芳香基硫酸酯酶基因、编码蛋白及其固定化的方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程领域，尤其涉及利用駿基功能化磁性纳米颗粒固定化酶法辅助 提取琼脂的方法。
【背景技术】
[0002] 琼脂是一种来源于红藻类植物细胞壁的天然有机多糖胶体，在食品、医药、化工等 领域应用广泛。琼脂是由琼脂糖（agarose )和琼脂胶（agaropectin)构成的混合物，并且W 琼脂糖为主。琼脂糖是由（1-3)-目-D-半乳糖和（1-4)-3, 6-内離-a 半乳糖等组成 的链状聚合物，而琼脂胶的结构比较复杂，其主要结构与琼脂糖相同，只是（1-4)-3，6-内 離-a 半乳糖上的羟基易被硫酸基、甲氧基、丙丽基等基团替代。相关研究表明，对琼脂 进行脱硫酸基团处理可W有效提高琼脂的凝胶强度或生产高凝胶强度的琼脂糖，从而大幅 度提高产品的应用价值。
[0003] 目前，脱除琼脂硫酸基团的主要方法为化学法，由于大量使用强碱进行处理脱除 琼脂中的硫酸基团，需要加入大量的酸中和过量的碱，还要用大量的水漂洗去除盐，存在生 产过程不容易控制、产品得率低、对环境污染大、工艺复杂等不足。相对于化学法，用酶法对 琼脂进行改性具有反应条件温和、底物转化率高、无污染、工艺简便等优点。因此，芳香基硫 酸醋酶辅助提取琼胶将逐渐取代传统的化学等降解方法成为制备琼脂的最佳方法。然而， 目前对芳香基硫酸醋酶作用于琼脂的研究工作还很不充分且存在酶活不高、纯化步骤繁琐 等问题，该制约着利用芳香基硫酸醋酶改性琼脂生产高附加值产品的应用与开发。有鉴于 此，本发明人研究和设计了一种固定化重组芳香基硫酸醋酶的方法及其应用办法，本案由 此产生。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种芳香基硫酸醋酶基因atsA。
[0005] 本发明的第二个目的是提供一种由所述芳香基硫酸醋酶基因atsA编码的重组芳 香基硫酸醋酶。
[0006] 本发明的第H个目的是提供一种所述重组芳香基硫酸醋酶的制备方法。
[0007] 本发明的第四个目的是提供一种駿基功能化磁性纳米颗粒固定化所述游离重组 芳香基硫酸醋酶的方法。
[0008] 本发明的第五个目的是提供一种所述游离重组芳香基硫酸醋酶和固定化重组芳 香基硫酸醋酶在降解琼脂中的硫酸基团的应用。
[0009] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是： 食鹿角菜假交替单胞菌（Ae化carra沪?enorara sp. ASY5),该菌株来 源于中国工业微生物菌种保藏管理中也（CICC)，保藏编号；CICC 23819。
[0010] 一种从食鹿角菜假交替单胞菌CICC 23819中分离得到的芳香基硫酸醋酶基因 atsA，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 一种芳香基硫酸醋酶基因atsA编码的芳香基硫酸醋酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 一种重组芳香基硫酸醋酶的制备方法，包括W下步骤： 步骤一：从食鹿角菜假交替单胞菌（Aew/oay妃rofflmas carra沪?6/7(9rara sp. )ASY5中 克隆芳香基硫酸醋酶基因a tsA ; 步骤二；将所述芳香基硫酸醋酶基因atsA插入祀T-28a(+)载体构建重组质粒； 步骤H ;将所述重组质粒转化到大肠杆菌（公.co7i) BL21值E3)中；挑选阳性克隆在 Luria-Bertani培养基中培养，所述Luria-Bertani培养基含50 y g/mL的卡那霉素，培养 条件为温度37° C，摇床培养至化U=〇. 8时，再加入异丙基硫代-目-D-半乳糖巧（IPTG)至 终浓度为50 mmol/l，在15° C条件下诱导26 h ; 步骤四；离也收集发酵后的公.co7iBL 21值E3)菌体，重息沉淀于溶解缓冲液中利 用超声波破壁裂解；所述溶解缓冲液的配方可为；50mmol/L NaH2P〇4,300mmol/L化Cl，15 mmol/L 咪哇，pH 8. 0 ; 步骤五：将步骤四中裂解后的息浊液于4° C，15000Xg条件下，冷冻离也20 min后， 收集上清液，与Ni-NTA Agarose混匀，进行纯化，即得所述重组芳香基硫酸醋酶。
[0013] 一种重组芳香基硫酸醋酶的固定化方法，包括W下步骤： 步骤一：利用化学共沉淀法制备駿基功能化的磁性纳米粒子；Fe3+和Fe"溶液混合，在 剧烈揽拌条件下快速加入氨水，1分钟后，逐滴加入油酸，70° C下继续快速揽拌，反应结束 后，得到黑色溶胶状物质，用外加磁场将所得的沉淀从反应体系中分离出来，用己醇、离子 水洗涂，然后加入KMn〇4溶液，超声波清洗仪超声振荡，磁分离后用去离子水洗涂得磁流体， 真空冷冻干燥所述磁流体，制得表面修饰有駿基的磁性纳米粒子； 步骤二：固定化重组芳香基硫酸醋酶：取10 mg磁性纳米载体，经超声分散后加入5ml 体积百分比为1. 0%的戊二酵溶液，4。C振荡化后，用50 ml pH 7. 0 Tris-肥1缓冲液冲 洗交联载体；加入30 UL重组芳香基硫酸醋酶液，磁性纳米载体与游离芳香基硫酸醋酶的 比为Img ;0. 7U ;低温固定化，固定化时间化，温度为4°C ;之后用Tris-HCl缓冲液冲洗，真 空冷冻干燥得固定化酶。
[0014] 作为实施例的优选方式，在所述步骤二中，所述游离重组芳香基硫酸醋酶液为大 肠杆菌细胞经过超声波破壁后低温高速离也所得上清液。
[0015] 一种游离重组芳香基硫酸醋酶和固定化重组芳香基硫酸醋酶分别在降解琼脂中 的硫酸基团的应用。
[0016] 本发明采用上述技术方案后，芳香基硫酸醋酶能够在公.CO"中稳定表达，并且纯 化后的酶活力高，克服了现有芳香基硫酸醋酶活力低，酶分离纯化过程繁琐等问题，而重组 表达的芳香基硫酸醋酶对琼胶中的S042-具有很好的降解作用，在琼胶提取生产过程中可 替代或部分替代碱处理，从而减少污染，节约水资源。
【附图说明】
[0017] 图1 ; carrageenorara芳香基硫酸醋酶基因在大肠杆菌中 的表达纯化的SDS-PAGE图；其中，M为蛋白标准Marker, 1泳道为质粒祀T-28a(+)在公. co7i BL21值E3)中的表达(诱导）；2泳道为重组质粒在公.co7iBL21值E3)中的诱导表 达；3泳道为重组质粒在公.CO" BL21值E3)中的表达(未诱导）；4泳道为经Ni-NTA纯化 所得的目的蛋白，分子量为35. 1 kDa; 图2 ;固定化重组芳香基硫酸醋酶操作重复性的考察。
【具体实施方式】
[001引下列实施例中采用的检测方法： 重组芳香基硫酸醋酶活性的测定；反应体系包括80 uL 20 mmol/L对硝基苯硫酸钟 (P-NPS，W 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7. 0)缓冲液配制），20 y L 酶液（浓度为 6 y g/mL)， 在50。C温育10 min后，加入25 uL 1 mol/L化OH终止反应，W预冷蒸觸水补足体积至 1 111以在410 nm下测定吸收值。芳香基硫酸醋酶的活力扣）定义为：在上述条件下，每分 钟催化生成1 ymoL对硝基苯酷（P-N巧所需的酶量。
[0019] 硫酸基含量的测定；〇. 5血酶液与1血0. 2%琼脂溶液在50。C振摇反应1 h， 后离也取0. 9血上清液，再加入0. 2血浓肥1和0. 6血13. 3%氯化顿-2. 67%Tween-80 溶液，混匀，室温静置30 min,在420皿波长处测定吸光值。
[0020] 凝胶强度的测定；配制1. 5%的琼脂溶液，完全溶解后在室温下放置15 h，制备好 的样品放在凝胶强度测定仪的试样座中也位置上，按凝胶强度测定仪说明书进行操作，移 动手柄使摄码添加装置杆下端与凝胶表面接触，加大力度使凝胶的表面发生破裂(端点进 入凝胶约4mm W上)，记录此时凝胶强度值。
[0021] 实施例1;芳香基硫酸醋酶基因的扩增与克隆 芳香基硫酸醋酶基因的正向引物序列为：5' -CGCGGATCCCAAAAAATTAGTATTAT-3 '（下划 线为公a紐I识别序列），反向引物序列为：5' -CCCAAGCTTGCGTTTTAGTTCGTAAC-3' (下划 线为