，72°C延伸5min。
[0127] (4)将纯化的片段SpCYCIt和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶化将 酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨 节青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒 PRACTHo
[01測 妨将纯化的片段SpCYCIt和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶化将 酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨 节青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒 PRXCTHo
[0129] (6)将纯化的片段SpXYLt和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶化将酶 切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨节青 霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRAXTH。
[0130] (7)将纯化的片段SpXYLt和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶 切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨节青 霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRXXTH。 [013U 实施例2 ;阳G/LiAc介导的酿酒酵母转化方法的建立。
[0132] 根据；郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能巧]:[博±学位论文].无 锡；江南大学生物工程学院，2011提供的方法制备Saccharomyces cerevisiae ANGA1作为 宿主菌，采用PEG/LiAc介导转化酵母的方法实施如下：
[0133] 一、Saccharomyces cerevisiae ANGA1 感受态的制备
[0134] (1)将冻存管保藏的Saccharomyces cerevisiae ANGA1接种于YPD培养基，摇瓶 活化培养4她。
[013引 （2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4°C保存。
[0136] (3)于YTO平板中挑取酿酒酵母单菌落，接种于20ml YTO培养基中，于100ml摇瓶 中30°C过夜培养。
[0137] (4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50ml YPD培养基中，于250ml摇瓶中30°C， 20化pm培养，至菌液0D600到1. 2左右。
[0138] 巧）500化pm室温离屯、5min，收集菌体细胞。
[0139] (6)将细胞重新悬浮于500 y 1 0.1mol/L的LiAc中，离屯、，弃上清，获得感受态细 胞。
[0140] 二、线性化重组质粒的制备
[0141] (1)将含有重组表达质粒的E. coli接种于LB培养基，过夜培养。
[0142] (2)收集E. coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质 粒提取试剂盒。
[01创 做采用限制性内切酶Stu I单酶切重组质粒，酶切反应体系巧OyL) ;40yL DM, 5 y L buffer, 1. 5 y L限制性内切酶Stu I，用双蒸水补足50 y L，混匀后置于37°C恒温 箱中酶切化。
[0144] (4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
[0145] S、PEG/LiAc法转化酿酒酵母
[0146] (1)在感受态细胞中顺序加入下列转化混合液；240 y L阳G3350, 36 y L1. Omol/L LiAc，25 y L蛙鱼精DNA，50 y L待转化线性DNA，其中蛙鱼精DNA沸水浴lOmin后立即冰浴；
[0147] (2)剧烈振荡每个反应管直至细胞完全混匀；
[0148] (3)置于30°C温育比；
[0149] (4)置于42°C金属浴热击22min ;
[0巧0] (5)待降至室温后，500化pm离屯、5min，弃上清；
[0151] (6)加入1ml YPD培养基，于30°C后培养化；
[015引 （7) 5000巧m离屯、5min，弃掉800 y 1上清，混匀菌体并涂布潮霉素B (250mg/mL)抗 性平板，30°C培养3-4d，获得转化子。
[0153] 实施例3 ;电穿孔法介导的酵母酿酒酵母转化方法的建立
[0154] 根据；郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能巧]:[博±学位论文].无 锡；江南大学生物工程学院，2011提供的方法制备Saccharomyces cerevisiae ANGA1作为 宿主菌，采用电穿孔法介导转化酵母的实施如下：
[0巧5] -、Saccharomyces cerevisiae ANGA1 电转感受态细胞的制备
[0156] (1)将冻存管保藏的Saccharomyces cerevisiae ANGA1接种于YPD培养基，摇瓶 活化培养4她；
[0157] (2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4°C保存；
[0158] 做于YPD平板中挑取酿酒酵母单菌落，接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶 中30°C过夜培养；
[0159] (4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50ml YTO培养基中，于250ml摇瓶中30°C， 20化pm培养，至菌液0D600到1. 2左右；
[0160] (5)将菌液置于冰上30111血5000巧111，41：离屯、5111血收集菌体细胞；
[01W] (6)加入预冷的20ml双蒸水洗漆菌体2次，50(K)巧m，4°C离屯、5min，收集菌体细 胞；
[016引 （7)加入20ml预冷的1. Omol/L山梨醇洗漆菌体2次，5000巧m，4°C离屯、5min，收 集菌体细胞；
[0163] (8)加入200 y 1预冷的1. Omol/L山梨醇混匀菌体细胞，获得感受态细胞。
[0164] 二、线性化重组质粒的制备
[01化](1)将含有重组表达质粒的E. coli接种于LB培养基，过夜培养。
[0166] (2)收集E. coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质 粒提取试剂盒。
[0167] 做采用限制性内切酶Stu I单酶切重组质粒，酶切反应体系巧0化）；40化 DNA，5 y L buffer, 1. 5 y L限制性内切酶Stu I，用双蒸水补足50 y L，混匀后置于37°C恒温 箱中酶切化。
[0168] (4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
[0169] S、酿酒酵母的电转化
[0170] (1)取100 y 1电转化感受态细胞和10 y 1 DNA混合，加入到0. 2cm电转杯中；
[0171] (2)电转杯冰浴5min，设定条件1500V，电击5s，进行电转化；
[0172] (3)立即向电转杯中加入1ml预冷的l.Omol/L山梨醇，转移至培养箱30°C温育 比；
[0173] (4) 5000巧m 离屯、5min，弃上清；
[0174] 妨加入1ml YPD培养基，混匀菌体细胞，于培养箱30°C后培养化；
[01巧]化)500化pm离屯、5min，弃掉800 y 1上清，混匀菌体并涂布潮霉素B (250mg/mL)抗 性平板，30°C培养3-4d，获得转化子。
[0176] 实施例4 ;PR系列整合型表达载体在表达外源基因方面的应用。
[0177] -、构建绿色巧光蛋白重组表达载体
[017引 （1)根据绿色巧光蛋白的基因序列，设计引物；引物P33下划线部分为Sal I的识 别位点，引物P34下划线部分为Not I的识别位点。
[0179] P15 ；5^ ACGCGTCGACATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCAC 3，
[0180] P16 ;5, ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG 3，
[0181] 似W绿色巧光蛋白基因的DNA为模板，W引物P33和P34进行PCR扩增，获得基 因奸P。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸45s，30个循 环，72°C 延伸 5min。
[0182] (3)将纯化的奸P片段克隆至pMD19-Tsimple载体，转化E. coli JM109感受态细 胞，涂布于LB (100 μg/ml氨节青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双 酶切验证，获得重组质粒pMD-g巧，绿色巧光蛋白基因奸P的CDS序列如图2所示。
[018引 （4)将重组质粒pMD-g巧和PRACTH分别用Sal I和Not I双酶切。奸P片段酶切 纯化后与质粒PRACTH的酶切产物过夜连接，转化E. coli JM109菌株，涂布于LB (100 y g/ml 氨节青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得绿色巧光 蛋白重组表达载体PRACTH-g巧，质粒图谱如图3所示。
[0184] 二、构建酿酒酵母重组菌
[0化5] 将经Stu I线性化的质粒PRACTH-g巧按实施例2或实施例3中所述方法，转化到 Saccharomyces cerevisiae ANGAU根据；郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能 扣]:[博±学位论文].无锡：江南大学生物工程学院，2011提供的方法制备）中，获得转化 子。
[0186] S、转化子筛选与验证
[0187] (1)通过高浓度潮霉素B抗性平板筛选转化子。将绿色巧光蛋白重组表达载体转 化酿酒酵母后获得的转化子转接于更高浓度潮霉