 和具有低浓度CFSE的对照细胞。M小时后，处死动物，分析靶细胞以及对照细胞的比例以 计算特异性裂解的百分数。每组的柱状图代表(A)以及每组3个动物的典型实验的平均值 和平均值的标准误差(B)如图所示。以重复测量方差分析和Durmett’ s检验分析结果，将 Apo-IFN 禾口 IFN-Apo 组与 IFNa 相比较。**p < 0. 001。图7.不同免疫系统细胞群中SR-BI的表达。分离BALB/c鼠脾脏中的脾细胞以抗 SR-BI抗体标记，并以抗体标记来区分CD4+T细胞(抗CD4) (A)、CD8+淋巴细胞(抗CD8)
(B)、NK细胞(抗CD49b) (C)、单核细胞/巨噬细胞(抗CDllb) (D)或树突细胞(抗CDllc)㈤。图8.抗肿瘤接种疫苗模型中的佐剂效果。每个处理组11-17只BALB/c鼠，用表 达ApoAI (Apo)、IFNa (IFN)、或IFN-Apo (IA)的质粒进行高压注射。M小时后，用在不完全 弗氏佐剂中的细胞毒素肽接种。9天后，皮下接种5X IO6的CD6细胞并随时间观察肿瘤的 发病。随时间推移的无瘤小鼠百分比如图所示。通过Log-rank检验比较实验组和对照组。 **p < 0. 01。图9.循环的白细胞和血小板的动力学。对BALB/c鼠施用编码具有IFNa的构建 体的质粒。在高压注射后的第1天从一个组抽血，在第3天从另一个组抽血，在第6天从最 后一组抽血。应用Zl Coulter粒子计数器，依据操作说明书量化白细胞(A)和血小板(B) 数目。两个独立实验(N = 4小鼠/每天以及每组)的平均值以及平均值的标准误差如图 所示。以重复测量方差分析和Durmett’ s检验分析结果，将IFN-Apo组与IFN相比较。**p < 0. 01。图10. IFNa可诱导的基因的脑mRNA的定量RT-PCR。给BALB/c小鼠高压注射具有 表达IFN α的构建体的质粒。在第1天，处死动物并提取大脑。纯化脑mRNA并对USP18 (A)、 ISG15(B)、2，-5，0AS(C)、Mxl(D)以及 IRFl (D)基因进行定量 RT-PCR。两个独立实验(N = 5 小鼠/每组)的平均值以及平均值的标准误差如图所示。以重复测量方差分析和Durmett's 检验分析结果，将IFN-Apo组与IFN相比较。*p < 0. 05 ；**p < 0. 01 ；***p < 0. 001。这是一个代表两个的实验。图11.循环高密度脂蛋白(HDLs)中融合蛋白的整合。施用编码具有IFNa的构 建体的质粒给BALB/c小鼠。M小时后，采血并从获得的血清中通过NaBr梯度差速离心提 取HDLs。通过干扰素生物测定，细胞病变效应保护测定来分析不同组的HDLs中IFN α的存 在(A)。在无HDLs (HDLs-)血清样品中以及含有HDLs (HDLs+)的部分，用免疫印迹确定载脂 蛋白AI的存在(B)0图12.施用含有IFN-Apo的HDLs的血液学效应。相当于10000IU IFN的含有 IFN-Apo 的 HDLs、10000IU 重组 IFN 或 PBS 被施用给 BALB/c 小鼠。3 天后，应用 Zl Coulter 粒子计数器，依据操作说明书量化白细胞(A)和血小板(B)数目。两个独立实验(N = 4-6 小鼠/每组)的平均值以及平均值的标准误差如图所示。以重复测量方差分析和Durmett's 检验分析结果，将IFN-Apo组与IFN相比较。< 0. 01 ;_p < 0· 001。图13. IL12诱导的IFNy诱导的上升。高压注射一个表达IL12的可被强力霉素诱 导的增强子调控的质粒，以及另一个表达对照构建体或具有TGF β抑制子ρ17(Α)或TGF β 抑制子ρ144(Β)之一的构建体的质粒。4天后，通过ELISA分析血清中IFNy的浓度。每 组3个动物的典型实验的平均值以及平均值的标准误差如图所示。以重复测量方差分析和 Dunnett' s检验分析结果，将实验组与对照组相比较。**p < 0. 001。图14.对抗CD6肿瘤发展的保护。以不完全弗氏佐剂中的细胞毒素肽AHl接种 BALB/c小鼠。7天后，高压注射表达TGFβ抑制子或以ApoA-I作为对照的构建体。再过7 天，皮下接种5Χ IO5的CD6细胞并随时间推移观察肿瘤的发病。随时间推移的无瘤小鼠 百分比如图所示。通过Log-rank检验比较实验组和对照组。*p < 0. 05 ；**p < 0. 001。图15.循环高密度脂蛋白(HDLs)中Ap0-连接子-P144融合蛋白的整合。对BALB/ c小鼠施用编码具有Apo或Apo-连接子-P144的构建体的质粒。M小时后，采血并从所获 得的血清中通过NaBr梯度差速离心提取HDLs。在含有HDLs的部分，以免疫印迹确定载脂 蛋白AI的存在。图16.在施用含有Apo-连接子-P144的HDLs后由IL12诱导的FNy诱导的上 升。高压注射一个表达IL12的可被强力霉素诱导的增强子调控的质粒，以及一个表达对照 构建体(Apo)或Apo-连接子-P144的质粒。最后一组施用IL12质粒并腹腔注射14yg/每 只小鼠的含有Apo-连接子-P144的HDLs。4天后，通过ELISA检测血清中IFN γ的浓度。 每组3个动物的典型实验的平均值以及平均值的标准误差如图所示。以重复测量方差分析 和Durmett ’ s检验分析结果，将实验组与对照组相比较。**p < 0. 01。发明详述1.本发明的轭合物本发明的作者观察到，由Apo A蛋白或其功能等价变体与治疗所需分子的轭合物 在施用给患者后，显示出比给患者施用未轭合的治疗所需分子更大的血清半衰期。此外， Apo A与治疗所需分子的轭合物被特异性运载至患者肝脏，其极大地促进了肝脏疾病治疗 并减少了治疗性分子在其它组织中产生的副作用。因此，在第一个方面，本发明涉及一种轭合物，其包括(i)Apo A分子或其功能等价变体，以及(ii)治疗所需的化合物
其中组分(i)和(ii)共价轭合。不受任何理论限制，据认为，用于肝脏组织的轭合物的亲和力，是基于该事实即所 述组织具有Apo A蛋白的特异性受体，其拥有捕获表面具有ApoA-I的HDLs的天然功能。另 外，轭合物半衰期的延长看起来与Apo A分子在有机体中所显示的长半衰期相关(在Apo A-I的情况下，在人体大约为35小时或在小鼠体内为10小时)。此外，还存在表面表达Apo A-I特异性受体的其它细胞，以运载到其它组织。1. IApo A 分子在本发明的上下文中，“Apo A蛋白”应理解为形成高密度脂蛋白(HDLs)部分的 Apo A家族中的任何成员，其能够与肝细胞表面受体特异性相互作用，从而确保其运载偶 联至所述Apo A蛋白的所需分子到该器官的能力。可用于本发明的Apo A分子优选自由 ApoA-I、ApoA-II、ApoA-III、ApoA-IV以及ApoA-V或其功能等价变体所组成的组中。在一优选的具体实施方式
中，本发明所使用的Apo A蛋白是ApoA-I蛋白。在本发 明的上下文中，ApoA-I应理解为形成高密度脂蛋白(HDLs)组分的前-proApoA-I蛋白的成 熟形式。ApoA-I作为含有分泌信号序列的前体(前-proApoA-I)被合成，其中所述分泌信 号序列被切除以产生前体。该信号序列由18个氨基酸组成，前导肽由6个氨基酸组成而蛋 白的成熟形式由243个氨基酸组成。优选缺乏信号肽的并被加工过的成熟形式蛋白。在一 优选的具体实施方式
中，ApoA-I蛋白是人源的并且其氨基酸序列如SEQ ID NO :1 (UniPort 中的登录号为P02647)所示。在另一优选的具体实施方式
中，ApoA-I是鼠源的特别是来自 于小鼠，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO :2 (UniPort中的登录号为Q00623)所示。在另一 优选的具体实施方式
中，ApoA-I是鼠源的特别是来自于大鼠，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO 3 (UniPort中的登录号为P04639)所示。ApoA-I的功能等价变体应理解为所有由前述人或鼠ApoA-I序列通过插入、替换 或缺失一个或多个氨基酸所产生的，并实质上完整保持了与在肝细胞中形成HDL受体的 所谓的“B类I型清道夫受体”(SR-BI)相互作用能力的那些多肽。基本上如Monaco等 (EMBO J. ,1987,6 =3253-3260)所描述的，通过ApoA-I结合肝实质细胞膜的研究或通过检 测ApoA-I或其变体抑制HDL结合肝细胞膜受体的能力，来检测其与HDL受体相互作用的能 力。ApoA-I变体结合肝细胞膜的离解常数优选至少是10_8M、ΙΟΙ、10_6M、10_5M或10_%。本发明预期的ApoA-I变体包括与ApoA-I多肽具有至少60 %、65 %、70 %、72 %、 74 %、76 %、78 %、80 %、90 %或95 %相似性或同一性的多肽。两种肽之间的同一性程度通 过计算机算法以及本领域技术人员所熟知的方法来确定。两个氨基酸序列之间的同一性优 选通过 BLASTP 算法(BLASTManual, Altschul, S.等，NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894， Altschul, S.，等，J.，1990，Mol. Biol. 215 :403-410)来确定。本发明使用的ApoA-I变体优选具有比天然ApoA-I更长的血清半衰期，使得 ApoA-I血清水平达到比用ApoA-I所观察到的更高的水平。确定蛋白质以及特别是ApoA-I 的血清半衰期的方法是本领域公知的，其中包括，Eisenberg，S等(J. Lipid Res.，1973，14 446_458)、Blum 等(J.Clin· Invest. , 1977,60 :795-807)以及 Graversen 等(J Cardiovasc Pharmacol.，2008，51 :170-177)所描述的基于以标记蛋白标记代谢的方法。具有更长半衰 期的所述变体的例子有，例如，被称为Milano的变体(其含有R173C突变)。1. 2治疗所需的化合物
在本发明中，“治疗所需的化合物”应理解为任何能够预防或消除疾病症状的化合 物。本发明首先考虑了易受共价修饰而基本上不丧失其生物活性的任意治疗性化合物的应 用，诸如其可被轭合至ApoA-I或其功能等价变体。因此，本发明考虑了小有机分子、肽、拟 肽物、类肽、蛋白质、多肽、糖蛋白、低聚糖、核酸等作为治疗有效成分的应用。举例来说，可轭合至ApoA-I或其功能等价变体的化合物包括抗生素、胆碱酯酶 剂、阿托品、东莨菪碱、拟交感神经药、催眠药、镇静剂、抗癫痫药、类鸦片、镇痛剂、抗炎药、 组胺、脂质衍生物、平喘药、解热镇痛药、黄嘌呤、渗透性利尿剂、水银化合物、噻嗪化物以及 磺胺剂、碳酸酐酶抑制剂、有机硝酸盐、抗高血压药、强心甙、抗心律失常药物、催产素、前列 腺素、生物碱、抑制分娩药、驱虫剂、抗原虫药物、抗疟疾药物、杀阿米巴药、磺胺类药、青霉 素类、trimetropin、头孢菌素类、磺胺甲恶唑、抗真菌药、喹诺酮、抗病毒药、抗生素、氨基 糖苷类、四环素、氯霉素、红霉素、烷基化剂、激素、抗代谢物、抗生素、放射性同位素、硫唑嘌 呤、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、甲氨蝶呤、抗凝剂、溶栓药物、抗血小板药物、腺垂体激素、甲状 腺和抗甲状腺激素、雌激素和黄体酮、雄激素、促肾上腺皮质激素、胰岛素、甲状旁腺激素、 维生素D的类固醇衍生物、维生素、(水溶性维生素诸如维生素B复合物以及抗坏血酸或脂 溶性维生素诸如维生素A、D、K或E)、抗组胺药、抗癌抗菌素、抗病毒药物、抗真菌化合物。优 选使用可有效治疗疾病感染或在肝脏中有其来源的化合物。在一优选的具体实施方式
中，本发明轭合物的组分(ii)包含多肽链。在一优选的具体实施方式
中，ApoA-I多肽与形成组分(ii)的多肽形成单链多肽。本发明涵盖了两个多 肽的两个相对方位。因此，在一优选的具体实施方式
中，组分(i)的C末端结合到组分(ii) 的N末端。在另一优选的具体实施方式
中，组分(i)的N末端结合到组分(ii)的C末端。 优选地，当ApoA-I轭合物由单链多肽形成时，它们不通过下列方式形成(i)金黄色葡萄球菌A蛋白经C末端连接ApoA-I蛋白N末端(ii) ApoA-I蛋白经C末端连接血管肠肽(VIP-I)N末端(iii)组分(ii)是免疫球蛋白重链或纤维蛋白溶酶原片段(iv)四连接素三聚结构域(TTSE)经C末端连接ApoA-I蛋白N末端。可使用本发明的轭合物运载至肝脏的多肽包括促红细胞生成素(EPO)、瘦素、促肾 上腺皮质激素释放激素(CRH)、生长激素释放激素(GHRH)、促性腺激素释放激素(&iRH)、促 甲状腺激素释放激素(TRH)、催乳素释放激素(PRH)、褪黑激素释放激素(MRH)、催乳素抑制 激素(PIH)、抑生长素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促生长激素或生长激素(GH)、促黄体激 素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH或甲状腺刺激激素)、催乳素、催产素、抗利 尿激素(ADH或后叶加压素)、褪黑激素、苗勒管抑制因子、降血钙素、甲状旁腺激素、胃泌激 素、缩胆囊素(CCK)、精氨酸加压素、甲状腺激素、氧化偶氮甲烷、三碘甲状腺氨酸、白细胞抑 制因子、双调蛋白、可溶性血栓调节蛋白、干细胞因子、成骨蛋白1、骨形成蛋白、巨噬细胞生 长因子(MGF)、黑瘤生长刺激因子、调蛋白(heregulins)、促黑细胞激素、胰泌素、胰岛素样 生长因子I (IGF-I)、胰岛素样生长因子II (IGF-II)、心房利钠肽(ANP)、人绒毛膜促性腺激 素(hCG)、胰岛素、胰高血糖素、抑生长素、胰多肽(PP)、瘦素、神经肽Y、肾素、血管紧张素I、 血管紧张素II、VIII因子、IX因子、组织因子、因子VII、X因子、凝血酶、凝血因子V、因子 XI、因子XIII、白细胞介素-1 (IL-I)、白细胞介素2 (IL-2)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介 素4 (IL-4)、白细胞介素5 (IL-5)、白细胞介素_6 (IL-6)、白细胞介素7 (IL-7)、白细胞介素8 (IL-8)、白细胞介素9 (IL-9)、白细胞介素10 (IL-10)、白细胞介素11 (IL-Il)、白细胞介素 12(IL-12)、白细胞介素13(IL-13)、白细胞介素14(IL-14)、白细胞介素15(IL_15)、白细胞 介素16 (IL-16)、白细胞介素M (IL-M)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、干扰素α、干扰素β、 干扰素 Y、CD3、CD134、CD137、ICAM-U LFA-U LFA-3、趋化因子包括 RANTES1 α、MIP-I α、 MIP-I β、神经生长因子(NGF)、由Wilms，肿瘤抑制基因编码的WTl蛋白、血小板衍生的生 长因子(PDGF)、转化生长因子β (TGF-β)、骨形成蛋白(BMPs)、成纤维细胞生长因子(FGF 和KGF)、表皮生长因子(EGF及相关因子)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因 子(GM-CSF)、神经胶质生长因子、角质细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经胶质细胞源 系、神经营养因子(GDNF)、α -抗胰蛋白酶、肿瘤坏死因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、心肌营养蛋白1 (CT-I)、制瘤素M(OSM)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Α1、Α2、Α3、Α4、Α5、 Α6、Α7、Α8、Α9、Α10、Α11、Α12、Α13、Β1、Β2、Β3、Β4、Β5、Β6、Β7、Β8、Β9、Β10、Β11、Β12、Β13、 C1、D1、E1、E2、F1、F2、G1、H1、I1以及12)、环孢霉素、纤维蛋白原、纤连蛋白的EDA结构域、 乳铁蛋白、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、糜蛋白酶、免疫球蛋白、水蛭素、超氧化物歧化酶、 伊米苷酶、β -葡糖脑苷脂酶、重组阿葡糖苷酶-α、α -L型艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫 酸酯酶、加硫酶、人α-半乳糖苷酶Α、α-1蛋白酶抑制剂、乳糖酶、胰酶(脂肪酶，淀粉酶， 蛋白酶)、腺苷脱氨酶、免疫球蛋白、白蛋白、A型和B型肉毒杆菌毒素、胶原酶、人脱氧核糖 核酸酶I、透明质酸酶、木瓜酶、左旋天门冬酰胺酶、重组水蛭素、链激酶、胆色素原脱氨酶 (PB⑶)、细胞转化因子β (TGF-β)抑制剂肽、ILlO抑制剂、FoxP3抑制剂、TNF α抑制剂、血 管内皮生长因子抑制剂、PD-I抑制剂和⑶152抑制剂。在一优选的具体实施方式
中，本发明轭合物的组分(ii)是干扰素(IFN)、干扰素 分为I型、II型和III型。I型干扰素是一种具有细胞因子活性的多肽家族，最初因其在体 外细胞系病毒感染中的抑制活性而被发现(Pestka，S.，Krause，C.D.和Walter，Μ. R. 2004. Immunol Rev. 202 :8-32)，并且其特征在于结合所谓的IFN α受体(IFNAR)。依据其序列上 的同源性，I型干扰素分为干扰素α (IFN-α)、干扰素β (IFN-β)和干扰素ω (IFN-ω)。 IFN-α和IFN-β共享表达在大多数有核细胞表面的单二聚体受体。鉴于其启动促进感染 细胞凋亡的死亡以及抑制病毒复制同时有利于抗原提呈的机制，这些细胞因子在针对各种 类型病毒感染的免疫应答中的功能非常重要。最近有实验记载，其还可以在免疫应答中通 过直接激活T细胞、B细胞和NK细胞以及树突细胞的活性而行使功能(Le Bon Α.等，2003. Nat. Immunol. 4 :1009-1015 ；LeBon Α.等，2006. J. Immunol. 176 :4682-4689 ；Le Bon Α.等， 2006. J Immunol. 176 :2074-8)。II型干扰素的特征在于其结合干扰素、受体(IFNGR)并仅 包括IFNi 一个成员。III型干扰素通过由IL-10受体2(IL10R2)和IFN λ 1受体(IFNLRl) 形成的复合物转导信号，并由三种称为IFNX-1、IFNX-2和IFNX-3的干扰素λ组成。在一优选的具体实施方式
中，组分(ii)是I型干扰素如IFN-α、IFN-β ,IFN- δ、 IFN- ε、IFN-κ ,IFN- τ和IFN-ω。在一特别的具体实施方式
中，本发明组合物中的至少一 种I型干扰素选自干扰素α (IFN-α)和干扰素β (IFN-β)。当所述I型干扰素为IFN-a 时，后者可对应由人IFN-α基因家族的任一基因成员所编码的任意干扰素。在一特别的具体实施方式
中，至少一种I型干扰素是选自IFN-a 2a、IFN-α 2b, IFN-α 4、IFN-α 5、 IFN-α 8和其组合(包括其在药物制剂中与其它物质的组合)的IFN-α。在一更特别的具 体实施方式中，所述干扰素是IFN- α 1，优选是人源干扰素。在一优选的具体实施方式
中，所述干扰素是IFN-α 5。I型干扰素的类型列表，特别是可用于本发明的IFN-α和IFN-β，可参见Bekisz 等(Growth Factors, 2004 ；22 :243-251)以及 Petska 等(ImmunologicalReviews, 2004 ； 202:8-32)。此外，本发明提供了包含一种以上类型干扰素的轭合物组合的应用，例如 IFN-anK类淋巴母细胞衍生物)或IFN_a3(以仙台病毒(或另一种病毒)或病毒颗粒刺 激人白细胞所产生的干扰素组合)。所使用的I型干扰素的来源不是本发明的关键方面。I型干扰素可以是天然的， 从生物液体或组织提取并纯化的，或通过传统的重组基因工程以及如Sambrook和Russel
ifflW JP Tj ( "Molecular Cloning :to Laboratorymanual" of J. Sambrook, D. W. Russel Eds. 2001，第三版，Cold Spring Harbor, New York)，通过合成工艺或通过本领 域所描述的任何其它常规技术制备。在本发明一特别的具体实施方式
中，本发明组合物中的至少一种I型干扰 素是聚乙二醇形式的。制备聚乙二醇形式的干扰素的一些例子可参见US576^23和 US5766582。另外，也可以使用一些商用干扰素，聚乙二醇化的或非聚乙二醇化形式。这 包括，不受任何限制的，来源于Hoffmann LaRoche Inc的R0FER0N-A(人重组IFN- α 2a) 以及PEGASYS (聚乙二醇化IFN-α )，来源于Schering Corp的INTR0N-A (人重组 IFN- α 2b)以及 PEG-INTR0N (聚乙 二醇化 IFN-α 2b)，来源于 hterferon Sciences 的 ALFER0N-N(IFN- α 3η,天然干扰素的组合)，或来源于 hterMunePharmaceuticals Inc 的 IFNERGEN(IFN-α conl)，其序列是不与天然序列完全一致的共有序列。还包括IFN-β制 剂，例如 Biogen Idec 的 AVONEX(IFN-β la)，EMD Serono, Inc 的 REBIF(IFN-β la)，以及 Bayer Health Care 的 BETASERON(IFN_β lb)。在一优选的具体实施方式
中，本发明的轭合物由ApoA-I经其C末端并通过柔性连 接子与干扰素α 分子N末端融合形成。在另一优选的具体实施方式
中，本发明的轭合物 由干扰素α 1分子经其C末端并通过柔性连接子与ApoA-I分子N末端融合形成。在另一优选的具体实施方式
中，组分(ii)是TGF-β抑制剂。能作为根据本发明 轭合物部分的TGF-β抑制剂包括选自TGF-β 1受体序列的肽抑制剂，其结合TGF-β 1的受 体结合位点从而阻断受体结合。这些类型的肽在W0200031135中有描述，其中的全部内容 通过引用纳入本文。在一优选的具体实施方式
中，TGF-β 1抑制肽来源于TGF-β IIII型受 体。在一更优选的具体实施方式
中，抑制肽是具有序列为TSLDASIIWAMMQN(SEQ ID NO 4) 的肽P144。本发明同样提供了抑制肽在抑制TGF-β 1与TGF-β 1受体相互作用以及所述相 互作用引发的信号中的应用，鉴定这样的肽的噬菌体展示基因文库已被W0200519244描 述，其中的全部内容通过引用纳入本文。在一优选的具体实施方式
中，抑制肽是肽P17，其 特征在于序列为KRIWFIPRSSWYERA(SEQ ID NO :5)及其截短的变体，其基本上保留了抑制 TGF-β 1与TGF-β 1受体相互作用的能力，这些在W02007048857中已有描述，其中的全部内 容通过引用纳入本发明。 1. 3ΑροΑ组分与治疗活性化合物之间的连接元件 包含Apo A蛋白和具有天然肽的第二组分的本发明的轭合物，含有直接连接Apo A蛋白和所述第二组分的键，或者，可选择地，含有在Apo A蛋白和具有天然肽的所述第二组分之间作为连接子的其它氨基酸序列。根据本发明，所述非天然中间氨基酸序列在结构 域之间作为铰链区，使得它们相互之间可独立移动同时保持各自结构域的三维构型。从这 个意义上来说，本发明的优选非天然中间氨基酸序列应当是以允许这种移动的结构延展性 为特征的铰链区。在一特别的具体实施方式
中，所述非天然中间氨基酸序列是非天然柔性 连接子。在一优选的具体实施方式
中，所述柔性连接子是长度为20个氨基酸或更短的柔 性连接肽。在一更优选的具体实施方式
中，连接肽含有2个或多个选自甘氨酸、丝氨酸、 丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。在本发明的一优选具体实施方式
中，所述柔性连接子是多聚 甘氨酸连接子。可能的连接子/间隔区序列的例子包括SGGTSGSTSGTGST(SEQ ID NO :6)、 AGSSTGSSTGPGSTT (SEQ ID NO 7)或 GGSGGAP(SEQ ID NO :8)。这些序列已用于结合设计的 卷曲螺旋至其它蛋白结构域(Muller，K. Μ.，Arndt, K. Μ.禾Π Alber，Τ.，Meth. Enzymology, 2000,328 :261-281) ο所述连接子优选包含氨基酸序列GGGVEGGG(SEQ ID NO 9)或由其组 成。连接区域的作用是在Apo A蛋白和组分(ii)之间提供空间。从而确保ApoA的二 级结构不受组分(ii)存在的影响，反之亦然。间隔区优选具有肽性质。连接肽优选包含至 少2个氨基酸，至少3个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至 少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、 至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或大约100个氨基酸。连接子可通过共价键结合本发明轭合物的两种组分侧翼的组分，并且优选间隔区 基本上是非免疫原性的和/或不包含任何半胱氨酸残基。以类似的方式，间隔区的三维结 构优选是线性的或基本上是线性的。间隔肽或连接肽的优选例子包括那些已用于结合蛋白质但基本上不削弱所结合 蛋白功能的，或至少基本上不削弱其中一个结合蛋白质的功能的肽。更优选的，已用于结合 蛋白的间隔区或连接子包含卷曲螺旋结构。连接子可包括在四连接素中形成β片层的四连接素的53-56残基，以及在四连接 素中形成转角(turn)的 57-59 残基(Nielsen, B. B.等，FEBS Lett. 412 :388-396,1997) 片段的序列是GTKVHMK(SEQ ID NO :10)。该连接子具有一个优点，当其存在于天然四连接素 中时，其通过CRD结构域结合三聚结构域，并因而适于连接三聚结构域至另一普通结构域。 此外，生成的构建体预期不比没有连接子的构建体具有更强的免疫原性。另外，人纤连蛋白来源的连接链3中的子序列可用作连接子，所述子序列对应于 氨基酸1992-2102 (SffISSPROT编号，登记号P02751)。优选应用对应于氨基酸2037-2049的 子序列PGTSGQQPSVGQQ(SEQ ID NO :11)，其中更优选的是对应于氨基酸2038-2042的子序 列片段GTSGQ(SEQ IDNO :52)。该构建体具有不易蛋白裂解的优点，并且，由于纤连蛋白在 血浆中高浓度存在，其免疫原性不强。可选地，合适的肽连接子可以是基于小鼠IgG3上游铰链区的10个氨基酸残基序 列。该肽(PKPSTPPGSS，SEQ ID NO :12)已被用于生产通过卷曲螺旋二聚的抗体(Pack P.和 Pluckthun, A.，1992，Biochemistry31 :1579-1584)，并可用作根据本发明的间隔肽。更优 选的是人IgG3上游铰链区的相应序列。预期人IgG3序列在人体中不具有免疫原性。在一优选的具体实施方式
中，连接肽选自序列APAETKAEPMT(SEQ IDNO :13)的肽 以及具有序列GAP的肽。
可选地，本发明轭合物的两种组分可通过肽连接，所述肽的序列含有蛋白酶切割 靶点，因而能将Apo A-I从组分(ii)分离。适合整合入本发明多肽的蛋白酶切位点包括 肠激酶(切割位点DDDDK, SEQ ID NO :14)、Xa因子(切割位点IEDGR，SEQ ID NO :15、凝血 酶(切割位点 LVPRGS, SEQ IDNO :16)、TEV 蛋白酶(切割位点 ENLYFQG，SEQ ID NO 17)、 I^eScission蛋白酶(切割位点LEVLFQGP，SEQ ID NO :18)、内含子等等。在一优选的具体 实施方式中，切割位点是表达在肿瘤组织、发炎组织、或肝脏中使得轭合物一到达肝脏就发 生Apo A与组分(ii)分离的蛋白酶切割位点。在一优选的具体实施方式
中，连接子含有基 质金属蛋白酶"9识别位点(切割位点LFPTS, SEQ ID NO 19)。2.获得本发明轭合物的方法本发明的轭合物可使用本领域技术人员熟悉的任何方法获得。因此可通过任何标 准方法获得Apo A蛋白或所述蛋白质的变体。例如，可从个人或实验动物的血清样品中纯 化 Apo A-I 蛋白(W09807751，W09811140, Jackson 等，1976，Biochim Biophys Acta. 420 342-349，Borresen, A. L.禾口 Kindt，Τ. J.，1978，J. Immunogenet. 5 :5-12 以及 Forgez, P, 禾口 Chapman，Μ. J. ，1982，J. Biochem. Biophys. Methods, 6 :283-96)。可选地，Apo A-I 蛋白 可在异种生物例如大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、昆虫细胞中应用本领域已知的方法表 达 cDNA 获得，所述方法已描述于 W007023476、W09525786、W08702062、Feng 等，(Protein. Expr. Purif.，2006,46 :337-42)、Pyle 等，1996 Biochemistry. 35 12046-52)、Brissette 等，(Protein Expr. Purif. 1991,2 :296-303)以及 Bonen，D. K. (J. Biol. Chem.，1997，272 5659-67)。一旦有足够量的纯化Apo A蛋白，应当将其轭合至所需的治疗性化合物。可以通过 不同方式轭合治疗活性组分(ii)至Apo A分子。一种可能性是，官能团与治疗活性组分在 不干扰所述组分活性的位置直接轭合。如本发明所理解的，官能团涉及分子中的一组特殊 原子，其是所述分子具有特征性化学反应的原因。官能团的例子包括但不限于以下物质组 成的组羟基、醛、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨甲酰、伯胺、仲胺、叔胺以及季胺、氨氧基、叠氮 化物、偶氮基(二酰亚胺)、苄基、碳酸盐、酯、醚、乙醛酰、卤烷基、卤甲酰基、亚胺、酰亚胺、 酮、马来酰亚胺、异腈、异氰酸盐、羰基、硝酸盐、亚硝酸盐、硝基、亚硝基、过氧化物、苯基、磷 化氢、磷酸盐、膦酰基、吡啶基、硫化物、磺酰基、亚磺酰基、硫酯、硫醇和氧化3，4_ 二羟基苯 丙氨酸(DOPA)基团。所述基团的例子是特异性地与Apo A分子中的硫醇基反应的马来酰 亚胺或乙醛酰基团，以及与Apo A分子中的伯胺反应的氧化3，4_ 二羟基苯丙氨酸(DOPA) 基团。另一种可能性是，通过应用同源或异源双官能团轭合治疗活性组分(ii)至Apo A 分子。双官能团可首先轭合至治疗活性化合物，然后轭合至Apo A蛋白，或者，可选地，可轭 合双官能团至Apo A蛋白，然后将其轭合至治疗活性化合物。这些类型的轭合物的示例包 括被称为酮肟(US20050255042中有描述)的轭合物，其中轭合物的第一组分包含结合异源 双官能团中的酮官能团的氨氧基，其顺序结合轭合物第二组分中的氨基基团。在其它具体实施方式
中，用于轭合本发明轭合物组分(i)和(ii)的试剂可以是 光分解的、化学的、热处理或酶处理的。特别需要使用能够在细胞靶中以酶水解的连接剂， 使得治疗活性化合物仅在细胞内部释放。能够在细胞内处理的连接剂类型的例子已在 W004054622, W006107617, W007046893 和 W007112193 描述。
在一优选的具体实施方式
中，本发明轭合物的组分(ii)是具有天然肽的化合物， 包括低聚肽和肽。化学修饰多肽链的方法是本领域技术人员众所周知的，包括基于半胱氨 酸基中的巯基轭合的方法，基于赖氨酸基中的伯氨基轭合的方法(US6809186)，基于N末端 和C末端部分轭合的方法。用于修饰多肽使得其耦合其它化合物的合适试剂包括戊二醛 (其使得化合物结合多肽的N末端)、碳化二亚胺(其使得化合物结合多肽的C末端)、琥珀 酰亚胺酯(例如MBS、SMCC)其激活N末端和半胱氨酸基、对二氨基联苯(BDB)其激活酪氨 酸基、高碘酸盐，其激活糖基化蛋白中的糖基。在组分Apo A与所需治疗性化合物形成单肽链的特定情况下，可以使用本发明的 编码所述轭合物的基因构建体在单独步骤中表达轭合物，因为所述构建体与转录元件以及 可选的翻译控制元件一同被导入合适在异源有机体中表达的载体。本发明表达框中的转 录元件以及可选的翻译控制元件包括启动子，指导其可操作地连接的核苷酸序列转录以 及其它必需或适合转录的序列及其位置和时间的适当调控，例如，起始和终止信号、切割位 点、多聚腺苷酸化信号、复制起点、转录增强子、转录沉默子等等。用于构建本发明表达框以 及重组载体的所述元件以及载体通常根据应用的宿主细胞来选择。3.本、11_針_在另一方面，本发明涉及编码本发明多肽的多核苷酸。本领域技术人员应当理解 的是本发明的多核苷酸仅仅编码所述轭合物，其中轭合物的组分(ii)具有肽性质并且多 肽Apo A形成单个的肽链，而不考虑相对位置以及不考虑两个组分直接连接或由间隔区隔 开的情况。在另一方面，本发明涉及包含本发明多核苷酸的基因构建体。优选的构建体包括， 本发明的多核苷酸受调节本发明多核苷酸表达序列的可操控调控。本领域技术人员应当 理解的是，本发明的多核苷酸必须接近靶组织的细胞核，并在那转录以及翻译以产生生物 活性融合蛋白。为此，当施用的活性组分是多核苷酸时，后者必须优选编码pre-proApoAl 或ApoAl变体的前体形式，使得在其表达后由于信号序列而分泌并被加工以生成成熟的 ApoAl0在Apo A经C末端与干扰素分子融合形成轭合物用于表达的情况下，优选编码轭 合物的多核苷酸位于编码ApoAl信号序列的序列之后。在干扰素分子经C末端与Apo A分 子N末端融合形成轭合物用于表达的情况下，优选编码轭合物的多核苷酸位于编码干扰素 α 信号序列的序列之后。原则上，任何启动子均可用于本发明的基因构建体，只要所述启动子与待表达的 多核苷酸的细胞兼容。因此，适合本发明具体实施方式
的启动子包括但不必要限于组成 型启动子，例如真核病毒基因组的衍生物，所述真核病毒如多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、鸟 类肉瘤病毒、乙型肝炎病毒；金属硫蛋白基因启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶基因启动子； 逆转录酶病毒LTR区；免疫球蛋白基因启动子；肌动蛋白基因启动子；EF-I α基因启动子； 以及蛋白质表达依赖于额外的分子或外源信号的可诱导启动子，如四环素系统、NF κ B/紫 外光系统、Cre/Lox系统；以及热休克基因启动子；W02006/135436所述的RNA聚合酶II的 可调控启动子以及组织特异性启动子。在一优选的具体实施方式
中，本发明的基因构建体 含有位于主要在肝脏表达基因的启动子区域的表达-增强区，所述基因如人血清白蛋白基 因、凝血酶原基因、α 1微球蛋白基因或醛缩酶基因，或者是几个拷贝形式的单拷贝，或者是孤立形式或与其它肝脏特异表达元件如巨细胞病毒、α 1抗胰蛋白酶或白蛋白启动子的组
I=I O组织特异启动子的其它例子包括白蛋白基因启动子(Miyatake等，1997， J. Virol, 71 :5124-32)、肝炎病毒的核心启动子(Sandig 等，1996，Gene Ther.，3 :1002-9)、 α -甲胎蛋白(phetoprotein)基因的启动子(Arbuthnot 等，1996，Hum. GeneTher.，7 1503-14)、以及结合甲状腺素的球蛋白结合蛋白的启动子(Wang，L.，等，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :11563-11566)。本发明的多核苷酸或形成其的基因构建体可成为载体的一部分。因此，在另一方 面，本发明涉及包含本发明多核苷酸或基因构建体的载体。本领域技术人员应当理解的是 可使用的载体类型没有限制，因为所述载体可以是适合增殖以及适合获得所述多核苷酸的 克隆载体、或合适的基因构建体、或合适纯化轭合物的不同异源有机体中的表达载体。因 此，根据本发明的合适载体包括原核生物表达载体如PUC18、pUC19、Bluescript及其衍生 物、1^18、1^19481 3224]\^9、(0比140 1、1^4、噬菌体和穿梭载体如 pSA3 以及 pAT28，酵母 表达载体如2微米质粒类型载体、整合质粒、YEP载体、着丝粒质粒等等，昆虫细胞表达载体 如pAC系列和pVL系列载体，植物中的植物表达载体如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA，、 pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列载体等等，基于病毒载体(腺病毒、与腺病毒相关的病 毒以及逆转录病毒和慢病毒)的高等真核细胞表达载体以及非病毒载体如PSilencer 4. I-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3. 1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3. 1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/ HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5_His、ρVAXl, pZeoSV2、pCI、pSVL 和 pKSV-10、 pBPV-1、pML2d 以及 pTDTl。本发明的载体可用于转化、转染或感染那些可被所述载体转化、转染或感染的细 胞。所述细胞可以是原核的或真核的。例如，其中引入所述DNA序列的载体可以是质粒，或 是一种当其被引入宿主细胞时整合在所述细胞基因组并与所整合的染色体一同复制的载 体。所述载体可通过本领域技术人员已知的常规方法获得(Sambrok等，2001，如上所述)。因此，在另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸、基因构建体或载体的细 胞，因为所述细胞已能被本发明所提供的构建体或载体转化、转染或感染。可通过本领域技 术人员已知的常规方法获得(Sambrok等，2001，如上所述)转化、转染或感染的细胞。在一 特别的具体实施方式
中，所述宿主细胞是以合适载体转染或感染的动物细胞。适用于表达本发明轭合物的宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌 以及细菌细胞。细菌细胞包括但不限于革兰氏阳性细菌细胞如芽孢杆菌属、链霉菌属以 及葡萄球菌种属，革兰氏阴性细菌细胞如埃希氏菌属和假单胞菌属。优选的真核细胞包 括酵母细胞如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia pastoris)以及多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha) 0昆虫细胞包括但不限于果蝇细胞以及Sf9细胞。植物细胞包 括，特别是，农作物细胞如谷类植物、药用植物、观赏植物或球茎植物。适合本发明的哺乳动 物细胞包括上皮细胞系(猪的，等等)、骨肉瘤细胞系(人的，等等)、神经母细胞瘤细胞系 (人的，等等)、上皮癌(人的，等等)、神经胶质细胞(小鼠的，等等)、肝细胞系(源于猴的， 等等)、CH0(中国仓鼠卵巢)细胞、COS细胞、BHK细胞、HeLa细胞、911、AT1080、A549、293 或PER. C6、NTERA-2人ECC细胞、mESC细胞系的D3细胞、人胚胎干细胞如HS293和BGVO1、 SHEFU SHEF2 以及 HS181、NIH3T3 细胞、293T、REH 和 MCF-7 以及 hMSC 细胞。
在另一方面，本发明涉及包含本发明轭合物的纳米脂质体颗粒。如本文所使用的，术语“纳米脂质体颗粒，，等同于术语“脂蛋白”或“脂蛋白颗粒，， 并可互换使用。所谓“纳米脂质体颗粒”在此应理解为任何由非极性脂类(如酯化胆固醇 和甘油三酯)核心被载脂蛋白、磷脂和游离胆固醇形成的外部极性包被所形成的水溶性颗 粒。根据密度将纳米脂质体颗粒或脂蛋白分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、中 间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。不同脂蛋白的特性如 表1所示。表权利要求
1.一种轭合物，其包括(OApo A分子或其功能等价变体，以及 ( )治疗所需的化合物 其中组分(i)和(ii)共价结合。
2.根据权利要求1所述的轭合物，其中所述ApoA分子选自以下物质组成的组中 ApoA-I、ApoA-II、ApoA-III、ApoA-IV 和 ApoA-V 或其功能等价变体。
3.根据权利要求1或2所述的轭合物，其中所述ApoA分子选自人Apo A和鼠Apo A。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的轭合物，其中所述组分U)是多肽。
5.根据权利要求4所述的轭合物，其中所述组分(i)和(ii)形成单个多肽链。
6.根据权利要求5所述的轭合物，其中所述组分(i)的C末端结合至组分( )的N 末端或其中组分(i )的N末端结合至组分(U )的C末端。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的轭合物，其中所述组分(ii)是干扰素。
8.根据权利要求7所述的轭合物，其中所述干扰素是人或小鼠干扰素α 或干扰素α 5。
9.根据权利要求4-6任一项所述的轭合物，其中所述组分U)是TGF-β抑制剂。
10.根据权利要求9所述的轭合物，其中所述TGF-β抑制剂选自SEQID NO=I (Ρ144) 和SEQ ID NO 2 (P 17)或其功能等价变体。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的轭合物，其中所述组分(t)和(h )通过连接肽连接。
12.根据权利要求11所述的轭合物，其中所述连接肽是柔性肽和/或含有蛋白酶识别 位点。
13.根据权利要求12所述的轭合物，其中所述连接肽选自SEQID NO 3 (APAETKAEPMT)、SEQ ID NO 4 (GAP)或基质金属蛋白酶_9识别位点。
14.一种包含编码权利要求5-13中任一项所述多肽的多核苷酸的多核苷酸或基因构 建体。
15.一种包含权利要求14所述的多核苷酸或基因构建体的载体。
16.一种包含权利要求14所述的多核苷酸或基因构建体或权利要求15所述的载体的 宿主细胞。
17.一种包含权利要求1-14中任一项所述的轭合物的纳米脂质体颗粒。
18.根据权利要求17所述的纳米脂质体颗粒，其中所述纳米脂质体颗粒是高密度脂 蛋白(HDL)。
19.一种包含治疗有效量的权利要求1-13中任一项所述的轭合物、权利要求14所述 的多核苷酸或基因构建体、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞或权利要 求17或18所述的纳米脂质体颗粒以及药物学上可接受载体或赋形剂的药物制剂。
20.根据权利要求1-13中任一项所述的轭合物、权利要求14所述的多核苷酸或基因 构建体、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞、权利要求17或18所述的 纳米脂质体颗粒或权利要求19所述的药物制剂在医学中的用途。
21.根据权利要求1-13中任一项所述的轭合物、权利要求14所述的多核苷酸或基因 构建体、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞、权利要求17或18所述的 纳米脂质体颗粒或权利要求19所述的药物制剂用于肝脏疾病或与免疫系统相关疾病的治疗。
22.根据权利要求1-13中任一项所述的轭合物、权利要求14所述的多核苷酸或基因 构建体、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞、权利要求17或18所述的 纳米脂质体颗粒或权利要求19所述的药物制剂用于以下疾病的治疗，所述疾病选自以下 组中慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝癌、帕金森氏症、急性间歇性卟啉症、肺纤维化、骨转 移、系统性硬化、硬斑病、皮肤癌、光化性角化病、瘢痕疙瘩、烧伤、心肌纤维化、肾纤维化、病 毒感染、细菌感染、寄生虫感染、类风湿关节炎和非霍奇金淋巴瘤。
23.根据权利要求1-13中任一项所述的轭合物、权利要求14所述的多核苷酸或基因 构建体、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞、权利要求17或18所述的 纳米脂质体颗粒或权利要求19所述的药物制剂作为疫苗佐剂、免疫治疗佐剂、结肠癌治疗 中的佐剂、抗血管生成药物、肝功能剂或肾功能保护剂的应用。
24.一种组合物，包含(a)第一组分，其选自权利要求1-13中任一项所述的轭合物、权利要求14所述的 多核苷酸或基因构建体、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞、权利要求 17或18所述的纳米脂质体颗粒或权利要求17所述的药物制剂，其中组分U)是TGF-βΙ 抑制肽，以及(b)第二组分，其选自免疫刺激细胞因子、编码所述细胞因子的多核苷酸、包含所 述多核苷酸的载体、TGF-β 1抑制肽、细胞毒素剂或其组合。
25.根据权利要求M所述的组合物，其中组分(a)或组分(b)中的所述TGF-β1抑制 肽选自肽Ρ144和肽ρ17。
26.根据权利要求M或25所述的组合物，其中组分(b)中的所述免疫刺激细胞因子 是 IL-12。
27.根据权利要求M-26中任一项所述的组合物用于癌症治疗。
全文摘要
本发明涉及包含ApoA分子或其功能等价变体以及治疗所需化合物的轭合物，其中两种组分共价连接。本发明还涉及所述轭合物在特异性靶向所述化合物至显示ApoA分子特异性结合位点组织的治疗中的应用。
文档编号A61K47/48GK102123737SQ200980131382
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者佩德罗·贝龙多·洛佩斯, 杰西卡·菲奥拉万蒂, 赫苏斯·玛丽亚·普列托·巴尔图埃纳 申请人:西马生物医学计划公司