专利名称：橘林油脂酵母的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种橘林油脂酵母的应用。
背景技术：
一般将含油量在20%以上的微生物称为油脂微生物，油脂酵母具有含油量高、生 长繁殖快和营养要求简单等特点，是工业生产油脂的首选菌株，但自然界来源的野生菌株 用于生产还存在诸多问题。橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)是油脂酵母的一种， 常被用于工业生产油脂和处理废水等，是适合大规模生产用菌株，如果培养条件合适，油脂 积聚量达40%以上。除了以上特点外，酵母属于真核生物，又具有细菌等原核生物类的生长 速度快、营养要求简单、遗传操作方便等特点，也是进行生物工程的优良研究材料。目前关 于橘林油脂酵母的研究主要集中在评价其利用废弃物生产酶和产油条件等方面，在油脂类 酵母表达载体构建及转化系统方面的研究还尚未见报道，因此为油脂酵母的基因工程改造 建立系统的操作技术很有必要。目前已经有的几个重要的酵母作为外源基因表达系统并商品化，如毕赤酵母、酿 酒酵母等，但由于这些酵母含油量很低，用于表达与油脂含量相关的基因时存在产量低；用 于表达合成长链多部饱和脂肪酸相关基因时存在亚油酸反应底物低的问题。目前尚无适合 油脂合成相关基因的表达系统。Δ6-脂肪酸去饱和酶是合成长链多不饱和脂肪酸的限速酶，分别在η-3途径中催 化ALA脱氢生成十八碳四烯酸(SDA)和η-6途径中的LA脱氢生成Y -亚麻酸(GLA)。在 Y-亚麻酸的生物合成过程中，Δ6-脂肪酸去饱和酶将LA的第六位碳原子脱氢转化成GLA ； 在十八碳四烯酸的合成途径中，△ 6_脂肪酸去饱和酶将ALA的第六位碳原子脱氢转化成 SDA, SDA是合成EPA、DHA等必需脂肪酸的中间物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种橘林油脂酵母的应用，橘林油脂酵母菌体油脂含量 高，作为油脂产量为目的的基因表达的宿主，可以提高目的产物产量。为了实现上述目的，本发明所采用技术方案是橘林油脂酵母的应用，其特征在 于橘林油脂酵母应用于作为基因表达的宿主材料。所述的橘林油脂酵母应用于作为基因表达的宿主材料是以橘林油脂酵母为宿主 材料，以杂和强启动子和橘林油脂酵母rDNA为元件，构建装载有潮霉素抗性基因、绿色荧 光蛋白酶基因和Δ6-脂肪酸去饱和酶基因的酵母表达载体，实现在橘林油脂酵母中有效的 表达外源基因；具体步骤如下1).橘林油脂酵母整合型表达载体的构建以橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)基因组为模板，分别以18SF和 cnJLr2,28SR和cnJLr3为引物进行PCR，获得橘林油脂酵母的两段rDNA序列，这两个片段 的一端具有碱基重叠区；分别回收这两个片段，以这两个片段等量混合作为模板，18SF和28SR为引物进行套叠PCR，获得引入了 CopI和NotI酶切位点的rDNA序列，连入pMD18_T 得到载体pLK-cnrDNA ；分别以载体PINA1296和载体pPIC9K为模板，以ccnPl和ccnP2，Tl和T2分别为 引物扩增启动子hp4d和终止子terminator元件，得到的启动子和终止子的一端具有碱基 重叠区，回收这两个片段等量混合作为模板，以ccnPl和T2为引物进行套叠PCR，获得引入 了 CopI和NotI酶切位点的启动子终止子单元，载体命名为pMD-hPT ；将载体pLK-cnrDNA和pMD-hPT通过NotI和CpoI进行双酶切后备用；并用引物 PHYGl和PHYG2从载体pHBM 114中克隆得到潮霉素磷酸转移酶基因HPT，得到的HPT通过 T4DNAPolymerase进行消化处理后得到含有半个Not I和CpoI粘性末端的片段，连入酶切 后的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPHT ；然后用引物ccnPl和T2从载体pMD_hPHT上扩增 得到含有hp4d-HPT-Terminator的表达单元，此片段用同上述一样的方法消化处理后连接 入酶切后的载体pLK-cnrDNA获得表达载体pLK_rhPHT ；用引物PGFP1和PGFP2从载体pGreen中克隆绿色荧光蛋白酶基因GFP，得到的 GFP基因通过T4DNA Polymerase进行消化处理后得到含有半个NotI和CpoI粘性末端的 片段，连入酶切后的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPGT，最后用同HPT —样的方法，以引物 ccnPl和T2从载体pMD-hPGT上扩增出hp4d-GFP_terminator单元，连接入酶切后的表达载 体pLK-rhPHT得到表达载体pLK-rhPHG(即橘林油脂酵母整合型表达载体)；表达载体pLK-rhPHG通过PstI和EcoR I线性化后通过改进的醋酸锂方法 转化橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)；基本转化缓冲液配方如下聚乙二醇 (PEG) 3350 (50 %，w/v) 960 μ L ；醋酸锂(Lithium acetate) (IM) 120 μ L ；TE 缓冲液(文献可 查)(0. 1Μ, ρΗ 7. 5) 120 μ L ；单链 DNA(ssDNA) 10 μ g ；质粒 DNA(plasmid DNA) 10 μ 1 和重悬 细胞(suspension cells) (0. IM醋酸锂)200mL ；通过80g/mL的潮霉素平板进行筛选阳性 转化子，28 °C、培养2-3天；2).表达载体pLK-rhPHG在橘林油脂酵母中的功能验证通过用特异性引物对载体pLK-rhPHG进行扩增，获得了 0. 7kb和1. 4kb的基 因片段，与已知GFP和HPT大小相等，因此证明两个基因已经成功地连入了表达载体 pLK-rhPHG ；转化后的酵母通过80 μ g/mL的潮霉素平板筛选，每个平板有5. 6 X IO2的橘林油 脂酵母(Lipomyces kononenkoae)转化子出现；选取经过PCR验证了潮霉素基因的转化子 进行液体培养后，通过荧光倒置显微镜观察其荧光蛋白表达的情况，带有GFP基因的重组 菌株能够发出荧光；以上结果说明，构建的表达载体pLK-rhPHG，启动了潮霉素抗性基因(即潮霉 素基因)和绿色荧光蛋白酶基因(即绿色荧光蛋白基因)在橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)成功的表达；3).脂肪酸去饱和酶基因(即Δ 6-脂肪酸去饱和酶基因)在橘林油脂酵母中有效 表达来源于刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)MAIN6的Δ6-去饱和酶基 因D6DM保存在载体pHBM117上，大小1. 4kb ；通过特异性引物D6DM1和D6DM2扩增得到了 D6DM基因，得到的D6DM基因通过T4DNA Polymerase进行消化处理后得到含有半个NotI和
5Cpo I粘性末端的片段，连入酶切后的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPMT ；最后用同HPT — 样的方法，以引物ccnPl和T2从载体pMD-hPMT上扩增出hp4d-D6DM_terminator单元，连 接入酶切后的载体pLK-rhPHT得到表达载体pLK-rhPHM，然后通过改进的醋酸锂方法转入 橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)；通过潮霉素平板进行筛选获得了 5. OX IO2个转 化子，选取PCR验证后的转化子进行培养后利用气相色谱测定其脂肪酸成分；结果显示，在GLA标样同样出峰时间的地方，重组菌株也有此峰出现，GLA含量大 概占总脂肪酸总质量含量的1. 2%，同时含有pLK-rhPHT载体的对照菌株没有该峰的出现； 以上结果表明，来自刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)MAIN6的D6DM基因已 经成功的构建在载体pLK-rhPHM上，然后转入橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)并 有效表达。本发明的有益效果是1.橘林油脂酵母菌体油脂含量高，作为油脂产量为目的的基因表达的宿主，可以 提高目的产物产量；而目前使用的商业化酵母，含油量均不超过菌体的20% (质量)。2.橘林油脂酵母菌体亚油酸含量高，亚油酸是合成长链多不饱和酸，如GLA、EPA、 DHA的前体物质；而这些长链的多不饱和脂肪酸是人体重要的生理活性物质，在饮食中很 缺乏。目前从含有这类物质的生物中克隆基因，在合适的宿主中表达，获得更多的该物质是 目前研究热点；而目前使用的几个商业化酵母的亚油酸含量极低。3.目前在基因工程中常应用的酵母宿主不多，进一步研究橘林油脂酵母系统也可 以发展成为其他蛋白的表达宿主。4.本发明已经实现潮霉素抗性基因、绿色荧光蛋白酶基因和Δ6-脂肪酸去饱和酶 基因在橘林油脂酵母中有效表达。目前国内外尚未见橘林油脂酵母成功表达外源基因的报 道。
图1为本发明pLK-rhPHG和pLK-rhPHM表达载体的构建图。图2为装载有潮霉素抗性基因的载体pLK-rhPHT转化橘林油脂酵母前后在含有潮 霉素平板(80g/ml hygromycin B)上的生长情况图；图2中的左边转化pLK-rhPHT的橘林油脂酵母；图2中的右边未转化外源基因 的橘林油脂酵母。图3为装载有绿色荧光蛋白酶基因的载体pLK-rhPHG转化橘林油脂酵母前后在光 学显微镜和荧光显微镜下的观察图；图3中的A和B 橘林油脂酵母分别置光学显微镜和荧光显微镜下的观察结果；图3中的C和D 装载有绿色荧光蛋白酶基因的载体pLK-rhPHG转化橘林油脂酵 母后分别置光学显微镜和荧光显微镜下的观察结果。图4为脂肪酸成分的气相色谱分析图；图4中的A =GLA标准样品；图4中的B 装载有pLK_rhPHT的橘林油脂酵母对照样 品；图4中的C 装载有pLK-rhPHM的橘林油脂酵母样品。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1 橘林油脂酵母的应用，橘林油脂酵母应用于作为基因表达的宿主材料。所述的橘林油脂酵母应用于作为基因表达的宿主材料是以橘林油脂酵母为宿主 材料，以杂和强启动子和橘林油脂酵母rDNA为元件，构建装载有潮霉素抗性基因、绿色荧 光蛋白酶基因和Δ6-脂肪酸去饱和酶基因的酵母表达载体，实现在橘林油脂酵母中有效的 表达外源基因；具体步骤如下1).橘林油脂酵母整合型表达载体的构建以橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)基因组为模板，分别以18SF和 cnJLr2 (见表1)，28SR和cnJLr3 (见表1)为引物进行PCR，获得橘林油脂酵母的两段rDNA 序列，这两个片段的一端具有碱基重叠区；分别回收这两个片段，以这两个片段等量混合作 为模板，18SF和28SR为引物进行套叠PCR，获得引入了 CopI和NotI酶切位点的rDNA序列， 连入pMD18-T得到载体pLK-cnrDNA ；分别以载体pINA1296和载体pPIC9K为模板，以ccnPl和ccnP2 (见表1)，Tl和 T2(见表1)分别为引物扩增启动子hp4d和终止子terminator元件，得到的启动子和终止 子的一端具有碱基重叠区，回收这两个片段等量混合作为模板，以ccnPl和T2为引物进行 套叠PCR，获得引入了 CopI和NotI酶切位点的启动子终止子单元，载体命名为pMD-hPT ；如图1所示，将载体pLK-cnrDNA和pMD-hPT通过NotI和CpoI进行双酶切后备用； 并用引物PHYGl (见表1)和PHYG2(见表1)从载体pHBM114中克隆得到潮霉素磷酸转移酶 基因HPT，得到的HPT通过T4DNA Polymerase进行消化处理后得到含有半个NotI和CpoI 粘性末端的片段，连入酶切后的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPHT ；然后用引物ccnPl和 T2从载体pMD-hPHT上扩增得到含有hp4d-HPT-Terminat0r的表达单元，此片段用同上述一 样的方法消化处理后连接入酶切后的载体pLK-cnrDNA获得表达载体pLK_rhPHT ；用引物PGFP1和PGFP2从载体pGreen中克隆绿色荧光蛋白酶基因GFP，得到的 GFP基因通过T4DNA Polymerase进行消化处理后得到含有半个Not I和CpoI粘性末端的 片段，连入酶切后的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPGT，最后用同HPT —样的方法，以引物 ccnPl和T2从载体pMD-hPGT上扩增出hp4d-GFP_terminator单元，连接入酶切后的表达载 体pLK-rhPHT得到表达载体pLK-rhPHG(即橘林油脂酵母整合型表达载体，见图1)；表达载体pLK-rhPHG通过PstI和EcoRI线性化后通过改进的醋酸锂方法 转化橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)；基本转化缓冲液配方如下聚乙二醇 (PEG) 3350 (50%, w/v) 960 μ L ；醋酸锂(Lithium acetate) (IM) 120 μ L ;TE 缓冲液(文献 可查)(0. 1M, pH 7. 5) 120 μ L ；单链 DNA(ssDNA) 10 μ g ；质粒 DNA(plasmid DNA) 10 μ 1 和重 悬细胞(suspension cells) (0. IM醋酸锂)200mL ；通过80g/mL的潮霉素平板进行筛选阳 性转化子，28 °C、培养2-3天；2).表达载体pLK-rhPHG在橘林油脂酵母中的功能验证通过用特异性引物对载体pLK-rhPHG进行扩增，获得了 0. 7kb和1. 4kb的基 因片段，与已知GFP和HPT大小相等，因此证明两个基因已经成功地连入了表达载体pLK-rhPHG ；转化后的酵母通过80 μ g/mL的潮霉素平板筛选，每个平板有5. 6 X IO2的橘林油 脂酵母(L. kononenkoae)转化子出现；选取经过PCR验证了潮霉素基因的转化子进行液体 培养后，通过荧光倒置显微镜观察其荧光蛋白表达的情况，带有GFP基因的重组菌株能够 发出荧光；以上结果说明，构建的表达载体pLK-rhPHG，启动了潮霉素抗性基因(即潮霉素 基因，见图2)和绿色荧光蛋白酶基因(即绿色荧光蛋白基因，见图3)在橘林油脂酵母 (Lipomyceskononenkoae)成功的表达；3) ·月旨肪酸去饱和酶基因(即Δ6-月旨肪酸去饱和酶基因)在橘林油脂酵母中有效表达来源于刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)MAIN6的Δ6-去饱和酶基 因D6DM保存在载体pHBM117上，大小1. 4kb ；通过特异性引物D6DM1和D6DM2扩增得到了 D6DM基因，得到的D6DM基因通过T4DNA Polymerase进行消化处理后得到含有半个Not I 和Cpo I粘性末端的片段，连入酶切后的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPMT ；最后用同HPT 一样的方法，以引物ccnPl和T2从载体pMD-hPMT上扩增出hp4d-D6DM_terminator单元，连 接入酶切后的载体pLK-rhPHT得到表达载体pLK-rhPHM(图1)，然后通过改进的醋酸锂方法 转入橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)；通过潮霉素平板进行筛选获得了 5. OX IO2 个转化子，选取PCR验证后的转化子进行培养后利用气相色谱测定其脂肪酸成分；结果显示，在GLA标样同样出峰时间的地方，重组菌株也有此峰出现(图4)， GLA含量大概占总脂肪酸总质量含量的1.2%，同时含有pLK-rhPHT载体的对照菌株 没有该峰的出现；以上结果表明，来自刺孢小克银汉霉(Curmmghamella echinulata) MAIN6的D6DM基因已经成功的构建在载体pLK-rhPHM上，然后转入橘林油脂酵母 (Lipomyceskononenkoae)并有效表达。表1.实验中所需要引物
权利要求
橘林油脂酵母的应用，其特征在于橘林油脂酵母应用于作为基因表达的宿主材料。
2.根据权利要求1所述的橘林油脂酵母的应用，其特征在于所述的橘林油脂酵母应 用于作为基因表达的宿主材料是以橘林油脂酵母为宿主材料，以杂和强启动子和橘林油 脂酵母rDNA为元件，构建装载有潮霉素抗性基因、绿色荧光蛋白酶基因和Δ6-脂肪酸去饱 和酶基因的酵母表达载体，实现在橘林油脂酵母中有效的表达外源基因；具体步骤如下1).橘林油脂酵母整合型表达载体的构建以橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)基因组为模板，分别以18SF和cnJLr2， 28SR和cnJLrf为引物进行PCR，获得橘林油脂酵母的两段rDNA序列，这两个片段的一端具 有碱基重叠区；分别回收这两个片段，以这两个片段等量混合作为模板，18SF和28SR为引 物进行套叠PCR，获得引入了 Cop/和Not/酶切位点的rDNA序列，连入pMD18_T得到载体 pLK-cnrDNA ；分别以载体PINA1296和载体pPlC9K为模板，以ccnPl和ccnP2，Tl和T2分别为引物扩 增启动子hp4d和终止子terminator元件，得到的启动子和终止子的一端具有碱基重叠区， 回收这两个片段等量混合作为模板，以ccnPl和T2为引物进行套叠PCR，获得引入了 Cop/ 和Not/酶切位点的启动子终止子单元，载体命名为pMD-hPT ；将载体pLK-cnrDNA和pMD_hPT通过Not/和Cpo/进行双酶切后备用；并用引物 PHYGl和PHYG2从载体pHBM114中克隆得到潮霉素磷酸转移酶基因HPT，得到的HPT通过 T4DNAPolymerase进行消化处理后得到含有半个Not/和Cpo/粘性末端的片段，连入酶切后 的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPHT ；然后用引物ccnPl和T2从载体pMD_hPHT上扩增得 到含有hp4d-HPT-Terminator的表达单元，此片段用同上述一样的方法消化处理后连接入 酶切后的载体pLK-cnrDNA获得表达载体pLK_rhPHT ；用引物PGFPl和PGFP2从载体pGreen中克隆绿色荧光蛋白酶基因GFP，得到的GFP基 因通过T4DNA Polymerase进行消化处理后得到含有半个Not/和Cpo/粘性末端的片段，连 入酶切后的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPGT，最后用同HPT —样的方法，以引物ccnPl 和T2从载体pMD-hPGT上扩增出hp4d-GFP-terminator单元，连接入酶切后的表达载体 pLK-rhPHT 得到表达载体 pLK_rhPHG ；表达载体pLK-rhPHG通过Pst/和EcoR/线性化后通过改进的醋酸锂方法转化橘林油 脂酵母(Lipomyces kononenkoae)；基本转化缓冲液配方如下聚乙二醇(PEG) 3350 (50%， w/v) 960 μ L ；醋酸锂(Lithium acetate) (IM) 120 μ L ;TE 缓冲液(文献可查)(0. 1M, pH 7. 5) 120 μ L ；单链 DNA(ssDNA) 10 μ g ；质粒 DNA (plasmid DNA) 10 μ 1 和重悬细胞 (suspension cells) (0. IM醋酸锂)200mL ；通过80g/mL的潮霉素平板进行筛选阳性转化 子，28°C、培养2-3天；2).表达载体pLK-rhPHG在橘林油脂酵母中的功能验证通过用特异性引物对载体pLK-rhPHG进行扩增，获得了 0. 7kb和1. 4kb的基因片段，与 已知GFP和HPT大小相等，因此证明两个基因已经成功地连入了表达载体pLK-rhPHG ；转化后的酵母通过80 μ g/mL的潮霉素平板筛选，每个平板有5. 6 X IO2的橘林油脂酵 母(Lipomyces kononenkoae)转化子出现；选取经过PCR验证了潮霉素基因的转化子进行 液体培养后，通过荧光倒置显微镜观察其荧光蛋白表达的情况，带有GFP基因的重组菌株能够发出荧光；以上结果说明，构建的表达载体pLK-rhPHG，启动了潮霉素抗性基因和绿色荧光蛋白酶 基因在橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)成功的表达； 3).脂肪酸去饱和酶基因在橘林油脂酵母中有效表达来源于刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)MAIN6的Δ6-去饱和酶基因 D6DM保存在载体pHBMl 17上，大小1. 4kb ；通过特异性引物D6DM1和D6DM2扩增得到了 D6DM 基因，得到的D6DM基因通过T4 DNA Polymerase进行消化处理后得到含有半个Not/和Cpo/ 粘性末端的片段，连入酶切后的载体pMD-hPT后得到载体pMD-hPMT ；最后用同HPT —样的 方法，以引物ccnPl和T2从载体pMD-hPMT上扩增出hp4d-D6DM_terminator单元，连接入 酶切后的载体pLK-rhPHT得到表达载体pLK-rhPHM，然后通过改进的醋酸锂方法转入橘林 油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)；通过潮霉素平板进行筛选获得了 5. OX IO2个转化子， 选取PCR验证后的转化子进行培养后利用气相色谱测定其脂肪酸成分；结果显示，在GLA标样同样出峰时间的地方，重组菌株也有此峰出现，GLA含量大概占 总脂肪酸总质量含量的1. 2%，同时含有pLK-rhPHT载体的对照菌株没有该峰的出现；以上 结果表明，来自刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)MAIN6的D6DM基因已经成 功的构建在载体pLK-rhPHM上，然后转入橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)并有效 表达。
全文摘要
本发明涉及一种橘林油脂酵母的应用。橘林油脂酵母的应用，其特征在于橘林油脂酵母应用于作为基因表达的宿主材料。所述的橘林油脂酵母应用于作为基因表达的宿主材料是以橘林油脂酵母为宿主材料，以杂和强启动子和橘林油脂酵母rDNA为元件，构建了系列装载有潮霉素抗性基因、绿色荧光蛋白酶基因和Δ6-脂肪酸去饱和酶基因的酵母表达载体，实现了在橘林油脂酵母中有效的表达外源基因。橘林油脂酵母菌体油脂含量较高，作为以提高油脂产量和积累多不饱和脂肪酸为目的的基因表达的宿主以及一些其他外源基因的表达宿主，可以提高目的产物产量，具有很高的应用价值。
文档编号C12N15/81GK101985632SQ20101002902
公开日2011年3月16日 申请日期2010年1月19日 优先权日2010年1月19日
发明者万霞, 张银波, 江木兰, 王萍 申请人:中国农业科学院油料作物研究所