作为同 源重组位点。引物序列如下；引物PI下划线部分为EcoR I的识别位点，引物P2下划线部 分由5'到3'端分别为Bgl II、BamH I和化n I的识别位点。
[0093] P1 ;5' GCCGGAATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTC3^
[0094] P2 ;5, ATATTAGGGGTACCCGGGATCCGAAGATCTGTTGMGAGCAATAAT3'
[0095] (2)过夜培养Spathaspora passalidarum,收集细胞，分离、提取基因组DNA。
[0096] (3) W Spathaspora passalidarum 基因组 DNA 为模板，W引物 P1 和 P2 进行 PCR 扩增。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸1.5min，30个 循环，72°C延伸5min。纯化回收PCR扩增产物后克隆至pMD19-Tsimple载体，获得重组质粒 pMD-18s rDNA。
[0097] 二、重组质粒PR-hph的构建
[009引 Q)根据质粒 pRSBOSH^axis C, Knop M. System of centromeric,邱isomal, and integrative vectors based on drug resistance markers for Saccharomyces cerevisiae. BioTechniques, 2006, 40(1) :73-78.)中潮霉素抗性基因表达盒序列，设计两 条引物：引物P3下划线部分由5'到3'端分别为BamH I和Pst I的识别位点，引物P4下 划线部分为化n I的识别位点。
[00巧]P3 ;5, CGGGATCCAAACTGCAGATGGGTAAAAAGCCTGMCTCAC3'
[0100] P4 ; 5' GGGGTACCAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCG3'
[0101] (2) WpRS303H质粒DNA为模板，W引物P3和P4进行PCR扩增，获得PCR产物。扩 增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸1. 5min，30个循环，72°C 延伸5min。
[0102] (3)将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-18s rDNA分别用BamH I和化n I双酶切， 将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞（购自北京全式金公司）， 涂布于LB (100 y g/ml氨节青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和化n I双酶 切验证，获得重组质粒PR-hph，潮霉素B抗性基因hph的CDS序列如图1所示。
[0103] S、重组质粒PRTH的构建
[0104] (1)根据 Spathaspora passalidarum 全基因组序列（GenBank accession NZ_ AEIKOOOOOOOO)和在线数据库EMBL-EBI化ttp://www. ebi. ac.址/)提供的序列信息，获得 Spathaspora passalidarum转录起始因子和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。 根据启动子软件化ttp ;//www. sof忧errv. com 和 ht1:p://www. cbs.化U.化/services/)对 上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计两条引物，调取Spathaspora passalidarum转录起始因子上游700bp左右作为启动子SpTEFlp;引物P5下划线部分为 BamH I的识别位点，引物P6下划线部分为Pst I的识别位点。
[0105] P5 ;5, CGGGATCCACCACTTACATAATAGAAAGAC 3，
[0106] P6 :5> ACGAGCCTGCAGTTTTGATTGATTGATTG 3'
[0107] 似 W Spathaspora passalidarum 基因组 DNA 为模板，W引物 P5 和 P6 进行 PCR 扩增，获得PCR产物。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 50s，30 个循环，72°C延伸 5min。
[0108] (3)将纯化的PCR产物和重组质粒PR-h地分别用BamH I和Pst I双酶切，将酶切 产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨节青霉 素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Pst I双酶切验证，获得重组质粒PRTH。
[0109] 四、重组质粒PRATH和PRXTH的构建
[0110] (1)根据 Spathaspora passalidarum 全基因组序列（GenBank accession NZ_ AEIKOOOOOOOO)和在线数据库EMBL-EBI化ttp://www. ebi. ac.址/)提供的序列信息，获得 Spathaspora passalidarum己醇脱氨酶与木糖还原酶分别和上一个基因开放阅读框之间 的所有DNA序列。根据启动子软件化ttp ;//www. sof忧errv. com和ht1:p://www. cbs.化U. dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计引物，调取 Spathaspora passalidarum己醇脱氨酶和木糖还原酶开放阅读框上游lOOObp左右作为启 动子，即SpADHp和SpXYL P;引物P7和P9下划线部分为Bgl II的识别位点，引物P8和P10 下划线部分由5'到3'端分别为BamH I和Sal I的识别位点。
[0111] P7 ; 5' GCCGGAAGATCTGTAAATTAATGCTACATCAGTTGAGG 3 '
[011 引 P8 ; 5' CGGGATCCACGCGTCGACTATATTTTATTTAGGAATT 3 '
[0113] P9 ; 5' GCCGGAAGATCTGTGACATAGTTAACTATGGC 3，
[0114] PIO ;5' CGGGATCCACGCGTCGACTTTATTGTATTGTG 3'
[0115] (2) WSpathaspora passalidarum 基因组 DM 为模板，W引物 P7 和 P8 进行 PCR 扩增，获得片段SpADHp。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延 伸Imin，30个循环，72°C延伸5min。
[0116] (3) W Spathaspora passalidarum 基因组 DM 为模板，W引物 P9 和 PIO 进行 PCR 扩增，获得片段SpXYLp。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，59°C退火30s，72°C延 伸Imin，30个循环，72°C延伸5min。
[0117] (4)将纯化的片段SpADHp和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶化将 酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨节 青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和Ba恤I双酶切验证，凝胶电泳后显示 lOOObp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PRATH。
[011引 妨将纯化的片段SpXYLp和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶化将 酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨节 青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和Ba恤I双酶切验证，凝胶电泳后显示 lOOObp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PRXTH。
[0119] 五JR系列整合型表达载体的构建
[0120] (1)根据 Spathaspora passalidarum 全基因组序列（GenBank accession NZ_ AEIKOOOOOOOO)和在线数据库EMBL-EBI化ttp://www. ebi. ac.址/)提供的序列信息，获得 Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游序列。设计引物调 取Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游300bp左右作为 转录终止子，即SpCYCIt和SpXYL T;引物P11和P13下划线部分由5'到3'端分别为Sal I 和Not I的识别位点，引物P12和P14下划线部分为BamH I的识别位点。
[0121] Pll;5' ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGCTAACTTCAATTAGAAT3'
[01。] P12 ;5' CGGGATCCCATCACTATAAGCGAAATCGGGTTTC 3'
[0123] P13;5' ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGTTTGATTCTAGTTTATAT3'
[0124] P14 ;5, GCGCGGATCCATAGTTAACTATGTCACTTGAACTC 3，
[0125] 似 W Spathaspora passalidarum基因组 DNA 为模板，W引物 P11 和 P12 进行 PCR 扩增，获得片段SpCYCIt。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，63°C退火30s，72°C 延伸30s，30个循环，72°C延伸5min。
[0126] (3) ^Spathaspora passalidarum 基因组 DNA 为模板，W 引物P13 和 P14 进行 PCR 扩增，获得片段SpXYLt。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，ere退火30s，72°C延 伸30s，30个循环