达效率较在常压下浸染、直接在固体培养基上培养3d的浸染效率 提高863. 6%~908. 9%，经显著性检验，二种方法间差异极显著。
[0029] 在采用浸染时置于真空干燥器中和含湿润液体分化诱导培养基共培养6d的方 法，GUS瞬时表达率均在40% W上。
[0030] 本发明具有W下优点：
[003U 1、浸染时所使用的设备和材料简单，采用在0.0 SMI^a真空下浸染、经液体诱导分 化培养基湿润的滤纸进行共培养，共培养时间可延长至6~7山较目前常用的固体诱导分 化培养基共培养方法多3~4d，GUS瞬时表达率提高863. 6%~908. 9%，也提高获得转基 因植株的可能性，为通过转基因方法对团花进行遗传改良奠定基础；
[0032] 2、本发明提出的技术方案具有简便易行、可操作性和重现性好的特点。
【具体实施方式】
[0033] W下结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0034] 实施例1
[0035] 本发明所述的提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法的一个实例，包括如下步 骤：
[0036] 1、材料选择；
[0037] 双元表达载体地I 121、农杆菌巧8,已灭菌带滤纸的培养皿，外植体为20~25d 苗龄团花种子无菌苗下胚轴和带柄子叶。
[0038] 2、园浓制备；
[0039] 将携带GUS基因的表达载体地I 121通过化Cl2法导入农杆菌巧8中。待菌液 PCR鉴定正确无误后，挑取农杆菌转化子的单菌落，在质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素、 50mg/L利福平和25mg/L链霉素的液体LB培养基2mL中于28°C振荡培养过夜。第2天吸 取50 y L菌液转接入100血Y邸液体培养基，于22°C、130r/min振荡培养至菌液ODe。。值 为0. 8,然后于5000r/min离屯、lOmin收集菌体，再用200血DCR液体培养基重悬，于28°C、 13化/min振荡培养，至菌液ODe。。值为0. 8~1. 0,此时的液体即为带有表达载体地I 121的 农杆菌C58遗传转化浸染液。
[0040] 3、外植体浸染；
[0041] 在超净工作台上，切取团花无菌苗的下胚轴子叶，迅速转移到摇好的农杆菌巧8 遗传转化浸染液中，置于0. 〇5Mpa的真空干燥器内放置5min。
[0042] 4、共培养；
[0043] 将浸染的外植体取出，吸干表面的农杆菌液，转移到经液体诱导分化培养基 DCR+2. Omg/L TDZ+0. 05mg/L NAA+20g/L庶糖的湿润滤纸培养皿中，于22°C的黑暗环境下进 行共培养，每天观察农杆菌斑在外植体周围生长情况。
[0044] 5、GUS染色检测；
[0045] 共培养时间满6d时，开始看到外植体周围有少量脈状菌斑出现，但外植体均 无黄化现象，此时，用无菌水洗净外植体表面菌株，转移到固体分化培养基DCR+2. Omg/L TDZ+0. 05mg/L NAA+20g/L庶糖巧.6g/L琼脂中培养；7d后经GUS染色检测，检测到GUS的瞬 时表达率为45. 4± 1. 63% ;而采用在常压下浸染、直接在固体分培养基上共培养的方法，当 共培养时间满2d时，外植体周围的农杆菌斑明显，少量外植体已黄化死亡，此时，用无菌水 洗净表面菌株和培养基，转移到固体分化培养基培养，7d后利用GUS染色检测，检测到GUS 的瞬时表达率为4. 5 + 1. 23%;前者较后者的瞬时表达率提高908. 9%，经显著性检验，二者 差异极显著，试验结果见表1。
[0046] 表1C58菌株不同浸染和共培养方法对瞬时表达率的影响
[0047]
【主权项】
1. 一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 材料选择 选择20~25d的无菌团花幼苗，切取胚轴和带柄子叶为外植体； 选择带⑶S基因的植物表达载体pBI 121，通过CaCl2法导入农杆菌C58或LBA4404,获 得菌液C或菌液L，菌液C为带植物表达载体pBI 121的农杆菌C58菌液，菌液L为带植物表 达载体PBI121的农杆菌LBA4404菌液； (2) 菌液制备 吸取50 μ L的菌液C或菌液L，转移到质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素、50mg/L利福 平和25mg/L链霉素的IOOmL YEB液体培养基中，于22°C、130r/min振荡培养至菌液OD6J直 为0. 8,然后于5000r/min离心10min收集菌体，再用200mL DCR液体培养基重悬，于28°C、 130r/min振荡培养，至菌液0D_值为0. 8~1. 0,此时带菌液C或菌液L的DCR液体即为 遗传转化浸染液； 所述YEB培养基成分为：5. Og/L牛肉浸膏，1.0 g/L酵母粉，5. Og/L蛋白胨，5. Og/L蔗 糖，0· 04g/L MgSO4 · 7H20, pH 值为 7. 0 ; 所述DCR培养基成分为：P. K. Gupta和D. J. Durzan于1985年公开发表的DCR配方； (3) 外植体浸染 将切取的外植体浸入到装有步骤（2)遗传转化浸染液的三角瓶中，轻轻摇动让外植体 完全浸泡在浸染液中，密封好三角瓶口，在0. 〇5Mpa的真空干燥器内放置5min ; (4) 外植体共培养 将步骤（3)中浸染后的外植体从遗传转化浸染液中取出，吸干外植体表面的农杆菌， 然后转移到含液体分化诱导培养基的湿润滤纸上共培养；在22°C的黑暗条件下共培养6d ; 所述液体分化诱导培养基为DCR+2. Omg/L TDZ+(X 05mg/L NAA+20g/L蔗糖，pH 5. 2~ 5. 4 ； (5) 阳性筛选 将共培养后的外植体转移到质量体积浓度比为12mg/L卡那霉素和100mg/L头孢霉素 的固体分化诱导培养基中培养，在25±2°C、光周期为10h/d的条件下培养7d ; 所述固体分化诱导培养基为DCR+2. 0mg/L TDZ+0. 05mg/L NAA+20g/L蔗糖+5. 5g/L琼 脂，ρΗ5· 8 ~6· 2 ; (6) 瞬时表达检测 用灭菌的超纯水，将共培养7d后的外植体表面清净干净，浸没于GUS染色液中，于37°C 的恒温箱中温育12h，然后转入体积浓度比为70%的乙醇溶液中脱色2~3次，每次10min， 最后保存于体积浓度比为70%的乙醇溶液中； 所述⑶S 染色液成分为：每 1000 mL 溶液含 15. 601g NaH2P04, 3. 7224g Na2EDTA, 211. 2mg K4 [Fe (CN) 6] · 3H20, 164. 7mg KjFe(CN)6], ImL Triton · X-100, 0· 5g X-Gluc ;染色液的 pH 7. 0〇
2. 根据权利要求1所述的提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，其特征在于：所述 X-Gluc在使用前用二甲基亚砜（DMSO)溶解。
【专利摘要】一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，包括材料选择、菌液制备、外植体浸染、共培养、阳性筛选、瞬时表达检测6个步骤。采用本发明能够将团花遗传转化瞬时表达效率提高863.6～908.9％，有效解决通过农杆菌介导方法浸染效率低、较难获得团花转基因植株的问题，有效降低农杆菌斑的生长，延长农杆菌与外植体共培养的时间而基本不伤害外植体，提高转基因的瞬时表达率。
【IPC分类】C12N15-84, C12N15-56
【公开号】CN104630261
【申请号】CN201510089674
【发明人】黄浩, 白隆华, 翟勇进
【申请人】广西壮族自治区药用植物园
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月27日