高抑制平滑肌细胞增生活性的大片段肝素寡糖分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备高专一性大分子肝素寡糖的简单方法。该方法包括如下步骤：1）限制性酶解肝素；2）大分子肝素寡糖分离；3）大分子肝素寡糖的生理学活性。本方法通过一种简单的制备分离方法,获得了抗平滑肌细胞增生活性显著提高的大分子肝素寡糖片段,这种片段的特点是抗平滑肌细胞增生活性比肝素高得多,而抗肿瘤活性变化不大,抗凝活性大大降低。这对开发专一活性的肝素寡糖药物具有巨大的潜力。
【专利说明】高抑制平滑肌细胞增生活性的大片段肝素寡糖分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及具有专一抑制平滑肌细胞增生活性的大片段肝素寡糖分离方法。
【背景技术】
[0002]肝素是糖胺聚糖家族中一种高度硫酸化的重要成员。它在肥大细胞中合成后，被运输到各种组织器官中，因此其在生物体内广泛存在。生物体内肝素单链的分子量高达60，000 — 100，OOODa，许多条肝素链又通过肽段连接，形成巨大蛋白聚糖分子。商用肝素分子量是由上述的糖胺聚糖降解而来的，巨型糖链在生产过程中多处被打断，形成了分子量范围大约在5000 - 25000Da之间产品。由此可以看出，肝素是由不同长度的混合链组成，链与链之间则又有差异，导致了肝素组分的高度异质性。根据对肝素链的组成和寡糖序列分析，现在已经基本清楚肝素的总体结构和组成。链中主要以糖醛酸残基(L-1duixmicacid, IdoA; D-glucuronic acid, GlcA)和六糖胺(D-glucoamine)形式交替出现。
[0003]肝素最早的临床用途是作为抗凝和抗血栓出现的。后来研究表明它还有抗平滑肌细胞增生、抗炎症、调节人体免疫功能等生物活性。同时它可以治疗和预防因外伤、哮喘、动脉粥样硬化、高血压、充血性心力衰竭、肺出血、肾炎综合症、急性肾小球肾炎、小儿先天性心脏病等引起的平滑肌增生，预防血管狭窄，避免或减少小儿和成人肺动脉高压症，预防和治疗冠心病和心肌梗塞 患者经冠状动脉“搭桥术” “球囊扩充术” “安装支架术”和脑栓塞患者经“颅内血管分流术”平滑肌增生引起的心，脑血管再狭窄症(restenosis)。因此肝素具有多种药用的潜力。但是，肝素作为一种高度硫酸化的多糖，在使用过程中会引起明显的出血症状，这一主要的副作用限制了肝素的临床应用。
[0004]解决这一问题的途径在于分别明确肝素中起抗凝活性的寡糖片段的结构和其它生物学活性的片段结构。
[0005]到目前为止，肝素的抗凝活性寡糖片段是唯一被阐明的结构。它是一个含有3-0 一硫酸基团五糖片段。
[0006]肝素五糖与抗凝血酶的作用包括两个步骤:首先，五糖序列中非还原端三糖序列与ATIII形成一个低亲和性的识别复合物，诱导ATIII构象变化导致高亲和性复合物的形成。三糖序列能够完全激活ATIII，还原端的二糖序列对激活过程并不重要，但是它能稳定激活后的构象。
[0007]除此而外，肝素的结构中其它生物学功能的结构域尚不清楚。
[0008]特别是，某些具有高专一性生理活性的肝素寡糖混合物尚很难用简单的方法制备，制约了肝素寡糖药物的研制步伐。
【发明内容】
[0009]本发明的一个目的是提供一种制备具有专一的抑制平滑肌细胞增生活性的大片段肝素寡糖药物的简单方法，以及用该种方法制备的大片段肝素专一高效抑制平滑肌细胞增生活性的能力。[0010]本发明所提供的制备具有抑制平滑肌细胞增生活性的肝素片段的方法，包括如下步骤:
[0011]1.肝素酶的制备；
[0012]2.肝素酶限制性裂解肝素底物；
[0013]3.超滤膜分离有效肝素寡糖混合物；
[0014]4.肝素寡糖混合物的抗平滑肌细胞活性；
[0015]5.肝素寡糖混合物的抗肿瘤活性；
[0016]6.肝素寡糖混合物的抗凝血活性。 【具体实施方式】
[0017]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0018]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0019]1.肝素酶制备:
[0020](I)将所述发酵銷氛醇杆菌(Sphingobacterium sp.HC-6155) CGMCC N0.0660 接种于发酵培养基中，30°C培养40小时，离心收获菌体；
[0021]所述发酵培养基组成由NaCl、K2HPO4、MgSO4、肝素、大豆粉和水组成，NaCl在培养基中的浓度为I克/L，K2HPO4在培养基中的浓度为2.5克/L，MgSO4在培养基中的浓度为
0.5克/L，肝素在培养基中的浓度为2克/L，大豆粉在培养基中的浓度为2克/L。
[0022]2)用渗透压稳定液悬浮所述菌体，12，000r/min离心20分钟，去掉上清液；再用低盐溶液悬浮所述菌体，12，000r/min离心20分钟，收集上清液，记作上清液I ;最后用高盐溶液再次悬浮所述菌体，12，000r/min离心20分钟，再次收集上清液，记作上清液II ;合并所述上清液I和所述上清液II，得到肝素酶粗酶液；
[0023]低盐溶液是将2mmol MgSO4溶解于lL20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得到的；
[0024]高盐溶液是将300mmol NaCl溶解于IL的IOmM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得到的；
[0025]渗透压稳定液是20% (质量百分含量)蔗糖的水溶液。
[0026]3)将所述肝素酶粗酶液依次用SP Sepharose? XL强阳离子交换凝胶和S0URCE?30S强阳离子交换凝胶进行纯化；
[0027]用SP Sepharose? XL强阳离子交换凝胶进行纯化的方法中，包括如下洗脱步骤:以NaCl浓度为0.12M的磷酸盐缓冲液作为起始液，以NaCl浓度为0.18M的磷酸盐缓冲液作为终止液，进行线性梯度洗脱，洗脱时间为120分钟，所述洗脱过程中NaCl浓度梯度变化速率恒定，每次收集2ml洗脱液，收集NaCl浓度为0.16M的磷酸盐缓冲液所洗脱下来的溶液；
[0028]用S0URCE?30S强阳离子交换凝胶进行纯化的方法中，包括如下洗脱步骤:以NaCl浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液作为起始液、以NaCl浓度为0.15M的磷酸盐缓冲液作为终止液，进行线性梯度洗脱，洗脱时间为120分钟，所述洗脱过程中NaCl浓度梯度变化速率恒定，得到纯化后的肝素酶。
[0029]2.大片段肝素寡糖制备:[0030]肝素底物溶液的组成:将2g肝素溶于100ml20mM pH7.4的磷酸盐缓冲液中，得到肝素底物溶液。
[0031]酶解方法:将100ml肝素底物溶液和20mg肝素酶(肝素与肝素酶的投料比为IOg:0.1U肝素酶)，放置于密封容器中，25°C水浴温和振荡(转速为150转每分钟);间隔2小时取样测定酶解产物在波长下的吸光度值A232nm的变化，直至酶解产物的吸光值达到0.3 —
0.5)。
[0032]将酶解产物用截留分子量为8，OOODa的超滤膜超滤，取滤出液；将滤出液用截留分子量为5，OOODa的超滤膜超滤，取被截留部分；得到酶解产物中分子量范围在5000Da —SOOODa之间的组分，即为大片段肝素寡糖，冷冻干燥，备用。
[0033]3.凝胶电泳分析:
[0034]将肝素和大片段肝素寡糖分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用凝胶浓度为20%，电泳结束后，用0.08%的天青A染色直到有清晰条带出现，立即用蒸馏水冲洗除去多余染液，结果如图1所示。图1中，第I泳道是肝素的分子分布；第2泳道是低分子量肝素的分子分布;第3泳道是大片段肝素寡糖的分子分布；
[0035]4.抑制平滑肌细胞增殖活性检测
[0036]胎儿脐带动脉 平滑肌细胞购自ScienCell Research Laboratories (美国圣地亚哥，产品目录号为8030 ;平滑肌细胞完全培养液购自ScienCell ResearchLaboratories (美国圣地亚哥)，产品目录号为09211 ;不含胎牛血清(10%FBS)的培养基购自ScienCell Research Laboratories (美国圣地亚哥)，产品目录号为09011 ;
[0037]采用96孔板培养胎儿脐带动脉平滑肌细胞以及测试肝素寡糖的抗平滑肌增生活性。具体操作如下:
[0038]肝素组:取生长状况良好的对数生长期胎儿脐带动脉平滑肌细胞，胰酶消化后离心获取细胞，并进行细胞计数。将细胞重新溶于平滑肌细胞完全培养液，稀释细胞浓度至2.5X104cells/mL.向包被过的96孔板中接种细胞，每孔接种200 μ I浓度为2.5X104cells/ml的细胞悬液。接种细胞后的96孔板在培养箱中静置24h，保证平滑肌细胞贴壁充分并将96孔板中培养基吸去，加入200 μ I不含胎牛血清(10%FBS)的培养基，再加入肝素，肝素在不含胎牛血清(10%FBS)的培养基中的终浓度为0mg/ml，0.05mg/ml, 0.lmg/
1,0.2mg/l, 0.5mg/l, 1.0mg/l,每个浓度设5个重复孔,加入肝素后将96孔板置于细胞培养箱中进行培养，肝素作用时间为48小时或者72小时，然后进行MTT实验，测定492nm吸光度。
[0039]大片段肝素寡糖组:与肝素组相同，不同的是将肝素替换成肝素酶解产物，肝素酶解产物的在不含胎牛血清(10%FBS)的培养基中的终浓度为0mg/ml，0.05mg/ml, 0.lmg/
I,0.2mg/l, 0.5mg/l, 1.0mg/lo
[0040]对照组:方法与肝素组相同，不同的是未加肝素。
[0041]抑制率的计算公式:
[0042]抑制率(%) = (B-A) 100%/A;A为对照组在0D492nm处的吸光值，B为各实验组在0D492nm的吸光值。
[0043]实验设3次重复。实验设3次重复，结果取平均值土标准差。结果如图2所示。
[0044]结果表明:当加药浓度为0.05mg/ml时，肝素对平滑肌细胞的抑制率为13.1±5.7%，大片段肝素寡糖对平滑肌细胞的抑制率为10.67±1.13%;当加药浓度为
0.2mg/ml时，肝素对平滑肌细胞的抑制率为18.1±4.9%，大片段肝素寡糖对平滑肌细胞的抑制率为46.16±3.18% ;当加药浓度为0.5mg/ml时，肝素对平滑肌细胞的抑制率为32.4±5.1%，肝素酶解产物对平滑肌细胞的抑制率为70.13±2.98%。
[0045]经过统计学分析，表明:大片段肝素寡糖与肝素在低浓度用药条件下，抑制平滑肌细胞增生的活性没有显著差异；而高浓度条件下，大片段肝素寡糖的抗平滑肌增生活性显著提高。
[0046]5.抗肿瘤活性分析
[0047]实验组:1)在37°C，5%C02浓度的条件下，静态培养K562细胞，平均两天换一次液，四天传一次代。2)接种细胞:用完全培养液配成105/ml的细胞悬液，以每孔600ul的体积将对数期细胞接种到24孔板。一组对照，九个实验组，每组三个孔。3)培养细胞:370C，5%C02浓度的条件下，培养24h，使细胞适应新环境。4)加药:向各孔中分别加药，各药品在培养基中的终浓度分别为Omg/1, IOOmg/1, 250mg/l, 500mg/l ;药品为肝素、肝素酶解产物。5)显色:培养48h天后，弃培养液，用PBS洗一次。每孔加0.5mg/ml的MTT溶液600ul。继续孵育4小时，终止培养，将悬浮细胞离心后弃上清液。每孔加450ul 二甲亚砜(DMS0)，振荡，使结晶物充分融解。6)比色:选择492nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以药品在培养基中的终浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制细胞生长曲线。
[0048]对照组:方法与实验组相同，不同的是未加肝素、肝素酶解产物。
[0049]抑制率的计算公式为:
[0050]抑制率(%) = (B-A) 100%/A;A为对照组在0D492nm处的吸光值，B为各实验组在0D492nm的吸光值。
[0051]实验设3次重复，结果取平均值土标准差。结果如图3所示。
[0052]结果表明:对测定数据进行分析，表明，大片段肝素寡糖的抑制肿瘤细胞K562活性没有明显变化。
[0053]6.抗凝活性检测
[0054]对肝素、肝素大分子酶解产物分别进行抗凝活性检测。
[0055]方法:参照国家药典2000年版第二部中“肝素生物检定法”方法进行。用兔血浆测定回收的肝素寡糖的抗凝血活性，并和原始肝素的抗凝活性进行比较。
[0056]结果:肝素酶解获得的大片段肝素寡糖的抗凝血活性大大降低，只有原始肝素的
16.6%ο
【专利附图】
【附图说明】
[0057]图1是限制性酶法制备的肝素大片段凝胶电泳图谱，各加样孔样品分别为1.肝素-X酶法制备的低分子肝素对照；3.5-8k分级的肝素寡糖；4.3-8k分级的肝素寡糖；5.化学法制备的低分子肝素对照。各种样品浓度为1%，上样量10 μ 1，凝胶浓度20%，染色剂为天青Α。
[0058]图2是大片段肝素寡糖的抗凝血活性。
[0059]图3是不同抗性条件下平滑肌细胞HUASMC的形态学特征。(A)对照组；(B)添加肝素组；(C)添加O-SkDa低分子肝素组；(D)添加3-8kDa肝素分级片段组；(E)添加5_8kDa肝素大片段分级组。用相差显微镜观察(放大倍数40X).每组三个平行。
[0060]图4是不同条件下对平滑肌细胞HUASMC的统计学分析。(A)对照组；(B)添加肝素组；(C)添加O-SkDa低分子肝素组；(D)添加3-8kDa肝素分级片段组；(E)添加5_8kDa肝素大片段分级组。用M TT法。每组三个平行。
【权利要求】
1.采用限制性酶切的方法裂解肝素。
2.组合运用1K，3K，5K,8K4种超滤膜进行分段，获得3K-8K，5K-8K两种特异性大片段。
3.3K-8K，5K-8K两种特异性大片段对平滑肌细胞的抑制增生活性显著大于原始肝素。
4.3K-8K，5K-8K两种特异性大片段的抗凝血活性显著低于原始肝素。
5.3K-8K，5K-8K两种特异性大片段缺·少抗肿瘤细胞K562的活性。
【文档编号】C12P19/26GK103710411SQ201310421298
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】孙艳, 岳洋 申请人:北京航空航天大学