具有改良的种子产量相关性状的植物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及通过在植物中调节编码III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表达而改良植物中产量相关性状（尤其是增加种子产量）的方法。本发明还涉及具有III类TPP多肽编码核酸序列改变的表达的植物，其中所述植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状。本发明还涉及新的III类TPP核酸和多肽序列。本发明还提供用于本发明方法中的核酸和多肽序列，以及包含此类核酸的构建体。
【专利说明】具有改良的种子产量相关性状的植物及其制备方法
[0001]本申请是发明人于2007年12月13日提交的题为“具有改良的种子产量相关性状的植物及其制备方法”的中国专利申请200780046387.2号的分案申请。
[0002]本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于改良植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过在植物中调节编码III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表达而改良植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有III类TPP多肽编码核酸序列改变的表达的植物，其中所述植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状。本发明还涉及新的III类TPP核酸和多肽序列。本发明还提供用于本发明方法中的核酸和多肽序列，以及包含此类核酸的构建体。
[0003]持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
[0004]具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物结构(例如枝条的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物 产量有贡献。
[0005]种子产量是尤其重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物的营养非常重要。作物如谷物、稻、小麦、芸苔和大豆占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消费，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消费。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源)和胚乳(萌发以及幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒饱满。
[0006]对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改良早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的茎与萌发势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉蜀黍(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。
[0007]另一重要性状是改良的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50% (Wang等、Planta(2003)218:l-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民是极大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
[0008]另一个重要的产量相关性状是植物生物量，尤其是对于饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula&Tollenaar2005Maydica50:39)。
[0009]增加植物产量的能力将在诸如农业等领域中具有许多应用，包括观赏植物的生产、树木栽培、园艺和森林业。增加产量也可以用于在生物反应器中使用的藻类生产(用于诸如药物、抗体或疫苗等物质的生物技术生产，或用于有机废物的生物转化)及其它这类领域。
[0010]植物种植者通常基于所针对的作物或植物，以及经济上有价值的植物或作物的部分，对改良产量的特定方面感兴趣。例如，对于某些作物或某些最终用途，植物种植者可能特别看重植物一个或多个部分的植物生物量(重量)的提高，所述部分包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。这与植物消费的是地上部分还是地下部分尤其相关。对于许多作物，尤其是谷物，特别期望提高种子产量。提高的种子产量可以以多种方式表现，基于所针对的作物或植物及其最终用途，种子产量的各个方面对于植物种植者的重要性不同。
[0011]能够挑选和选择待改变的产量或种子产量的方面，对于植物种植者将是尤其有利的。特别期望挑出可用的基因，即合适改变种子产量的具体方面或组分的基因。例如，增加的饱满率和增加的千粒重对于诸如玉米的作物是高度期望的。对于稻和小麦，增加的饱满率、收获指数和增加的千粒重是高度期望的。
[0012]现已发现在植物中调节编码III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表达，产生具有多种改良的产量相关性状的植物。
[0013]在几个生物界(life kingdom)发现海藻糖，其是由通过α -1, I键连接的两个葡萄糖分子组成的非还原性二糖。在细菌、真菌和昆虫中，显示海藻糖具有糖类储存功能并在胁迫耐受性中发挥功能。在植物中，海藻糖开始被认为限于嗜极端生物(extremophite)例如更苏植物复活草(Selaginella Iepidophylla),但是现在广泛接受的是海藻糖代谢在植物界是遍在的。
[0014]海藻糖在两个酶促反应中从UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸合成。在第一步中通过酶TPS (海藻糖磷酸合酶)，UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸转化为UDP (尿苷二磷酸)和α, α-海藻糖6-磷酸(Τ-6-Ρ)。在第二步中，通过酶TPP (海藻糖磷酸磷酸酶)的催化，Τ-6-Ρ去磷酸化产生海藻糖和正磷酸。
[0015]在酵母中，大的蛋白质复合物中存在两中酶活性(TPS和TPP活性)，所述蛋白质复合物包含活性亚基TPSl和TPS2以及调节亚基，TPSl具有TPS活性，而TPS2具有TPP活性。在大肠杆菌(E.coli)中，这两种酶活性在不同的蛋白质复合物中发现。在植物中，至今没有表征这种蛋白质复合物。
[0016]拟南芥中，海藻糖生物合成酶分为三类:
[0017]I类:包含四个基因，AtTPSl至AtTPS4与ScTPSl具有高度相似性；
[0018]II类:具有7个成员，AtTPS5至AtTPSll与ScTPS2具有高度序列相似性。以及
[0019]III类:具有10个成员，AtTPPA至AtTPPJ，编码的蛋白质与大肠杆菌TPS2和ScTPS2蛋白质的C端具有相似性。
[0020]编码这些类别的蛋白质的基因也存在于其他植物物种中。
[0021]在I类和II类中，仅明确确定了 AtTPSl的酶活性，所述AtTPSl显示TPS活性(Blazquez等，Plant J.1998年3月；13 (5):685-9.)。令人惊讶的是，至今没有任何其他II类TPS蛋白质的TPP活性报导。相反，之前已对AtTPPA和AtTPPB (III类的两个成员)描述了 TPP 活性(Vogel 等，Plant J.1998 年 3 月;13(5):673-83)。植物 III 类 TPP 含有两个磷酸酶共有结构基序，其在至今描述的所有TPP酶中发现(Thaller等，Protein Sc1.1998年 7 月;7(7):1647-52)。
[0022]已报导海藻糖生物合成基因的基因操作导致植物中提高的胁迫耐受性，并导致巨大的发育改变。已报导大肠杆菌OtsA和OtsB基因在转基因烟草和马铃薯植物中的过量表达导致根和叶发育失常，以及植物发育迟缓。在OtsA转基因烟草植物中产生较少的种子，而在OtSB转基因马铃薯植物中没有产生块茎(Goddi jn等，Plant Physiol.1997 年 I 月;113 (I): 181-90)，其他人描述了相似的结果(Holmstrom等，Nature, 379，683-684 ; Romero 等，Planta, 201，293-297 ; Pi lont-Smi ts 等，1998; J Plant Physiol.152: 525-532; Schluepmann 等，Proc Natl Acad Sci 美国，2003; 100 (II):6849-54)。据报导TPS和TPP基因中的突变缺陷显示发育缺陷。拟南芥中TPSl 敲除突变体胚发育受损(Eastmond 等，Plant J.2002 年 I 月;29 (2):225-35)。
[0023]Jackson等的公开的US专利申请，US20060191040提及玉米基因RAM0SA3(RA3)的分尚和表征，据报 导所述RAM0SA3负责分生组织发育和花序发育,包括分枝(branching)。这表明基因、基因产物和调节区可用于控制分枝、分生组织生长、花序发育和排列，并最终提高植物产量。虽然改变的结构(由于分枝的改变或花序结构的改变)在一些情况下可以导致产量的增加或种子产量的增加，但这不确定。有许多在增加产量或增加种子产量能够实现之前需要取代(in place)的其他组分。例如，没有结实率(seed set)、种子饱满(率)、植物能育性等，将没有种子产量的增加。另外，Jackson等没有提及可以改良产量的哪个方面，是植物特定部分的生物量还是提高种子产量(其可以是种子大小、种子数量、千粒重、收获指数或其他种子产量相关的参数)。
[0024]因此，令人惊讶的发现在植物中调节III类TPP多肽的表达产生相对于对照植物，具有多种改良的产量相关性状(尤其是增加的种子产量)的植物。
[0025]此后之后“用于本发明方法的蛋白质”的任何引用意指如本文定义的III类TPP多肽。在此之后“用于本发明方法的核酸”的任何引用意指能够编码此类III类TPP多肽的核酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指任意长度的聚合形式的氨基酸。术语〃多核苷酸"、〃核酸序列"、〃核苷酸序列〃、“多核苷酸分子”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组
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[0026]选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。
[0027]用于调节(优选增加)用于本发明方法的蛋白质的编码核酸表达的优选方法是通过在植物中引入和表达如下文定义用于本发明方法的蛋白质的编码核酸。
[0028]待引入植物(并且因而用于实施本发明方法)的核酸是编码现将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文又称作“ III类TPP核酸”或“ III类TPP基因”或“ III类TPP多肽”。
[0029]如本文所定义的“ III类TPP多肽”意指任意具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性，包含至少一个海藻糖-磷酸酶(海藻糖-磷酸磷酸酶)结构域的多肽。
[0030]海藻糖-磷酸磷酸酶结构域长度一般为200-250个氨基酸，且一般包含磷酸酶共有序列基序，所述基序在至今所有描述的TPP酶中发现(Thaller等，1998)。海藻糖-磷酸磷酸酶结构域的代表性的共有序列在SEQ ID N0:93中给出。SEQ ID N0:2中包含的海藻糖-磷酸磷酸酶结构域的氨基酸序列在SEQ ID N0:94中给出。本领域技术人员使用本领域已知的工具和技术，将容易的鉴定海藻糖-磷酸磷酸酶结构域的存在。本文中的实施例
2、3和4提供有关海藻糖-磷酸磷酸酶结构域鉴定的进一步细节。在III类TPP多肽中，该磷酸酶共有序列基序一般含有两个磷酸酶框，称为A和B-磷酸酶框。SEQ ID NO: 96表示磷酸酶框A的共有序列，SEQ ID NO:97表示磷酸酶框B的共有序列。
[0031]用于本发明方法的核酸编码包含至少一个海藻糖-磷酸磷酸酶结构域的III类TPP多肽，所述结构域按照递增的优选顺序，优选与SEQ ID N0:93或SEQ ID N0:94具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 98% 或更高的氨基酸序列同一性。进一步优选地，海藻糖-磷酸磷酸酶结构域包含至少一个(优选两个)磷酸酶框，所述磷酸酶框按照递增的优选顺序，与磷酸酶框或SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97具有至少50%、55%、60%、65%、70%、7 5%、80%、85%、90%、95% 或 98% 或更高的序列同一性。
[0032]III类TPP多肽还包含丝氨酸富含区，所述丝氨酸富含区一般位于海藻糖-磷酸磷酸酶结构域的N端。SEQ ID N0:95代表丝氨酸富含结构域的共有序列。优选地，用于本发明方法的核酸编码III类TPP多肽，所述III类TPP多肽包含丝氨酸富含结构域，所述丝氨酸富含结构域按照递增的优选顺序，与SEQ ID NO: 95具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%或更高的序列同一性。
[0033]优选地，引入植物的核算编码III类TPP蛋白质，所述III类TPP蛋白质按照递增的优选顺序，与选自SEQ ID NO:4、6和8的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。最优选地，III类TPP核酸由SEQ ID NO:3、5和7中的任一个所示。
[0034]一般的，当III类TPP多肽用于构建TPP/TPS系统树(例如图2A所示的)时，趋向聚簇于包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的III类TPP蛋白质组，而不是聚簇于任何其他组。
[0035]用于本发明方法的蛋白质的实例和其编码核酸由本文实施例的I表A提供。
[0036]还可以用于本发明方法的是实施例的I表A中给出的任意氨基酸序列的同源物。蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。
[0037]缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
[0038]插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的N端融合和/或C端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比N端融合或C端融合更小，约1-10个残基级别。N端或C端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG? _表位、IacZ, CMP (钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
[0039]取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋结构或折叠结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如 Creighton (1984) Proteins.W.H.Freeman and Company 和下表 I)。
[0040]表1:保守性氨基酸取代的实例
[0041]
【权利要求】
1.相对于对照植物增加植物种子产量的方法，其包括调节III类海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)多肽的编码核酸在植物中的表达。
2.权利要求1的方法，其中所述调节表达通过T-DNA激活标注、TILLING、位点定向诱变、定向进化或同源重组中的一种或多种实现。
3.权利要求1的方法，其中所述调节表达通过在植物中引入和表达编码III类TPP多肽的核酸实现。
4.权利要求1的方法，其中所述核酸包含: (a)编码包含氨基酸序列SEQID NO: 14,46或74的III类海藻糖磷酸磷酸酶的核酸，或编码下述氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生自SEQ ID NO: 14,46或74，且具有III类海藻糖磷酸磷酸酶的活性； (b)核酸SEQID N0:13、45或73，或其互补序列； (c)在严格条件下与(a)或(b)中给出的任一核酸杂交，且具有III类海藻糖磷酸磷酸酶的活性的核酸；或 (d)由于遗传密码简并性而衍生自(a)、(b)或(c)中给出的任一核酸的核酸。
5.权利要求1的方法，其中所述增加的种子产量是下列一种或多种: (i)每株植物增加的种子数； (?)每株植物增加的饱满种子数； (iii)每株植物增加的种子重量。`
6.权利要求1的方法，其中所述核酸序列与组成型启动子有效连接。
7.权利要求6的方法，其中所述组成型启动子是G0S2启动子。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述编码III类TPP蛋白质的核酸是植物来源。
9.权利要求8的方法，其中所述植物来自双子叶植物。
10.权利要求9的方法，其中所述双子叶植物来自十字花科。
11.权利要求10的方法，其中所述十字花科植物来自拟南芥属。
12.权利要求11的方法，其中所述拟南芥属植物是拟南芥。
13.通过权利要求1-12中任一项的方法获得的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码III类TPP蛋白质的重组核酸。
14.分离的核酸分子，其包含: (a)编码包含氨基酸序列SEQID NO: 14,46或74的III类海藻糖磷酸磷酸酶的核酸，或编码下述氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生自SEQ ID NO: 14,46或74，且具有III类海藻糖磷酸磷酸酶的活性； (b)核酸SEQID NO:13、45或73，或其互补序列； (c)在严格条件下与(a)或(b)中给出的任一核酸杂交，且具有III类海藻糖磷酸磷酸酶的活性的核酸；或 (d)由于遗传密码简并性而衍生自(a)、(b)或(c)中给出的任一核酸的核酸。
15.分离的多肽，其包含权利要求14中的核酸分子编码的氨基酸序列。
16.构建体，其包含: (a)权利要求14中的核酸； (b)一个或多个能够驱动(a)的核酸序列表达的调控序列；和任选的(c)转录终止序列。
17.权利要求16的构建体，其中所述一个或多个调控序列至少是组成型启动子。
18.权利要求17的构建体，其中所述组成型启动子是G0S2启动子。
19.权利要求16-18中任一项的构建体的用途，其用于制备相对于对照植物具有增加的种子产量的植物。
20.权利要求19的用途，其中所述增加的种子产量是下列一种或多种: (i)每株植物增加的种子数； (?)每株植物增加的饱满种子数； (iii)每株植物增加的种子(总)重量。
21.植物细胞，其由权利要求16-18中任一项的构建体转化。
22.用于制备具有增加的种子产量的转基因植物的方法，所述方法包括: (i)在植物中引入并表达编码III类TPP蛋白质的核酸；和 (?)在促进植物生长和发育的 条件下培养植物细胞， 其中所述核酸包含: (a)编码包含氨基酸序列SEQID NO: 14,46或74的III类海藻糖磷酸磷酸酶的核酸，或编码下述氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生自SEQ ID NO: 14,46或74，且具有III类海藻糖磷酸磷酸酶的活性； (b)核酸SEQID NO:13、45或73，或其互补序列； (c)在严格条件下与(a)或(b)中给出的任一核酸杂交，且具有III类海藻糖磷酸磷酸酶的活性的核酸；或 (d)由于遗传密码简并性而衍生自(a)、(b)或(c)中给出的任一核酸的核酸。
23.权利要求13或21的植物细胞，其中所述植物单子叶植物。
24.权利要求23的植物细胞，其中所述单子叶植物是作物植物。
25.权利要求23的植物细胞，其中所述单子叶植物是谷物。
26.权利要求23的植物细胞，其中所述单子叶植物是稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。
27.编码III类TPP蛋白质的核酸的用途，用于相对于对照植物增加植物种子产量，其中所述核酸包含: (a)编码包含氨基酸序列SEQID NO: 14,46或74的III类海藻糖磷酸磷酸酶的核酸，或编码下述氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生自SEQ ID NO: 14,46或74，且具有III类海藻糖磷酸磷酸酶的活性； (b)核酸SEQID NO:13、45或73，或其互补序列； (c)在严格条件下与(a)或(b)中给出的任一核酸杂交，且具有III类海藻糖磷酸磷酸酶的活性的核酸；或 (d)由于遗传密码简并性而衍生自(a)、(b)或(c)中给出的任一核酸的核酸。
28.权利要求27的用途，其中所述增加的种子产量是下列一种或多种: (i)每株植物增加的种子数； (?)每株植物增加的饱满种子数； (iii)每株植物增加的种子(总)重量。
【文档编号】C12N9/14GK103710376SQ201310421114
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2007年12月13日 优先权日:2006年12月15日
【发明者】A·I·桑兹莫林纳罗, L·范德斯蒂内, M·拉蒙, F·罗兰, P·范迪克, J·泰弗莱恩 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司