一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法
【专利摘要】本发明公开了一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法，包括OsABC1-2基因过量表达载体的构建步骤和OsABC1-2过表达转基因植株的获得步骤。本发明通过在粳稻中过量表达OsABC1-2基因，显著提高了种子大小和粒重，并增强了对黑暗处理诱导叶片衰老的抗性。因而，该基因是水稻粒型性状的一个新的调控因子，在提高水稻的种子大小和粒重以及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，产生更高的经济效益。
【专利说明】一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法。【背景技术】
[0002]水稻是最重要的粮食作物之一，养活了全世界一半以上的人口。随着人口的增长和生活水平的提高，人们对稻米无论从产量还是品质上均提出越来越高的要求。据推算，至2025年，全球人口将超过80亿，以稻米为主食的人口数量将增至35亿。按最保守的估计，由于人口增长而导致稻米需求量的增加至少达3亿吨。水稻产量的提高，依靠扩大种植面积的潜力已很有限。由于受水资源和耕地面积的限制，加上经济发展和城市化的推进，不少产稻国家的水稻种植面积实际上已有所下降。为此，今后将主要依赖于单位面积产量的提高来进一步提高水稻产量。[0003]粒形性状包括粒长、粒宽、粒厚、粒重和长宽比等，是水稻产量的重要构成因子。控制水稻粒形遗传的数量性状基因座(QTLs)的定位、相关基因的克隆和应用已有较多研究报道。是一个控制水稻粒长的主效基因，定位在第三号染色体着丝粒附近。该基因由五个外显子组成，其第二个外显子的一个无义突变导致蛋白C端的缺失，从而引起大粒品种的籽粒变大。通过RNA干涉抑制GS3的表达显著提高了小粒品种川7的粒长和粒重。GW2和qS勝/G勝均为控制水稻粒宽的QTL。其中GW2定位在水稻第2号染色体的短臂上，编码一个新的泛素蛋白连接酶。GW2功能的缺失增加了颖壳细胞的数目，导致颖壳变大、粒宽和粒重增加。通过分子标记选择将大粒品种的02?基因导入小粒品种中，其粒重和单株产量分别增加了 49.8 %和20 %。q5F5/-1勝定位于水稻第5号染色体短臂。该基因编码一个由144个氨基酸残基组成的蛋白，通过泛素蛋白酶体途径负调控水稻颖壳细胞的数目，进而控制粒宽、粒重和产量。目前所分离的粒形基因多为控制粒形性状的负调控因子。近来，Li等(Li Y-B, Fan C-C, Xing Y-Z, Jiang Y-H, Luo L-J, Sun L, Shao D, Xu C-J, Li X-H,Xiao J-Hj He Y-Qj Zhang Q-F.Natural variation in GS5 plays an important role inregulating grain size and yield in rice.Nature Genetics.2011， 43: 1266-1269)克隆了一个控制水稻籽粒大小的QTL，GS5。该基因编码一个推定的丝氨酸羧肽酶，正调控粒宽、籽粒灌浆和粒重。在粳稻品种中花11中过量表达显著提高了水稻籽粒的大小和产量。
【发明内容】
[0004]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法，通过在粳稻中过量表达基因，显著提高了种子大小和粒重，并增强了对黑暗处理诱导叶片衰老的抗性，以使其满足使用要求。
[0005]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法，包括以下步骤:
I) OsABCl-2基因过表达载体的构建以野生型粳稻品种中花11 CDNA为模板，设计一对引物，扩增基因，引物序列如下:
在引物两端分别引入了限制性内切酶ifeMl I和分e I的识别位点；PCR扩增产物用胶回收试剂盒(TaKaRa，805A)纯化，并利用及I和分e I酶切后，连入用相同限制性酶切割的x￡AMBIA1301-UbiN0SmM ;重组质粒采用热击转化法转化大肠杆菌DH5 α，转化物在含卡那霉素的LB平板上筛选，挑选阳性克隆，提取质粒后测序验证正确，获得OsABCl-2过表达载体；其中，之基因序列如SEQ ID N0.1所示；
2) OsABCl-2过表达转基因植株的获得
将测序正确的过表达载体通过电击法转入农杆菌菌株EHA105中；将粳稻品种中花11未成熟种子带壳灭菌，在超净工作台上分离出未成熟胚，接种在诱导愈伤培养基上；暗培养6d后挑选生长旺盛，颜色浅黄的胚性愈伤组织，作为转化的受体；将带有OsABC1-2过表达重组质粒的农杆菌EHA105菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，并用加入乙酰丁香酮的AAM培养基重悬后倒入愈伤组织进行侵染；侵染结束后的愈伤组织在共培养基上培养3d，然后在含有50 mg I/1潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织，经两代筛选以后，将抗性愈伤组织进行预分化处理和分化再生；再生小苗转入1/2MS培养基上生根壮苗；小苗经练苗处理后移入大田种植。
[0006]所述的调控水稻籽粒大小和粒重的方法，所述-J?基因表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]用于realtime PCR检测说V-之基因的特异性引物0sABCl_2F和0sABCl_2R，弓丨物序列如下:
0sABCl-2F:5’ -AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3，
0sABCl-2R:5’ -AACAGCATACCGACCTAACC-3’。
[0008]可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
[0009]所述植物表达载体包括双元农杆菌载体(如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、PCAMBIA3301、pCAMBIA1301_UbiN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0010]使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、胁迫诱导型启动子Rd29A等,它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。[0011]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0012]携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0013]有益效果:与现有技术相比，本发明通过在粳稻中过量表达基因，显著提高了种子大小和粒重，并增强了对黑暗处理诱导叶片衰老的抗性。因而，该基因是水稻粒型性状的一个新的调控因子，在提高水稻的种子大小和粒重以及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，产生更高的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是OsABCl-2基因过表达载体的构建示意图；
图2是OsABCL基因在野生型中花11 (ZHll)和过表达转基因株系(OE)中的相对表达情况；
图3是野生型中花11和过表达转基因植株种子大小比较图；
图4是野生型中花11和过表达转基因植株黑暗处理下的抗性比较图。
[0015]具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0016]以下实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规操作方法，所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0017]实施例1-J?过表达转基因株系的获得及表型分析
1)OsABC1-2过表达载体的构建
采用RNAsimple总RNA提取试剂盒(Tiangen，DP419)提取粳稻品种中花11叶片总RNA，利用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa,6110A)试剂盒方法反转录成cDNA。反转录步骤如下:取RNA样品3 μ g,分别加入50 μ mol L-1 OligodT primer I μ I和 IOmmol L-1 dNTP mixture I μ I,用 RNase free dH20补足体积 10 μ 1,65℃保温5111；[11后，冰上迅速冷却;变性后的反应液分别加入5XPrimeScript Buffer 4 μ I, 40U μ L-1 RNaseInhibitor 0.5 μ I, 200U μ L-1 PrimeScript RTase I μ I,用 RNase free dH20 补足体积20μ 1，缓慢混匀；按下列条件进行反转录反应:42°C 60min,70°C 15min，冰上放置。以cDNA 为模板，设 ii 对引物，利用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer (TaKaRa,044A)扩增OsABCl-2基因编码区片段，引物序列如下:
0sABCl-20E-F:5’ -AAAAGGATCCCGCCCTCGCGATGTCGGCC-3’，
0sABCl-20E-R:5’ -AAAAACTAGTCCGATGGCTATGCTACAACG-3’，
PCR 反应体系:2XPrimeSTAR GC Buffer 25 μ 1,2.5mmol L-1 dNTP mixture 4μ I,10 μ mol L-1 0sABCl-20E-F、0sABCl_20E-R 引物各 2 μ 1，cDNA 模板 2 μ 1，2.5 U μ L-1PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μ I，用灭菌蒸懼水补足体积 50 μ I。
[0018]PCR反应条件:95°C变性5min ;然后98°C变性10s，68°C延伸3min，扩增35个循环；最后在72°C下延伸lOmin。
[0019]在引物两端分别引入了限制性内切酶I和SPE I的识别位点。PCR扩增产物用胶回收试剂盒(TaKaRa，805A)纯化，并利用及I和分e I酶切后，连入用相同限制性酶切割的P以遍以A?似-油iMW载体(图1)。连接反应是利用T4 DNA Ligase (TaKaRa,2011A)进行。反应体系和条件为:IOXT4 DNA Ligase Buffer 2.5 μ 1，酶切回收后的基因片段300ng,载体DNA片段IOOng, 350U μ L-1 Τ4 DNA Ligase 1μ I,用灭菌蒸懼水补足体积25 μ 1，16°C过夜连接。重组质粒采用热击转化法转化大肠杆菌DH5 α。具体步骤为:将DH5a感受态细胞放置于冰上融化；将连接产物10 μ 1、感受态细胞50 μ I置于1.5mL灭菌管中，轻轻混匀后于冰上放置30min ;将上述混合物于42°C水浴锅中热击45s，立即放回冰上，静置2min ;在超净工作台上加LB液体培养基800 μ 1，37°C振荡培养Ih ;吸取上述转化物涂布在含卡那霉素的LB平板上过夜筛选。挑选阳性克隆，提取质粒后测序，获得OsABCl-2过表达载体。
[0020]测序获得的序列如SEQ ID N0.1所示，即为调控水稻籽粒大小和粒重的基因
表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0021]2) OsABC1-2过表达转基因植株的获得和表型分析
将测序正确的OsABC1-2过表达载体通过电击法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105中，利用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11。转化的具体方法是将粳稻品种中花11未成熟种子带壳灭菌，在超净工作台上分离出未成熟胚，尖头朝下接种在诱导愈伤培养基N6D2上；暗培养6d后挑选生长旺盛，颜色浅黄的胚性愈伤组织，作为转化的受体；将带有过表达重组质粒的农杆菌EHA105菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，并用AAM培养基重悬；倒入愈伤组织浸泡15-20min，并不时摇动；侵染结束后的愈伤组织在N6D2C培养基上于28°C暗培养3d，然后分别在CXD2S1和CXD2S2选择培养基上进行两代筛选；将抗性愈伤组织转入CCA培养基上于24-26°C暗培养条件下进行预分化处理IOd ;经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基在25°C光培养下分化再生；再生小苗转入1/2MS培养基上生根壮苗；小苗在阴凉处用凉开水练苗3d后移入大田种植，按常规方法进行管理和收获。
[0022]参照Liu Q-Q, Chen X-H, Wang X-ff, Peng L-T, Gu M-H.A rapid simplemethod of assaying hygromycin resistance in transgenic rice plants.Journal ofAgricultural Biotechnology (农业生物技术学报)，2001, 9 (3):264-265 (in Chinese)所提供的方法对转基因再生植株进行潮霉素抗性检测，共获得了 16株转基因阳性植株。
[0023]采用RNAsimple总RNA提取试剂盒(Tiangen，DP419)分别提取野生型中花11和过表达转基因株系总 RNA,利用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser (TaKaRa, 047A)试剂盒所述方法反转录成cDNA，以基因编码区特异性引物0sABCl-2F和0sABCl-2R进行realtime PCR,以水稻Actinl基因作为内参。引物序列如下:
0sABCl-2F:5’ -AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3，
0sABCl-2R:5’ -AACAGCATACCGACCTAACC-3’ActinlF:5’ - CCCCTCCTGAAAGGAAGTA-3’
ActinlR:5’ -GGTCCGAAGAATTAGAAGCA-3，
PCR 反应利用 SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa, 820A)在 7500 realtime PCR 仪(Applied Biosystems)上进行。PCR体系为:2XSYBR位 Taq II 25 μ 1,10 μ molL 1上下游引物各2 μ 1, 50XROX Reference Dye II I yl,cDNA模板4 μ 1，灭菌蒸懼水16 μ I,总体积 50 μ I。
[0024]PCR条件为:95°C 30s 预变性；95°C 5s 变性，50°C 30s 退火，72°C 30s 延伸，40 个循环。
[0025]Realtime PCR结果表明，As仙67-之基因的表达上调了 3倍以上(图2)。田间种植的过表达转基因植株表型与野生型中花11无显著差异。然而过表达株系种子显著大于野生型(图3)。过表达株系种子粒长平均比野生型增加了 0.69 mm，粒宽平均增加了 0.36 mm,千粒重平均增加了 1.05 g (表1)，表中，粒长和粒宽为随机选择的30粒种子的平均值，千粒重为10个单株种子的平均值。
[0026]表I野生型中花η和OsABC卜2过表达转基因株系种子对比。_
【权利要求】
1.一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于，包括以下步骤: I) OsABCl-2基因过表达载体的构建 以野生型粳稻品种中花11 cDNA为模板，设计一对引物，扩增基因，引物序列如下:
0sABCl-20E-F:5’ -AAAAGGATCCCGCCCTCGCGATGTCGGCC-3’，
0sABCl-20E-R:5’ -AAAAACTAGTCCGATGGCTATGCTACAACG-3’， 在引物两端分别引入了限制性内切酶ifeMl I和分e I的识别位点；PCR扩增产物用胶回收试剂盒(TaKaRa，805A)纯化，并利用及I和分e I酶切后，连入用相同限制性酶切割的x￡AMBIA1301-UbiN0SmM ;重组质粒采用热击转化法转化大肠杆菌DH5 α，转化物在含卡那霉素的LB平板上筛选，挑选阳性克隆，提取质粒后测序验证正确，获得OsABCl-2过表达载体；其中，之基因序列如SEQ ID N0.1所示； 2 ) OsABCl-2过表达转基因植株的获得 将测序正确的过表达载体通 过电击法转入农杆菌菌株EHA105中；将粳稻品种中花11未成熟种子带壳灭菌，在超净工作台上分离出未成熟胚，接种在诱导愈伤培养基上；暗培养6d后挑选生长旺盛，颜色浅黄的胚性愈伤组织，作为转化的受体；将带有OsABC1-2过表达重组质粒的农杆菌EHA105菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，并用加入乙酰丁香酮的AAM培养基重悬后，倒入愈伤组织进行侵染；侵染结束后的愈伤组织在共培养基上培养3d，然后在含有50 mg I/1潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织，经两代筛选以后，将抗性愈伤组织进行预分化处理和分化再生；再生小苗转入1/2MS培养基上生根壮苗；小苗经练苗处理后移入大田种植。
2.根据权利要求1所述的调控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于:所述
基因表达蛋白的氣基酸序列如SEQ ID N0.2所不。
3.根据权利要求1所述的调控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于:用于realtime PCR检测OsABC1-2基因的特异性引物OsABCl_2F和OsABCl_2R，引物序列如下:
OsABCl-2F:5’ -AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3，
OsABCl-2R:5’ -AACAGCATACCGACCTAACC-3’。
【文档编号】C12N15/29GK103451228SQ201310421680
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】高清松, 杨立明, 刘廷武, 张云峰 申请人:淮阴师范学院