专利名称：体外培养的组织工程血管的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种I型胶原及组织细胞在血管生物反应器内培养生成的组织工程血管。有较强的力学性能，能够承受跨壁压カ和血流对血管壁的顺应力，有较好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。生物相容性较好。用于心脑血管疾病的血管移植物。属于医用生物材料领域。
背景技术：
动脉粥样硬化性心脏病为代表的动脉缺血性疾病是引起人类死亡的主要原因之一。其治疗方法主要是进行动脉移植手木。另外先天性心脏病是一种常见的先天性畸形，需进行手术矫治，一些复杂先心病手术也需应用血管移植物。从前我们用的血管移植物多为高分子人工材料，如涤纶、聚四氟こ烯等，均表现出各自利弊。现在国内外采用最多的为同种血管，但同种血管来源有限，同时同种血管经冷冻保存，虽祛除了大部分抗原物质，但移植入体内后，仍会产生一定的排异反应，移植5-10年后钙化、失去功能比例较高。异种血管来源方便，但因其移植后会产生强烈的排异反应，而至今未能在临床上应用。自身血管临床上应用较多，但由于来源和強度的限制，仍不能达到满意的效果。有鉴于此，开发构建具有组织相容性好、具有生长潜能、不易钙化和血栓形成、不易感染的组织工程血管变的尤为重要。由于天然血管主要有三层结构且胶原为血管壁细胞外基质中主要的结构性物质，占血管壁干重的20% _50%，故本公司利用胶原为基质，结合天然血管主要细胞体外培养生长的特点，采用逐层构建血管三层结构的方法制得。此方法制得的组织工程血管有较强的力学性能，能够承受跨壁压カ和血流对血管壁的顺应力，有较好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。为血管移植术提供了安全有效的移植物。
发明内容
本材料选用了 I型胶原及组织细胞在血管生物反应器内培养的方法制成。能够满足天然血管的要求，达到很好的血管移植效果。主要操作步骤如下1、胶原溶液的制备市售I型胶原，浸泡于0. 001mol/L 1. Omol/L的醋酸溶液， 制得浓度为0.1 % 1. 0% (w/w)的胶原溶液。2、胶原溶液涂层根据所需血管的尺寸的不同，选择不同尺寸的玻璃管道，将胶原溶液加入滚筒式搅拌器的玻璃管道中进行滚动涂层，直至形成均匀的胶原膜，然后倒去多余的胶原溶液。3、聚こニ醇涂层市售聚こニ醇用生理盐水稀释至浓度为0.1 % 1.0% (w/w),均匀滴在胶原膜上，然后滚筒式搅拌器滚动涂层。4、平滑肌细胞与成纤维细胞的种植受体骨髄中分化、提取平滑肌细胞和成纤维细胞，1. 25X 105个/ml的浓度加入平滑肌细胞，连续种植2d后同时按同样的浓度种植成纤维细胞。分别连续种植3d。5、血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子的种植在平滑肌细胞与成纤维细胞种植完毕后将受体骨髓中提取的血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子按5. Ong/ml 10. Ong/ml的浓度滴加进滚筒搅拌器的玻璃管道内，连续种植3d。6、组织工程血管的形成将组织细胞种植完毕的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学性能，及血液流动的情况进行培养，培养时间7d 21d。即可植入受体进行使用。
具体实施例方式实施例1、取市售I型胶原0. lg，浸泡在IOOml浓度为0. 2mol/L醋酸溶液中。搅拌均匀充分溶解，然后放进滚筒式搅拌器的玻璃管道内滚动涂层。形成均匀胶原膜后倒出多余胶原溶液。市售聚こニ醇0.1g倒入IOOml灭菌处理的生理盐水中搅拌均匀，取适量聚こニ醇液体滴在胶原膜上，滚筒式搅拌器滚动涂层。按1. 25X 105个/ml的浓度加入受体自身骨髄分化 平滑肌细胞，连续种植2d，然后再同时按1. 25X 105个/ml的浓度种植受体自身骨髄分化成纤维细胞。分别连续种植3d。接下来按9. Ong/ml的浓度种植受体自身骨髄血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子，连续种植3d。最后将种植完组织细胞的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学參数，及血液流动的情况进行培养，培养时间7d。实施例2、取市售I型胶原0. 2g，浸泡在IOOml浓度为0. 5mol/L醋酸溶液中。搅拌均匀充分溶解，然后放进滚筒式搅拌器的玻璃管道内滚动涂层。形成均匀胶原膜后倒出多余胶原溶液。市售聚こニ醇0. 5g倒入IOOml灭菌处理的生理盐水中搅拌均匀，取适量聚こニ醇液体滴在胶原膜上，滚筒式搅拌器滚动涂层。按1. 25X 105个/ml的浓度加入受体自身骨髄分化平滑肌细胞，连续种植2d，然后再同时按1. 25X 105个/ml的浓度种植受体自身骨髄分化成纤维细胞。分别连续种植3d。接下来按5. Ong/ml的浓度种植受体自身骨髄血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子，连续种植3d。最后将种植完组织细胞的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学參数，及血液流动的情况进行培养，培养时间14d。实施例3、取市售I型胶原1. Og，浸泡在IOOml浓度为0. Olmol/L醋酸溶液中。搅拌均匀充分溶解，然后放进滚筒式搅拌器的玻璃管道内滚动涂层。形成均匀胶原膜后倒出多余胶原溶液。市售聚こニ醇0.1g倒入IOOml灭菌处理的生理盐水中搅拌均匀，取适量聚こニ醇液体滴在胶原膜上，滚筒式搅拌器滚动涂层。按1.25X 105个/ml的浓度加入受体自身骨髄分化平滑肌细胞，连续种植2d，然后再同时按1. 25X 105个/ml的浓度种植受体自身骨髄分化成纤维细胞。分别连续种植3d。接下来按10. Ong/ml的浓度种植受体自身骨髄血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子，连续种植3d。最后将种植完组织细胞的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学參数，及血液流动的情况进行培养，培养时间14d。实施例4、取市售I型胶原0. 5g，浸泡在IOOml浓度为0. 05mol/L醋酸溶液中。搅拌均匀充分溶解，然后放进滚筒式搅拌器的玻璃管道内滚动涂层。形成均匀胶原膜后倒出多余胶原溶液。市售聚こニ醇1. Og倒入IOOml灭菌处理的生理盐水中搅拌均匀，取适量聚こニ醇液体滴在胶原膜上，滚筒式搅拌器滚动涂层。按1.25X 105个/ml的浓度加入受体自身骨髄分化平滑肌细胞，连续种植2d，然后再同时按1. 25X 105个/ml的浓度种植受体自身骨髄分化成纤维细胞。分别连续种植3d。接下来按5. Ong/ml的浓度种植受体自身骨髄血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子，连续种植3d。最后将种植完组织细胞的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学參数，及血液流动的情况进行培养，培养时间Id0实施例5、取市售I型胶原0. 5g，浸泡在IOOml浓度为0. 05mol/L醋酸溶液中。搅拌均匀充分溶解，然后放进滚筒式搅拌器的玻璃管道内滚动涂层。形成均匀胶原膜后倒出多余胶原溶液。市售聚こニ醇0. 2g倒入IOOml灭菌处理的生理盐水中搅拌均匀，取适量聚こニ醇液体滴在胶原膜上，滚筒式搅拌器滚动涂层。按1.25X 105个/ml的浓度加入受体自身骨髄分化平滑肌细胞，连续种植2d，然后再同时按1. 25X 105个/ml的浓度种植受体自身骨髄分 化成纤维细胞。分别连续种植3d。接下来按5. Ong/ml的浓度种植受体自身骨髄血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子，连续种植3d。最后将种植完组织细胞的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学參数，及血液流动的情况进行培养，培养时间21d。实施例6、取市售I型胶原0. 8g，浸泡在IOOml浓度为0. 9mol/L醋酸溶液中。搅拌均匀充分溶解，然后放进滚筒式搅拌器的玻璃管道内滚动涂层。形成均匀胶原膜后倒出多余胶原溶液。市售聚こニ醇0. 8g倒入IOOml灭菌处理的生理盐水中搅拌均匀，取适量聚こニ醇液体滴在胶原膜上，滚筒式搅拌器滚动涂层。按1. 25X 105个/ml的浓度加入受体自身骨髄分化平滑肌细胞，连续种植2d，然后再同时按1. 25X 105个/ml的浓度种植受体自身骨髄分化成纤维细胞。分别连续种植3d。接下来按6. Ong/ml的浓度种植受体自身骨髄血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子，连续种植3d。最后将种植完组织细胞的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学參数，及血液流动的情况进行培养，培养时间15d。实施例7、取市售I型胶原0. 6g，浸泡在IOOml浓度为0. lmol/L醋酸溶液中。搅拌均匀充分溶解，然后放进滚筒式搅拌器的玻璃管道内滚动涂层。形成均匀胶原膜后倒出多余胶原溶液。市售聚こニ醇0. 3g倒入IOOml灭菌处理的生理盐水中搅拌均匀，取适量聚こニ醇液体滴在胶原膜上，滚筒式搅拌器滚动涂层。按1. 25X 105个/ml的浓度加入受体自身骨髄分化平滑肌细胞，连续种植2d，然后再同时按1. 25X 105个/ml的浓度种植受体自身骨髄分化成纤维细胞。分别连续种植3d。接下来按8. Ong/ml的浓度种植受体自身骨髄血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子，连续种植3d。最后将种植完组织细胞的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学參数，及血液流动的情况进行培养，培养时间14d。实施例8、取市售I型胶原0. 2g，浸泡在IOOml浓度为0. 02mol/L醋酸溶液中。搅拌均匀充分溶解，然后放进滚筒式搅拌器的玻璃管道内滚动涂层。形成均匀胶原膜后倒出多余胶原溶液。市售聚こニ醇0. 5g倒入IOOml灭菌处理的生理盐水中搅拌均匀，取适量聚こニ醇液体滴在胶原膜上，滚筒式搅拌器滚动涂层。按1.25X 105个/ml的浓度加入受体自身骨髄分化平滑肌细胞，连续种植2d，然后再同时按1. 25X 105个/ml的浓度种植受体自身骨髄分化成纤维细胞。分别连续种植3d。接下来按10. Ong/ml的浓度种植受体自身骨髄血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子，连续种植3d。最后将种植完组织细胞的胶原膜取出放进血管 生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学參数，及血液流动的情况进行培养，培养时间IOcL
权利要求
1. 一种I型胶原及组织细胞在血管生物反应器内培养的方法制成。此产品组织相容性好、具有生长潜能、不易感染、有较强的力学性能，能够承受跨壁压力和血流对血管壁的顺应力，有较好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。其特征包括下列步骤 (1)、市售I型胶原，浸泡于O.OOlmol/L 1. Omol/L的醋酸溶液，制得浓度为O. 1%~.1.0% (w/w)的胶原溶液。
(2)、根据所需血管的尺寸的不同，选择不同尺寸的玻璃管道，将胶原溶液加入滚筒式搅拌器的玻璃管道中进行滚动涂层，直至形成均匀的胶原膜，然后倒去多余的胶原溶液。形成初步的胶原基质层。
(3)、市售聚乙二醇用生理盐水稀释至浓度为O.1 % 1. O % (w/w)，均匀滴在胶原膜上，然后滚筒式搅拌器滚动涂层。完成为平滑肌细胞的粘附增长提供保障。
(4)、将从受体骨髓中分化提取的平滑肌细胞按1.25 X IO5个/ml的浓度种植在涂了聚乙二醇的胶原膜上，连续种植2d后同时按同样的浓度种植从受体骨髓中分化提取的成纤维细胞。分别连续种植3d。完成血管外围两层结构的组织细胞的种植。
(5)、将受体骨髓中提取的血管内皮祖细胞和血管内皮生长因子按5.Ong/ml .10.Ong/ml的浓度滴加进滚筒搅拌器的玻璃管道内，连续种植3d。完成血管内层组织细胞的种植。
(6)、将组织细胞种植完毕的胶原膜取出放进血管生物反应器中，模拟人体血管所应承受的力学参数，及血液流动的情况进行培养，培养7d 21d。形成了体外培养的组织工程血管。可植入受体进行使用。
全文摘要
本发明描述了一种可用于临床血管移植手术的血管移植物及其制备方法。属于医用生物材料领域。主要解决目前临床中自体血管取材受限，手术繁杂；异体血管风险高和高分子材料植入体内顺应性差或者钙化等问题。通过根据天然血管不同结构不同组织细胞的特点，分三层种植受体自身组织细胞，最终模拟体内血管所应承受力学参数及血流情况制备而成，达到自体血管修复的目的。通过此方法制备所得的材料是I型胶原及受体自身组织细胞在血管生物反应器培养而成，接近自体血管，生物相容性好，具有生长潜能，不易感染、有较强的力学性能，能够承受跨壁压力和血流对血管壁的顺应力，有较好的抗血栓形成和抗血小板粘附的作用，有利于血管移植手术的血管修复。
文档编号A61F2/06GK103006349SQ20121058960
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者万力, 张春红 申请人:天津市赛宁生物工程技术有限公司