专利名称：一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方 法，属生物技术领域。
背景技术：
肺静脉平滑肌细胞，尤其是远端肺静脉平滑肌细胞，是研究肺循环相关疾病、尤其 是肺动脉高压及肺静脉高压等疾病发病机制的重要细胞材料。大鼠作为目前生命科学研 究领域最常见、最实用、最方便的实验动物，其肺动脉平滑肌细胞的培养方法己经较为 成熟。但是关于以大鼠远端肺静脉为平滑肌细胞来源的细胞培养方法却无报道，分析原 因主要由于1、大鼠体形较小，心肺组织更小，用常规分离牛、猪等大型动物远端肺 动脉的方法来分离大鼠的远端肺静脉难度太大、不易成功；2.分离到的大鼠远端肺静脉 较肺动脉弹性差，且外膜、中膜及内膜无明显过度分界，尤其中膜平滑肌层较肺动脉薄。 由于目前尚无肺静脉平滑肌细胞方面的研究报道，制约了对于肺动脉高压及肺静脉高压 发病机制的研究。因此，寻找一种高效、简便、纯度高、成本低的大鼠远端肺静脉平滑 肌细胞原代培养的方法成为了关键的一步。
发明内容
本发明的目的是提供一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法。该培养方法技术 稳定，重复性好，培养的细胞纯度高、形态均一、生长良好、且具有典型的平滑肌细胞 的形态及^^点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培 养方法，它包括以下步骤
(1) 获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞，
(2) 获取传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞，
其特征是所述歩骤(l)具体为取得的大鼠远端肺静脉血管中膜用消化液在35 37'C消化20 25min后提取远端肺静脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培 养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。 所述步骤(2)具体步骤为当原代细胞达到90%融合密度后，用PBS溶液清洗，加入
0. 1 0. 25%胰蛋白酶溶液35 37'C消化2 3分钟，当细胞出现回縮、细胞间隙增大 时，吸除胰蛋白酶溶液，清洗细胞，加入混合培养液，使之形成细胞悬浮液，接种于新 的培养瓶中进行培养，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠远端肺静脉平滑 肌细胞。
所述的歩骤(2)的胰蛋白酶溶液的用量为0.3 0.5ml，胰蛋白酶溶液中含0.02% EDTA(乙二胺四乙酸)；所述的细胞接种密度为1 2X105个/ml。
所述步骤(1)获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的具体步骤为
1〉从远端肺静脉组织中取出中膜平滑肌层组织，将其放入含氯化钙的朋SS平衡盐 溶液中4"C静置20 30min，然后放入HBSS平衡溶液中室温静置10 20min;再用消化 液在35 37。C消化中膜组织20 25min，可见组织块松软、边缘发毛；
2>吸出消化液，加入混合培养液，室温放置3 5min，经吹打至液体中出现有絮状 物，静置收集细胞悬浮液；重复两次上述步骤；
3〉将收集得到的细胞悬浮液离心，弃上清液，加入混合培养也调整细胞密度1 2 X105细胞/ml的密度种植于培养板，置于37"C、 5%0)2培养箱内静置培养，5 6天后 换培养液，当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端 肺静脉平滑肌细胞。
本发明所采用的混合培养液为含90 105U/ml的青霉素、90 105U/ml的链霉素和 10 20%胎牛血清的低糖DMEM(Dulbcco's Modifed Eagle Medium)培养液。
本发明所采用的HBSS平衡盐溶液为1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0. 38g氯 化钾、0.25g氯化镁、1. 8g葡萄糖和2. 24gHEPES (羟乙基哌嗪乙硫磺酸)配制而成。
本发明所采用的含氯化钙的HBSS平衡盐溶液为上述HBSS平衡盐溶液每100ml中加 入150ul的1M氯化钙构成。
本发明所采用的消化液为5mlHBSS平衡盐溶液中加入30. 5 31. 5mg I型胶原酶、
1. 5 2. 5mg木瓜酶、9. 5 10. 5mg牛血清白蛋白和0. 65 0. 75mg 二硫苏糖醇配制而成。
本发明方法与现有技术相比具有以下有益效果-
1、培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞纯度高，形态均一，生长良好。
2、 将肺静脉平滑肌层的消化时间控制在20 25min，可得到纯度为99%以上的平 滑肌细胞。
3、 肺静脉平滑肌细胞的取材部位位于远端肺静脉，经本发明提供的方法获得的细 胞经过显微镜观察及细胞免疫荧光鉴定具有典型的平滑肌细胞形态及特点，为进一步深 入研究肺循环相关疾病、小血管相关疾病，尤其是肺动脉高压及肺静脉高压等疾病的发 病机制奠定了条件，提供了丰富的实验材料来源。
图1是荧光显微镜(200X)下远端肺静脉平滑肌细胞浆平滑肌a-Actin抗原发红色 阳性荧光反应；
图2是荧光显微镜(200X)下远端肺静脉平滑肌细胞核胞浆中出现绿色的阳性荧光 反应；
图3是荧光显微镜(200X)下远端肺静脉平滑肌细胞核胞浆中的肌丝平行于细胞长 轴呈细丝状表达；图4是荧光显微镜(200X)下阴性对照无加一抗的远端肺静脉平滑肌细胞核胞浆中 出现绿色的阳性荧光反应；
图5是荧光显微镜(100 X)下远端肺静脉平滑肌细胞；
图6是荧光显微镜(100X)下远端肺静脉平滑肌细胞核胞浆中出现绿色的阳性荧光 反应；
图7是荧光显微镜(200X)下远端肺静脉平滑肌细胞浆平滑肌a -Actin抗原发红色 阳性荧光反应。
具体实施例方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于 此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明 上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。 实施例一-具体步骤-
1、主要实验材料
(1) 、动物来源大鼠可用6 8周龄(250 300g)的雄性SD大鼠。
(2) 、 HBSS平衡盐溶液:1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0.38g氯化钾、0. 25g 氯化镁、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES，实验前24小时配制并过滤除菌。
(3) 、消化液5mlHBSS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木瓜酶、10mg 牛血清白蛋白和0. 7mg 二硫苏糖醇配制而成。
(4) 、混合培养液为含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10%胎牛血清的 低糖DMEM培养液。
(5) 、 1. 5mM氯化钙的HBSS平衡盐溶液100ml的冊SS平衡盐溶液加入150u 1 的1M氯化f丐
2、操作步骤
(1)、获取大鼠远端肺静脉
1) 称重大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(150mg/kg)麻醉大鼠，无菌条件下取大鼠心 肺组织，用HBSS平衡盐溶液洗除血污；
2) 将心肺组织置于外科显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心分离远端 肺静脉；
3) 将血管放入冷的HBSS中以洗去血污，调大显微镜的放大倍数，于显微镜观察下 用显微镊和显微剪刀小心剥离血管外膜；
4) 将剥离外膜的血管条纵向剪开，用玻璃棒自上而下刮除内膜，留中膜平滑肌层;
5) 将中膜组织放入1.5mM含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中4。C30min， HBSS平衡盐溶 液中室温20min;
6) 再将组织块放入离心管中加入消化液37。C消化20 25min，晃动离心管可见组织 块松软、边缘发毛；
7) 轻轻吸出消化液，加入混合培养基5ml，室温放置3min，广口巴氏吸管吹打数 次，可见液体中有絮状物；
8) 静置片刻使组织块沉淀于离心管底部，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中。 原消化液加回组织块中继续消化5min，按上述步骤收集细胞，再重复5min消化操作l 次；
9) 将收集的细胞悬浮液离心(800rpm， 5min)，弃上清液，加入混合培养液调整 细胞密度以2X10'5细胞/ml的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时
用)。置37"C、 5%0)2培养箱内静置培养，5 6天后换培养液。当细胞生长至对数生长 期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。
(3)、获取传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞
当原代细胞生长密度达90%后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞3次，加 入O. 5ml 0.25X(m/v)胰蛋白酶溶液(含0.02XEDTA) 37'C消化3分钟，当细胞出现回 縮、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，用2mlPBS溶液清洗细胞3次，加入5ml混 合培养液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以2X105个/ml的细胞密度 接种于新的培养瓶中，置于37"C、 5%二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞 生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。
3、培养结果
(1) 、倒置相差显微镜下观察，刚种植的细胞呈圆形、透亮、单个均匀分布。原代 培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞生长5 6天左右可见部分细胞贴壁、展开细胞形态 多样，呈棱形、多角形、星形或不规则形，大小略有差异；胞浆丰富；胞核多为卵圆形 多数细胞为单核，少数细胞有双核或三核，有一个或多个核仁。10 14天后细胞数量明 显增多呈积聚性生长，细胞间常有突起相连。20 25天细胞生长达到对数期生长，部分 区域细胞重叠堆积生长形成"峰"，"峰"与"峰"之间细胞层数渐少，形成"谷"。 当细胞生长至融汇后，细胞间相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌细胞 生长特征"峰""谷"状生长。
(2) 倒置相差显微镜下观察，传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。细胞生长速 度较原代培养细胞明显加快。传代后3天细胞贴壁、展开可见细胞呈棱形、多角形、星 形或不规则形，5天后细胞数量明显增多呈积聚性生长，细胞间常有突起相连。7天后 细胞生长至融汇，形成典型的平滑肌细胞生长特征"峰""谷"状生长。原代培养的细 胞与传代细胞形态一致。
(3) 平滑肌a -Actin抗原的免疫荧光检测采用平滑肌a -Actin单克隆抗体对培 养的细胞进行鉴定，并采用国际常用的复染法进行染色，用Yo-pro I对所有细胞核进行 染色，保证细胞纯度计算的可靠性。在荧光显微镜下观察，可见Cy3标记的细胞浆平滑 肌a-Actin抗原发红色荧光，Yo-pro I标记的细胞核发绿色荧光。高倍镜下观察，平滑 肌细胞胞浆中的肌丝平行于细胞长轴呈细丝状表达(图3)。阴性对照无加一抗，仅检 测到Yo-pro I标记的细胞核没有检测Cy3标记的平滑肌a -Actin，所以仅见发绿色荧光 (图4)。低倍镜计算细胞纯度，每张片随机取5个视野，每个视野至少检测200个细 胞。计算每个视野中a-Actin表达阳性细胞占该视野总细胞数的比例，为平滑肌细胞纯 度。平均达99%以上(图1、 2、 5、 6、 7)。
权利要求
1.一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤(1)获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞；(2)获取传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞，其特征是，所述步骤(1)具体为取得的大鼠远端肺静脉血管中膜用消化液在35～37℃消化20～25min后提取远端肺静脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。
2、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 述的步骤(2)具体为当原代细胞达到90%融合密度后，用PBS溶液清洗，加入0. 1 0. 25 %胰蛋白酶溶液35 37'C消化2 3分钟，当细胞出现回縮、细胞间隙增大时，吸除胰 蛋白酶溶液，清洗细胞，加入混合培养液，使之形成细胞悬浮液，接种于新的培养瓶中 进行培养，至细胞生长至对数生长期，获得传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。
3、 根据权利要求2所述的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 述的步骤(2)胰蛋白酶溶液中含0.02XEDTA;所述的细胞接种密度为1 2Xl()5个/ml。
4、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 采用的消化液为5mlHBSS平衡盐溶液中加入30.5 31.5mg I型胶原酶、1. 5 2. 5mg 木瓜酶、9. 5 10. 5mg牛血清白蛋白和0. 65 0. 75mg 二硫苏糖醇配制而成。
5、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 述步骤(l)的中膜平滑肌层组织消化前将其放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中4°C静置 20 30min，然后放入HBSS平衡溶液中室温静置10 20min。
6、 根据权利要求1所述的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 述步骤(l)中膜平滑肌层组织经消化后，吸出消化液，加入混合培养液，室温放置3 5min，经吹打至液体中出现有絮状物，静置收集细胞悬浮液；重复两次；将收集得到的 细胞悬浮液离心，弃上清液，加入混合培养也调整细胞密度1 2Xl()5细胞/ml的密度 种植于培养板，置于37°C、 5%0)2培养箱内静置培养，5 6天后换培养液，当细胞生 长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。
7、 根据权利要求2或6所述的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是， 所采用的混合培养液为含90 105U/ml的青霉素、90~105U/ml的链霉素和10 20%胎 牛血清的低糖DMEM培养液。
8、 根据权利要求4或5所述的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是， 所采用的HBSS平衡盐溶液为1000ml三蒸水中加入7. 6g氯化钠、0. 38g氯化钾、0. 25g 氯化镁、1. 8g葡萄糖和2. 24gHEPES配制而成。
9、 根据权利要求5所述的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，其特征是，所 采用的含氯化钙的HBSS平衡盐溶液为每100ml朋SS平衡盐溶液中加入150u 1的1M氯 化钙构成。
全文摘要
本发明公开了一种大鼠远端肺静脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤(1)获取原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞，(2)获取传代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞；所述步骤(1)具体为取得的大鼠远端肺静脉血管中膜用消化液在35～37℃消化20～25min后提取远端肺静脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞。该培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞纯度高、形态均一、生长良好、且具有典型的平滑肌细胞的形态及特点。
文档编号C12N5/06GK101368171SQ20081019842
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者冉丕鑫, 卢文菊, 彭公永, 冰 李, 李晓岩, 城 洪, 健 王, 胡锦兴, 宁 赖 申请人:广州医学院