专利名称：水稻茎秆机械强度和粒重控制基因bc14及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，本发明涉及水稻茎秆机械强度和粒重控制基因BC14，该基因编码的蛋白质及其功能类似物，编码其的核苷酸序列，含有该核苷酸的载体和含有该载体的宿主细胞；另外，本发明还涉及控制植物茎秆机械强度和籽粒重量的方法。
背景技术：
植株茎秆的机械强度是植物、尤其是农作物重要的农艺性状。而茎秆的机械强度又与茎秆组织中相关细胞的细胞壁厚度直接有关，是组成植物细胞壁各种多聚物物理特性的综合体现。植物细胞壁是一种复杂的纤维网络结构，由不同的结构多糖、芳香族物质和蛋白质高度有序地组成[1](参考文献编号，以下同)，其结构对保持细胞形态，维持植株直立生长的机械支撑力具有重要作用。植物细胞壁的生物合成是一个非常复杂的代谢过程，涉及纤维素、木质素和一些非纤维素成分的合成途径。因此，细胞壁中纤维素、木质素等主要成分的合成与分布以及沉积是影响植株茎秆支撑力的主要影响因素。对不同细胞壁突变体的研究是揭示与茎秆机械强度有关的细胞壁生物合成生理生化以及分子生物学机理的有效途径。植物茎秆机械强度首先与纤维素的合成与沉积密切相关。1996年Pear等人对 EST随机测序，首先从棉花中克隆了植物纤维素合酶催化亚基CesA[2]。而纤维素合酶在植物体中行使功能最直接的证据则来自于对拟南芥突变体rsw的研究[3]，该突变体侧根发育异常，且纤维素含量大幅降低，从中以图位克隆的方法分离到拟南芥中第一个纤维素合酶催化亚基基因AtCesAl。生物信息学分析表明，CesA基因是一个庞大的基因家族，它的各成员之间具有极高的保守性M。近年来的研究发现，任何一个目前已克隆的CesA基因发生突变后，都会引起比较严重的表型，这暗示着植物基因组中存在着诸多CesA基因在功能上并不冗余，它们可能分别在不同的发育时期和部位起作用，也可能共同参与了同一个复合体的形成，协同作用完成纤维素的合成、晶体化和沉积[5]，但分子机理还很不清楚。关于纤维素的沉积，尽管目前已发现一些蛋白在纤维素的沉积中起着至关重要的作用，例如拟南芥脆性纤维基因FRAl(Fragile feber 1)编码的一个kenesin-like蛋白[6] ；FRA2编码的 Katanin-Iike蛋白m以及COBRA蛋白te]。但作为细胞壁最主要的组份，纤维素是高度有序并与细胞壁的其他组份有机连接在一起的，目前人们所了解的只是“冰山的一角”。此外，还有大量的糖基转移酶(GT)参与了非纤维素多糖和蛋白多糖的合成与修饰。以拟南芥为例， 预测具有415个GT[9]，但只有极少数被证明具有生化活性和功能[1°_12]。植物茎秆机械强度也与细胞次生壁的木质化有关。在拟南芥的研究中，发现一些木质化异常的突变体。如Jones在2001年[13]对一不正常木质部突变体irx4研究证实， 木质素代谢途径中的一个关键酶即肉桂酰辅酶A还原酶(Cirmamoy 1-CoAreductase，CCR)。 由于CCR基因的突变，导致木质素合成途径提前终止，细胞壁中木质素含量较正常植株减少了 50%，从而导致茎秆支撑力度的下降。
粒重是一个直接影响农作物产量的重要农艺性状，由籽粒大小和籽粒充实度两个因素决定，前者又决定于粒长、粒宽和粒厚三个要素。研究发现，水稻粒重是一个由多基因控制的复杂的数量性状，目前有较多QTL定位的报道，然而有关其形成的分子机制仍然知之甚少，相关的研究仅有少量零星的报道。2006年Fan等在第三染色体着丝粒区附近精细定位了一个控制水稻籽粒长度和粒重的主效QTL基因GS3，2009年Takano-Kai等人克隆了该基因。GS3编码一个跨膜蛋白，测序比较发现，与短粒水稻材料相比，所有的长粒水稻 GS3编码区都存在一个由“C”到“A”的碱基突变，导致编码蛋白在C端产生一个178个氨基酸的缺失，因此GS3被认为是控制水稻谷粒长度的一个负调控因子[14’w。2007年Song等通过图位克隆的方法在水稻第二染色体短臂端克隆了一个控制谷粒宽度和粒重的主效QTL 基因GW2，该基因编码一个新的RING-type E3 ubiquitin ligase，与泛素化降解有关。GW2 功能的缺失引起颖壳横向细胞数目增加，导致颖壳明显加宽、粒重显著增加[’16]。随后另一个控制水稻籽粒宽度和粒重的主效QTL基因GW5也通过图位克隆的方法获得(Shomura等， 2008[17] ；Weng等，2008[18])，该基因位于水稻第五染色体。GW5的缺失突变基因型也引起外颖横向细胞数目增加，并导致颖壳宽度和粒重的显著增加。GW5编码一个新的核蛋白，酵母双杂实验显示，该蛋白能与多聚泛素互作，预示着该基因也可能通过泛素化降解途径调控水稻籽粒颖壳的细胞分裂来控制水稻籽粒的大小。通过图位克隆的方法，2008年Wang等克隆了一个调控水稻籽粒充实度的基因GIF1，该基因定位在第四染色体上，编码一个细胞壁蔗糖转化酶，对于籽粒早期灌浆充实过程中的碳素营养分配具有控制作用。该基因功能缺失导致籽粒灌浆充实度降低，垩白增加，粒重降低[19]。综上所述，植物茎秆机械强度和粒重都是多基因控制的复杂性状，其机制目前仍不十分了解。
发明内容
针对上述研究背景，本发明的一个目的是提供一种控制水稻茎秆机械强度和粒重的基因，所述基因的核苷酸序列选自(1)编码SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻茎秆机械强度和粒重功能的核苷酸序列。严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7. 2， 7% SDS)中，65°C预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， PH 7.2,7% SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交16小时；弃杂交液，加入洗膜液 I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.2,0. 1% SDS)，65°C洗膜2次，每次10-15分钟；加入洗膜液 II (10mmol/L 磷酸钠缓冲液，pH 7. 2,0. 1% SDS)，65°C洗膜 10-15 分钟。本发明的控制水稻茎秆机械强度和粒重的基因优选具有如图6和SEQID NO :1所示的DNA序列。本发明的另一个目的是提供一种由本发明的控制水稻茎秆机械强度和粒重的基因所编码的蛋白质，所述蛋白质优选地具有如图7和SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本发明的再一个目的是提供一种含有本发明的控制水稻茎秆机械强度和粒重的基因的植物表达载体。在一个实施方案中，所述表达载体是如图4所示的BC14-BAC，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽。本发明的又一个目的是提供一种培育植物的方法，所述方法可使植物茎秆机械组织细胞壁的结构和成分发生改变，从而引起茎秆机械强度发生变化，同时所述方法还可使粒重发生改变，所述方法包括下列步骤用本发明的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。本发明公开的BC14基因是一个具有控制水稻茎秆机械强度和粒重的新基因，该基因的克隆和功能的揭示，将为了解水稻控制茎秆机械强度和籽粒的分子机制供了新的线索，对于提高水稻的产量水平和秸秆的合理利用将具有潜在的利用价值。关于序列表的说明SEQ ID NO :1是BC14基因的⑶S (氨基酸编码区DNA序列)序列；SEQ ID NO :2是BC14基因编码的氨基酸序列。
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。图1.水稻bcl4突变体的表型(1)(野生型(WT)和bcl4突变体(bcl4)的茎秆 (A)和叶片⑶的机械强度(拉断力)测定(表型1))；图2.水稻bcl4突变体的表型( (突变体bcl4与野生型(WT)的种子大小差异 (表型2)籽粒变小(A)、千粒重(千粒种子重量)降低(B))；图3. BC14基因的图位克隆(精细定位)；图4. BC14基因功能互补转化载体BC14-BAC的载体图谱；图5.BC14基因的功能互补验证(突变体bcl4、野生型(WT)与转基因互补系 (BC14-BAC)的表型比较茎秆拉断力(A)、叶片拉断力(B)、千粒重(C))；图6. BC14基因的⑶S序列(氨基酸编码区DNA序列)；图7. BC14基因编码的氨基酸序列；图8. BC14基因表达的RNA原位杂交分析；图9. BC14蛋白的⑶S表达谱分析；图10. BC14蛋白的亚细胞定位；和图11. BC14蛋白的核苷酸糖基转运活性测定。
具体实施例方式实施例1 :BC14基因的克隆1.水稻材料水稻(Oryzasativa ssp.)突变体 brittle culml4 (bcl4)，是原始野生型材料粳稻品种“黄金晴”的自发突变体材料(购自中国水稻所)。突变体与野生型相比，其主要表现为(1)茎叶变脆。与野生型相比，突变体茎秆和叶片的拉断力分别下降了约70%和46% (图1A，B)。( 籽粒变小、千粒重降低。突变体的籽粒与野生型相比明显偏小，从而导致突变体种子的千粒重仅为野生型的一半(图2A，B)。2.分析和定位群体纯合的BC14突变体和水稻品种Kasalath (购自中国水稻所)进行杂交，F1代自交，F2群体共得到192株隐性脆秆个体，并以此作为定位群体。在苗期每株取2克左右的嫩叶，用来提取DNA。3.通过简单重复序列(SSR，Simple Sequence R印eat)，序列标记位点(STS， Sequence-tagged Sites)，和酶切扩增多态性序列(CAPS，Cleavedamplified polymorphic sequence)标记定位BC 14基因。采用改进的CTAB方法_从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约 IOOmg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1. 5ml离心管里提取 DNA,获得的DNA沉淀溶解于100 μ 1超纯水中。每一个SSR、STS或CAPS反应用1 μ 1 DNA样品。4.BC14基因的初步定位对由50个&脆秆个体组成的小隐性定位群体，选用水稻12条染色体上相距约 20cM的多态性SSR引物进行连锁分析。结果表明第二染色体长臂端上的分子标记R1C62、 RM525与突变基因有明显的连锁关系，交换率分别为17%和23%，分子标记基因型分析表明，BC14定位于两者之间。在两标记之间进一步发掘多态性分子标记，将BC14基因定位在 SSR标记RM3515和RM13617之间约8151Λ基因组区间内。(引物序列见表1)5.BC14基因的精细定位利用初步定位的两个SSR标记RM3515和RM13617对剩余的142个F2脆性单株进行基因型鉴定，分别发现6个和11个交换株。在两标记之间进一步开发了一系列新的具有多态性的分子标记Sl 5(序列见表1)，利用这些标记对RM3515和RM13617的全部交换单株进行基因型鉴定，结果发现Sl和S2具有与RM3515 —致的3个交换株，而S3、S4和S5 分别具有1个、4个和4个与RM13617 —致的交换单株。最终将BC14基因精细定位在STSR 标记S2和S3之间57Kb区间范围(图3)表1克隆BC14基因所用引物序列
分子标记正向引物序列反向引物序列分子标记类型RM262CATTCCGTCTCGGCTCAACTCAGAGCAAGGTGGCTTGCSSRRM525GGCCCGTCCAAGAAATATTGCGGTGAGACAGAATCCTTACGSSRRM3515GGAAAGAAGAiTATGCCATGCAGAGAGAATCAGAAACACCAACSSRRM13617ACCATATAGCGTGTATGCAACCTGCACACATGTACACAGTACACCSSRSlCTCGGGAAGCGGTGGGATTAGCTCTGCCAATAGCGGCSTSS2ATGGGATTCGCCTAGACACCCAGAGAAGAATACGAGTCCGACSTSS3GGAACTCGGAAGCAGTGGAGAAACGCTCGCTGCCTCASTSS4TGTCTACGAAGACACGAAACACGAGAAGGCGGCAATAAGGTTSTSS5TAAAAGTGGAGTCATCCGTCCGAGTCCAGATGTTCGCAAGGSTS6. BC14基因的克隆、全长cDNA的获得和编码蛋白结构与功能预测对精细定位的571Λ区段内的候选开放阅读框(ORF)进行了详细的调查，发现该基因组范围内共包含6个0RF。为了确定BC14基因，我们对野生型和突变体的6个ORF进行了测序分析，发现在0RF3的基因组序列中，除了若干在内含子区的核苷酸多态性位点外，在编码区898位存在从胞嘧啶核苷酸(C)到胸腺嘧啶核苷酸(T)的点突变，该突变可导致0RF3编码的第330位亮氨酸(Leu)突变为脯氨酸(ftx))。为了进一步确认该位点是 bcl4的突变位点，而不是天然的核苷酸多态性位点，针对该位点所在的片段，在多个籼稻和粳稻品种中进行了测序分析，发现该位点在不同的籼稻和粳稻品种中相当保守。因而推测 0RF3 (L0C_0s02g40030)是 BC14 的候选基因。通过与KOME中BC14的全长cDNA序列的比对，我们发现BC14基因组序列全长 4114bp，含有10个外显子和9个内含子(图:3B)。cDNA全长1041bp(图6)，编码346个氨基酸(图7)，预测分子量为37183. 9道尔顿，而等电点(pi)为9. 6238。对NCBI非冗余蛋白质数据库的Blast分析发现BC14蛋白在植物中相对比较保守，与植物中的同源蛋白质间的一致性可以达到约65%，而与动物中同源蛋白(如 HsUGTrel7, CeSQV_7和DmFRC)间只有很低的保守性，一致性不超过32%。然而，植物中还没有相关同源基因的功能分析报道。由于BC14基因在动物中的同源基因均为核苷酸糖基转运蛋白(NST)，这意味着BC14蛋白很可能也是转运核苷酸糖基的转运蛋白。各种生物信息学软件预测表明，BC14属于TPT家族成员。而且核苷酸糖基转运蛋白是该PF03151蛋白家族的亚家族，这与氨基酸序列相似性分析结果相一致。实施例2BC14的功能互补及转基因研究为了验证L0C_0s02g40030 (0RF3)就是BC14基因，将水稻BAC克隆 0sJNBb0116L05(购自上海生命所)质粒分别用限制性内切酶Hind III和)(ba I酶切释放出BC14的全部基因组片段，共10748bp，包含起始密码子ATG上游的4996个碱基、编码区的3675个碱基和终止密码子TAG后的2077个碱基。将该基因组片段插入到双元载体 pCAMBIA1300(购自CAMIA公司，澳大利亚)中的Hind III和)(ba I位点间，从而获得了用于转化的BC14基因功能互补转化载体BC14-BAC(图4)。质粒通过电击的方法转入农杆菌 (AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105 (购自CAMIA公司，澳大利亚)中并转化突变体 bcl4，其过程如下1.水稻幼胚培养.将bcl4突变体的幼胚脱壳，70%乙醇表面消毒;3min后，用 0. 1 %氯化汞5分钟，10%次氯酸钠溶液浸泡20分钟，无菌水冲冼3-4次，点播于NB培养基上诱导愈伤组织，20天左右从成熟胚盾片处长出的愈伤组织继代于NB培养基上，以后每2 周继代一次，每次继代时都挑选色泽淡黄较致密的胚性愈伤组织。2.农杆菌培养._70°C保存的农杆菌菌株接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养基上，2648°C，150rpm暗培养16-18小时活化菌种，YEP固体培养基上划平板，于暗培养1天，挑取单菌落于YEP液体培养基中，2648°C，150rpm悬浮培养 16小时，倒入250ml离心管中4000rpm离心收集农杆菌菌体，并用液体培养基悬浮菌体至 0. D600为0. 8-1. 0，用于各种水稻材料的转化。3.水稻材料与农杆菌的共培养.水稻愈伤组织在与农杆菌菌液感染前均需先在新鲜的继代培养基上培养4天后，才可用于转化。转化时先将经预培养4天的愈伤组织转移到IOOml无菌三角锥形瓶中，然后将适量农杆菌悬浮液倒入(保证有足够的菌液把材料淹没)上述含有水稻材料的锥形瓶中，室温下放置20分钟，并不时晃动，然后将水稻材料取出，在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的NB-AS固体培养基(加入 100 μ M 乙酰丁香酮 AS 的 NB 培养基)(NB basic+10mg/L glucose+2mg/l 2， 4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)+500mg/l proline+500mg/lglutamine+300mg/lcasein hydrolysate+100mg/l Inositol+lOOuM AS+3g/lPhytagel, pH 5.8)上，在 26°C条件下暗培养2-3天。共培养后，从固体共培养培养基上取出转化过的水稻材料，转入含有 50mg/L潮霉素的选择培养基上进行筛选培养。4.抗性愈伤组织的筛选及植株再生。第一轮选择2周后，转到第二轮选择培养基上继续筛选2周，然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基(MS basic+16g/ 1 sobitol+lg/1 casein hydrolysate+100mg/lInositol+5mg/L ABA+2mg/L 6-KT+O. 5mg/ L NAA+250mg/l cefotaxime+30-50mg/l hygromycin 3g/l Phytage1, pH 5.8)或直 接转移到分化培养基(MS basic+16g/l sobitol+lg/1 casein hydrolysate+100mg/l Inositol+2mg/L 6-KT+O. 5mg/L NAA+250mg/l cefotaxime+30-50mg/l hygromycin 3g/l Phytagel, pH 5. 8)上分化(16小时光照/天)，再生的小苗在V2MS上生根壮苗，随后移入温室。共获得互补转化载体BC14-BAC的转基因株系18个，无论是茎秆和叶片的拉断力 (图5A和5B)，还是粒重(图5C)，均完全恢复了野生型的表型。这一结果证明该基因具有调节水稻茎秆机械强度和粒重的作用。实施例3 :BC14的器官与组织表达特性研究1. BC14基因的mRNA组织原位杂交分析利用带有EcoR I和Kpn I的限制性内切酶位点的引物从野生型的cDNA中扩增出 BC14基因cDNA的289-594bp片段。所用引物序列如下正向5'-CRRatccRRtaccTTTACAAATAGCGAGCCATCC-3'反向5,-gtctagaattcCCCACGAGCATCAAACGAC_3，94°C预变性5分钟，94°C 1分钟，60°C 1分钟，72°C 0. 5分钟，35次循环，72°C延伸 10分钟获得PCR产物，将PCR产物连接到T-easy载体(购自！Iomega)，然后通过电击法将连接产物转化DH10B感受态细胞(购自北京天庚生物科技有限公司)，测序挑选序列完全正确的克隆。从远离T7或SP6启动子一侧的多克隆位点区域选择限制性内切酶I^t I 把质粒线性化，取1 μ g线性化的质粒DNA作为制备正义或反义RNA探针的模板。采用DIG Northern Starter Kit (2039672，Roche)，按照使用说明，制备地高辛标记的RNA探针。制备好的RNA探针在60°C IOOmM碳酸盐缓冲液(pH10. 2)中裂解80min，水解后的探针使用浓度为 2μ g/ml。水稻材料在4%多聚甲醛中4°C固定过夜。固定后的组织经脱水、透明、透蜡后包埋在石蜡(Sigma)中。用切片机(RM2145，LEICA)将包埋的组织切成7_10 μ m，铺在预先用多聚-L-赖氨酸处理的载玻片上(P0425，Sigma)上展片，然后在42°C烤片台上烘烤过夜。 切片经二甲苯脱蜡和酒精梯度复水，0. 125mg/ml链蛋白酶37°C处理30min，重新固定后风干。将固定在载玻片上的切片用2父35(漂洗&1^1后，701变性301^11，1(^8/1111蛋白酶K 室温消化30min，再加入4%多聚甲醛后固定lOmin。随后依次用3XPBS、1 XPBS和三乙醇胺漂洗后，向三乙醇胺溶液中加入乙酸酐剧烈搅拌并再次将切片放入三乙醇胺溶液中孵育 5min，依次用2XSSC、50%、70%和100%乙醇中漂洗和脱水，并晾干。 每张载玻片上滴加60 μ 1的RNA探针，48 V杂交过夜。载片在45 °C下用2 X SSC (用 50%甲酰胺溶液稀释)漂洗2次，并依次用2X马来酸室温平衡15分钟、0.5X马来酸(含 0. 3% Tween 20) 65°C孵育1小时、1 X马来酸(含0. 3% Tween 20和封闭液)室温孵育1小时。向每张载片上加入80 μ 1碱性磷酸酶偶联地高辛抗体(购自Roche公司)，37°C孵育2小时，在含有封闭液的IX马来酸溶液中漂洗3次，每次1小时。然后在含有 0. 34mg/ml 氮蓝四唑盐(nitroblue tetrazolium(购自 Sigma 公司)和 0. 175mg/ml 5-溴 4-氯-3-吲哚-磷酸甲苯胺盐(5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate toluidinium salt(购自Sigma公司)的漂洗液中温育1-2天。用IOmM Tris, ImM EDTA (pH 8.0)终止显色反应，风干后用50%甘油封片。在显微镜下观察并用CCD相机拍照。原位杂交实验发现BC14基因在幼嫩叶片(图8A)、幼茎(图8B，C)、幼根(图8D) 及细嫩茎秆(图8E)等组织的维管束中或厚壁组织处在大量表达。作为实验负对照，其正义链探针在细嫩茎秆中没有检测到明显的杂交信号(图8F)，证明BC14基因主要在水稻机械组织(主要由厚壁细胞和维管束组成)中表达。这与其可能参与细胞壁合成的功能预测相一致。2. BC14基因融合⑶S表达的转基因材料分析在BC14-BAC互补转化载体(图4)的基础上构建BC14基因融合⑶S表达载体。首先利用巢式PCR扩增在TAG终止密码子前引入BamH I酶切位点(首先BC14PstIF+BC14BmR 和BC14BmF+BC14KpnIR进行PCR扩增，将PCR产物混合后，再以BC14PstIF+BC14KpnIR进行 PCR扩增)。将最终PCR产物连接到pGEM Teasy后通过载体上T7和SP6引物进行测序验证。然后通过I3St I和Kpn I双酶切将该片段替换BC14-BAC载体上的相应片段。将GusA 基因用带BamH I酶切位点的GusABmF和GusABmR进行PCR扩增，连接到pGEM Teasy后经测序验证后，以BamH I酶切克隆到改造后的BC14-BAC载体上，形成pBC14⑶S载体。将该质粒电击转化农杆菌EHA105感受态，挑选阳性克隆用于水稻转化。以上克隆相关的引物序列如下BCHPstIF 5' -TTTCTGCAGGATTTCTTCACC-3‘BC14BmF 5' _aag収atccTAGATACGGATGTCCAGTGG-3‘BC14BmR 5' -ctaggattcCTTCCCTTTGATCTTGCA_3’BC14KpnIR 5' -RRtaccGGTTCAGTGGTTTATCCACCTT~3‘GusABmF 5' -GGATCCATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC-3‘GusABmR 5' -GGATCCTTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3‘经抗性筛选获得转基因植株。Ttl代转基因植株为野生型表型，说明BC14-GUS具有天然BC14基因的活性。然后取野生型表型的Tl代转基因幼苗和成株的不同组织进行GUS 组织化学显色反应。具体程序为将水稻材料浸入到⑶S显色液(500ug/ml X-Gluc, IOmM EDTA,lOOmMsodiumphosphate(ρΗ7· 0)，0. 5mM K4Fe(CN)6,0. 5mM K3Fe (CN)6,0. 1 % Triton X-100)中，在37°C适当显色后，依次用30%、50%和70%乙醇脱色，在体视镜(Leica)上用 CCD相机拍照。对GUS显色后的水稻茎杆节间进行徒手切片，然后用50%甘油封片后在普通光学显微镜(Leica)下观察并用C⑶相机拍照。⑶S显色发现，⑶S信号主要集中在叶片的叶枕部(图9A)、幼根的中央维管束(图 9B)及幼嫩叶片的维管束中(图9C)。同时对成株的幼嫩茎秆进行了 GUS染色，发现有明显的信号，徒手切片观察发现在厚壁细胞和维管束中显色较深(图9D和E)。GUS表达分析表明BC14基因在不同组织的主要的机械组织厚壁细胞和维管束中都有表达，与RNA原位杂交分析的结果相一致。GUS融合表达和RNA原位杂交实验分别从翻译水平和转录水平上都证明BC14基因主要在机械组织表达。这与bcl4突变体在次生壁的严重缺陷表型相一致，也说明BC14基因可能是次生壁合成相关的重要基因。实施例4 :BC14蛋白的亚细胞定位研究通过PCR弓丨物BCHSalF和BC14NcoR扩增BC14基因的cDNA，同时引入SalI和Kpn I酶切位点。将最终PCR产物连接到pGEM Teasy后通过载体上T7和SP6引物进行测序验证。然后通过Ml I和Nco I双酶切将BC14基因克隆到GFP瞬时表达载体35SCGFP (购自 Clontech公司)上。挑取阳性克隆经过酶切和测序验证后，形成BC14-CGFP。然后通过类似的方法以KpnI和SpeI将BC14基因克隆到35S-NGFP瞬时表达载体(购自Clontech公司)上，形成NGFP-BC14载体。相关的引物序列如下BCHSalF 5' -tgtcgacATGGCGAAGGGAGGG-3’BC14NcoR 5' -tccatggcCTTCCCTTTGATCTTGC~3’BC14KpF 5' -tggatccATGGCGAAGGGAGGG-3’BC14SpR 5' -tactagtCTACTTCCCTTTGATCTTGC~3’将构建好的BC14-CGFP和NGFP-BC14载体分别转化水稻原生质体，通过激光共聚集显微观察研究BC14蛋白的亚细胞定位。具体程序为将37°C萌发的水稻种子播种在PCR板上于暗中培养7-9天。取出幼苗，用蓝吉列刀片顺脉方向连续拉，并浸在0.6M marmitol中平衡lOmin。用200目筛子过滤后，将切碎的组织投入配制的酶液
中，抽真空 5min，在摇床(80rpm)上裂解 4hr。经 200目筛子过滤，将悬浊液装入7ml离心管中，以600rpm离心3-5min后弃掉上清，用aiil W5 溶液(154mMNaCl，125mM CaC 12,5mM KCl,2mM MES(pH 5.7))和预冷的 2ml Mmg溶液(0· 6M mannitol, 15mM MgC12,4mM MES (pH 5. 7))分别洗涤一次后，弃上清重加入^iilMmg溶液，充分悬浮，冰浴30min。然后600rpm离心收集原生质体沉淀。每IOOul原生质体，依次加入 20ul纯化的瞬时表达质粒，和120ul 40% PEG，充分混勻，室温放置20min。然后加入Iml W5溶液，混勻后转移到六孔培养板，再加入Iml W5，在培养过液。次日，提篮离心收集原生质体，即可用于激光共聚集显微观察。激光共聚焦显微观察结果，BC14蛋白C端和N端的GFP融合的GFP荧光信号都与标记高尔基体的Man49-RFP的RFP荧光信号高度重合(图10)，表明BC14蛋白定位在水稻高尔基体。实施例5 :BC14蛋白的体外表达和功能验证1. BC14表达载体的构建利用带有Kpn I和Spe I的限制性内切酶位点的引物从野生型的cDNA中扩增出 BC14基因，同时引入His标签。所用引物序列如下正向5'-TGGTACCatRcatcatcaccatcaccacRRcATGGCGAAGGGAGGG-3'反向5,-TACTAGTCTACTTCCCTTTGATCTTGC-3’94°C预变性5分钟，94°C 1分钟，60°C 1分钟，72°C 4分钟，35次循环，72°C延伸10 分钟获得PCR产物，将PCR产物连接到T-easy载体(购自！Iomega)，然后通过电击法将连接产物转化DH10B感受态细胞，测序挑选序列完全正确的克隆。通过Kpn I和Spe I酶切插入到具相同酶切位点的酵母表达载体PYES2 (购自Biovector公司)中，测序验证其编码框的正确性，形成PYES2-BC14载体。2.BC14蛋白的表达将构建好的pYES2-BC14质粒，利用质粒提取试剂盒(购自上海申能博彩生物科技有限公司)纯化好后，利用PEG/LiAc转化酵母菌株233Mc[21]中进行表达。挑含pYES2_BC 14酵母单菌落到SD-U液体培养基中在30°C摇床上200rpm培养至0D_为3。然后800g离心IOmin收菌，用诱导培养基(加入了诱导剂2%半乳糖的缺脲嘧啶(uracil)的SC培养基)悬起，在30°C以200rpm培养过夜。800g离心IOmin收菌，用含溶壁酶(购自北京天庚生物科技有限公司)的原生质球缓冲液(spheroplastbuffer)悬起，于37°C水浴池。然后 800g离心IOmin收集原生质球。用冰浴的膜缓冲液悬起，然后用勻浆器裂解原生质球。依次用IOOOg(IOmin)、8000gQOmin)和IOOOOOg(60min)离心，最终获得富含高尔基体囊泡的 P3组分。以Bradford法确定组分的蛋白质浓度。3. BC14-GFP融合蛋白的功能对NCBI非冗余蛋白质数据库的Blast分析发现，BC14蛋白与动物中的一些核苷酸糖基转运蛋白(NST)具有一定的同源性，因此我们将在酵母细胞中表达的BC14蛋白进行体外核苷酸糖基转运活性分析，具体步骤如下将50 μ g P3组分蛋白和0. 3 μ Ci放射性标记底物 Uridinediphosphate glucose [glucose_6」H]力口入至Ij 40 μ 1 反应缓冲液(0. 8Μ Sorbitol, IOmM Tris, 2mM MgC12)中，然后置于30°C水浴8min。用400 μ 1冰浴的终止缓冲液终止反应后，过硝酸纤维素滤膜。并用10倍体积终止缓冲液洗滤膜。将滤膜转移到2mL 管中，完全干燥后添加1.8mL闪烁液(Optiphase supermix，PE)，并使用闪烁仪测定放射性活性。图11显示，与阴性对照比较，BC14的确具有一定的UDP-Glc的转运活性，证明BC14 为一种核苷酸糖基转运蛋白。参考文献1. Bacic, A. , et al. Edi :Priess, J. The biochemistry of plants. New York, Academic Press,14 :297-3712. Pear, J. R.，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996,93 :12637-126423. Arioli, Τ. , et al. Science. 279，717-720.4. Richmond, T. A.，et al. Plant Physiol. 2000，124 :495-498.5. Taylor, N. G.，et al. Plant Cell. 2000，12 :2529-2540.6. Zhong, R.，et al. Plant Cell. 2002，14 :3101-3117.7. Burk, D. H.，et al. Plant Cell. 2001，13 :807-827.8. Roudier, F.，et al. Plant Cell. 2005，17 :1749-1763.9. Scheible, W. R. , et al. Curr Opin Plant Biol. 2004，7 :285-295.10. Sarria, R.，et al. Plant Physiol. 2001，127 :1595-1606.11. Faik，A.，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002，99 :7797-7802.12. Madson, M.，et al. Plant Cell. 2003，15 :1662-1670.13. Jones, L.，et al. Plant J. 2001,26 :205-21614.Fan, C.，et al. Theor Appl Genet. 2006，112 :1164-117115Takano-Kai, N.，et al.Genetics. 2009，182 :1323-133416Song, X. J.，et al. Nat. Genet. 2007，39 :623-630
11
17Shomura, Α.，et al. Nat. Genet. 2008,40 :1023-102818ffeng, J. F.，et al. Cell Research. 2008，18 :1199-120919ffang, Ε. T.，et al. Nature Genetics. Nat. Genet. 40 :1370-7420. Li X，et al. Nature. 2003，422 (6932) :618-62121. Fadi A. S, et al. Genetics. 2004，166 :1727-1739
权利要求
1.一种控制水稻茎秆机械强度和粒重的基因，该基因的核苷酸序列选自(1)编码SEQID NO :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制植物茎秆机械强度功能的核苷酸序列，所述严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液中，所述预杂交液是0. 25mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7. 2,7% SDS，在65°C预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液，所述杂交液是0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.2,7% SDS，同位素标记的核苷酸片段，在65°C杂交16小时；弃杂交液，加入洗膜液I，所述洗膜液I是20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7. 2,0. 1% SDS，在65°C洗膜2次，每次10-15分钟；加入洗膜液II，所述洗膜液II 是IOmmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7. 2,0. 1% SDS，在65°C洗膜10-15分钟。
2.按照权利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQID NO :1所示的DNA序列。
3.一种由权利要求1或2所述的核苷酸序列编码的蛋白质。
4.按照权利要求3所述的蛋白质，其特征在于它具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
5.一种植物表达载体，其含有权利要求1或2所述的控制水稻茎秆机械强度和粒重基因。
6.按照权利要求5所述的表达载体，所述表达载体是BC14-BAC。
7.一种改变植物的茎秆机械强度的方法，其特征在于包括下列步骤用按照权利要求5或6所述的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。
8.一种改变植物的籽粒重量的方法，其特征在于包括下列步骤用按照权利要求5或6所述的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述植物是水稻。
10.根据权利要求1或2所述的基因、根据权利要求3或4所述的蛋白质、或根据权利要求5或6所述的表达载体在改变植物的茎秆机械强度和/或籽粒重量中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种可控制水稻茎秆机械强度和粒重的基因，该基因的核苷酸序列选自(1)编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)与(1)中的核苷酸序列能够在严谨条件下杂交，并同时编码具有控制水稻茎秆机械强度和粒重功能的功能类似物。本发明还提供了编码该蛋白质的基因，含有该基因的表达载体，和利用该表达载体改变植物茎秆机械强度和粒重的方法。
文档编号C07K14/415GK102344927SQ20101024010
公开日2012年2月8日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者周奕华, 张保才, 钱前 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所